陳二龍，蘇家恩，范志勇，王德勛，戶艷霞，王新中，孫軍偉，宋朝鵬*

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烘烤過程中霉變煙葉主脈超微結(jié)構(gòu)的變化

陳二龍1，蘇家恩2，范志勇2，王德勛2，戶艷霞2，王新中2，孫軍偉2，宋朝鵬1*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，河南 鄭州 450002；2.云南省煙草公司大理州公司，云南 大理 671000)

以云煙85的適熟中部葉(第9~11位葉)為材料，每隔4 h觀察氣流上升式四層密集烤房的頂層(第4層)煙葉在烘烤過程中的霉變狀況，至相鄰2次霉變煙葉數(shù)無增加(60 h)，停止觀察；每隔12 h用掃描電鏡隨機觀察霉變煙葉主脈端口和表皮的超微結(jié)構(gòu)，至60 h時終止。結(jié)果表明，在烘烤過程中的22.3 h左右，頂層煙葉開始發(fā)生霉變，于43.47 h左右暴發(fā)，其霉變率為29.2%，至56.7 h左右終止，霉變率達58.2%，經(jīng)擬合，煙葉霉變率曲線符合“S”型曲線； 0~12 h煙葉主脈端口破損，且有部分晶體產(chǎn)生，12~24 h晶體裂解，且出現(xiàn)菌絲，48~60 h時，霉菌迅速生長繁殖，表皮霉菌生長量最大；0~12 h，煙葉主脈表皮細胞的寬度緩慢收縮，且有微量的霉菌孢子萌發(fā)，在12 h之后快速收縮，12~24 h出現(xiàn)菌絲，霉菌快速生長繁殖期處于48~60 h，60 h表皮腺毛干癟。煙葉霉變的發(fā)生時間處變黃中期和末期，防控烘烤過程中煙葉霉變的最佳時間應在22.3 h之前。

烘烤；霉變；煙葉主脈；超微結(jié)構(gòu)

烤煙霉變分為兩類：一類是烘烤過程中煙葉霉變[1]；另一類是烤后儲存期間煙葉霉變[2]?？局忻棺冎饕l(fā)生在煙葉主脈端口處，即葉柄發(fā)霉[3]，研究烘烤過程中煙葉霉變規(guī)律及其主脈的超微結(jié)構(gòu)變化，對防控烘烤過程中煙葉霉變有著重要作用。

曾婷英等[1]研究表明，在烘烤過程中，煙葉霉變的發(fā)生具有明顯的階段劃分，變黃前期煙葉開始出現(xiàn)霉變，變黃中期煙葉霉變速度較快，變黃后期霉變速度減緩。王濤[4]提出，煙葉霉變率與煙葉在烤房內(nèi)空間分布有關，低溫層煙葉的霉變率大于高溫層(氣流上升式烤房的低溫層為頂層)。王永棟[5]研究表明，掛桿煙葉的霉變位置主要為葉柄處，而葉片較少霉變。景炳年等[6]通過觀察煙葉超微結(jié)構(gòu)(細胞結(jié)構(gòu)破損程度)研究抑制劑VFB對花葉病的影響，指出該抑制劑對花葉病的抑制具有較好的作用。劉華山等[7]采用電鏡觀察部分植物中的提取液對煙草花葉病的病毒顆粒的破壞程度，證實提取液可減緩花葉病的危害。商文靜等[8]通過電鏡檢測感染花葉病的煙葉組織的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)煙葉篩管中含有大量晶體，且細胞間隙中均有未知的致密性物質(zhì)。

筆者以云煙85為試驗材料，自烘烤始，觀察烤中煙葉霉變狀態(tài)，采用FEI Quanta 200掃描電鏡觀察霉變煙葉主脈端口和表皮的超微結(jié)構(gòu)，研究霉菌在煙葉主脈上的生長狀態(tài)，以及煙葉霉變前期、中期和后期主脈組織結(jié)構(gòu)的變化，以期為防控烘烤過程中煙葉霉變提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

烤煙品種為云煙85。

1.2　方法

試驗于2016年7—9月在云南省大理州大理縣鳳儀鎮(zhèn)江西村進行。

采收葉面積差異小、葉色較為均一的適熟中部葉(第9~11位)，并進行掛牌標記。將試驗煙葉裝于氣流上升式四層密集烤房的頂層(第4層)，三段式烘烤工藝進行烘烤。采用攝像頭觀察煙葉霉變狀態(tài)，在開烤時對煙葉主脈進行第1次取像，以后每隔4 h對烘烤過程中煙葉進行圖像采集，當相鄰2次感染霉菌的煙葉數(shù)無增加，終止取像。將采集的圖像信息于電腦中讀取，以視野范圍內(nèi)煙葉數(shù)為總煙葉數(shù)，以主脈端口處具有白色或灰白色毛絨狀的煙葉數(shù)為霉變煙葉數(shù)。煙葉霉變率=(霉變煙葉數(shù)/總煙葉數(shù))×100%[9]。

自烘烤開始，取烘烤過程中12、24、36、48和60 h的霉變煙葉，進一步取煙葉主脈端口1 mm厚的截面和端口處5 mm×2 mm×1 mm的表皮作為樣品，參照文獻[10–12]方法，對樣品進一步處理，用于FEI Quanta 200掃描電鏡觀察。

運用Excel 2010匯總數(shù)據(jù)；采用Sigmaplot 12.5分析數(shù)據(jù)并繪圖；利用Matlab 2014b獲取非線性回歸方程。

2　結(jié)果與分析

2.1　烘烤過程中煙葉霉變發(fā)生進程

在烘烤過程中，第4層煙葉于烤中22.3 h左右開始發(fā)生霉變，之后霉變煙葉逐漸增加，在烤中40~ 44 h的霉變增長最快，即該時間段存在霉變暴發(fā)點，到烤后56.7 h左右終止，雖然烘烤仍在進行，但煙葉霉變率保持不變，則此時霉變率與60 h的值接近，即霉變率達到58.2%。煙葉在烘烤過程中的霉變率曲線與“S”型曲線(延滯期、指數(shù)期和穩(wěn)定期)[13]相似，利用Logistic方程回歸，=0.583 2/ (1+exp(–0.238 2(–43.47)))，2為0.997 7。在烘烤過程中，煙葉發(fā)生霉變的暴發(fā)時間(拐點)為43.47 h，其霉變率為29.2%。

觀察時間/h

2.2　烘烤過程中霉變煙葉主脈超微結(jié)構(gòu)的變化

2.2.1主脈端口超微結(jié)構(gòu)的變化

圖2–1顯示，鮮煙葉主脈端口細胞輪廓清晰，結(jié)構(gòu)較為完整；烤中12 h，煙葉主脈端口未發(fā)生霉變，但細胞輪廓模糊，破損較為嚴重，具有較多的塊狀異物，甚至充滿整個細胞腔(圖2–2)；烤中24 h，部分煙葉主脈端口輕微霉變和腐爛，其細胞結(jié)構(gòu)的破損程度和表面異物進一步增加，表層產(chǎn)生部分白色的霉菌菌絲(圖2–3)；烤中48 h，霉變煙葉數(shù)增加，霉變程度和腐爛程度加劇，菌絲覆蓋于煙葉主脈端口的范圍增加，且穿梭于異物之間(圖2–4)；烤中60 h，煙葉霉變終止，霉變和腐爛極為嚴重，菌絲顏色由白色轉(zhuǎn)變?yōu)榛疑咕z將煙葉主脈端口的細胞結(jié)構(gòu)和異物完全覆蓋(圖2–5)。霉菌主要生長在煙葉主脈端口的表皮，其次是皮層，再次是中柱(圖2–6)，表明霉變煙葉主脈端口細胞的破損與霉菌的生長繁殖有關，烘烤48~60 h，霉菌迅速生長繁殖。

圖2　霉變煙葉主脈端口的超微結(jié)構(gòu)

2.2.2主脈表皮超微結(jié)構(gòu)的變化

烤前煙葉主脈表皮相對潔凈(除腺毛)，氣孔微張，其內(nèi)部無明顯異物，細胞寬為34.43 mm左右(圖3–1)；烤中12 h，煙葉主脈表皮未呈現(xiàn)出肉眼可見的霉變，但具有輕微變褐的現(xiàn)象，表皮面含有少量的粉末狀物質(zhì)，且部分氣孔被填充，表皮細胞間隙具有微量的霉菌孢子萌發(fā)(芽管)，細胞輕微橫向收縮，寬為33.38 mm左右(圖3–2)；烤中24 h，肉眼可見煙葉主脈表皮發(fā)生霉變，霉菌菌絲明顯增加，且腺毛周圍的菌絲生長旺盛，主脈表皮細胞橫向收縮較為明顯，細胞寬為25.26 mm左右(圖3–3)；烤中48 h，霉菌繼續(xù)生長繁殖，且菌絲與腺毛相互纏繞，表皮細胞持續(xù)橫向收縮，細胞寬徑約為19.25 mm，胞間隙增加，部分細胞間具有明顯的縫隙，但表皮細胞輪廓模糊(圖3–4)；烤中60 h，霉變煙葉數(shù)無增加，霉菌菌絲完全覆蓋于煙葉主脈表皮細胞(除部分腺毛外，圖3–5)，煙葉主脈表皮上腺毛干癟(圖3–6)。綜上，烘烤過程中，主脈表皮細胞上的霉菌逐漸增加，且表皮細胞上霉菌萌發(fā)時間較早，霉菌的旺長期處于48~60 h；表皮細胞的橫向收縮在12 h之后加快，在48 h收縮率達44.08%左右。

1　烤前煙葉；2　烤中12 h，紅色標記為芽管；3　烤中24 h；4　烤中48 h，藍色標記為細胞縫隙；5　烤中60 h；6　烤中60 h 腺毛。

3　結(jié)論與討論

有研究表明，煙葉霉變的發(fā)生具有一定規(guī)律[4]，在烘烤過程中，煙葉霉變發(fā)生呈現(xiàn)先緩慢、后急促、再緩慢增加的趨勢，以變黃中期的霉變速度最快[1]。本研究結(jié)果表明，氣流上升式四層密集烤房的頂層煙葉霉變于22.3 h開始，43.47 h(29.2%)暴發(fā)，56.7 h(58.2%)終止，煙葉主脈端口的截面和表皮被霉菌快速侵染發(fā)生在48~60 h，即霉菌快速生長繁殖處于變黃中后期，因此，防控煙葉霉變的最佳時間應為22.3 h之前，于43.47 h之后采取措施則難以達到防控效果。煙葉在霉變之前，其表層發(fā)生褐變，引發(fā)煙葉褐變的其中一個條件是組織破損[14]，而組織破損易引發(fā)霉變發(fā)生[15]，在烘烤過程中煙葉主脈組織結(jié)構(gòu)的損傷，為霉菌的入侵創(chuàng)造了條件，霉菌的生長繁殖加速了煙葉主脈組織結(jié)構(gòu)的破損和內(nèi)含物的損失。前人研究表明，病原微生物誘發(fā)植物組織分泌晶體狀物質(zhì)，使植物組織離子平衡、病蟲害防御和解毒等[16–18]。本研究結(jié)果表明，在微生物入侵之前，煙葉主脈端口截面組織分泌大量晶體，可能是烘烤過程中的逆境條件導致了晶體的產(chǎn)生。煙葉主脈表皮細胞在12 h之后的細胞快速收縮，且在48 h已收縮44.08%，這一研究結(jié)論與王亞輝等[19]研究結(jié)果存在差異，即12 h之后的收縮較快，且收縮程度較大，其原因可能是因為霉菌入侵煙葉主脈，獲取細胞的營養(yǎng)物質(zhì)，加速了細胞的橫向收縮。

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責任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅維

Changes of ultrastructure of midrib in mildew tobacco leaves during flue curing

CHEN Erlong1, SU Jiaen2, FAN Zhiyong2, WANG Dexun2, HU Yanxia2, WANG Xinzhong2, SUN Junwei2, SONG Zhaopeng1*

(1.College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2.Dali Branch of Yunnan Province Tobacco Company, Dali, Yunnan 671000, China)

The suitable middle leaves (No. 9–11) of Yunyan85 were used as experimental materials, and the tobacco leaves located on the top layer of the four–layer air rising type curing–barn were observed for mildew every 4 h by camera, when the number of mildew leaves in two successive observations was not amplified (60 h), the observation was stopped. The ultrastructure of the midrib and epidermis of the tobacco leaves were observed every 12 h by scanning electron microscopy, at 60 h, the test was terminated. The results showed that during the curing process, tobacco leaves began to mildew at about 22.3 h, the mildew outbroke at about 43.47 h, the mildew rate was 29.2%, and tobacco leaves stopped mildew around 56.7 h with mildew rate 58.2%. After calculation, the mildew rate curve conforms to the “S” type curve; at 0–12 h, the midrib of the tobacco leaves were damaged and some crystals were produced, in 12–24 h, crystals were cleaved and hyphae appeared, at 48–60 h, rapid growth and reproduction of mildew was happened and the amount of epidermal mildew was the largest; in 0–12 h, the width of the epidermal cells in the midrib of the tobacco leaves contracted slowly with a slight amount of mildew spore germination, rapid contraction occurred after 12 h, hyphae appeared in 12–24 h. mildew rapid growth and reproduction period occurred between 48–60 h, at 60 h, the glandular hairs on the epidermis were shrivelled. The occurrence time of tobacco mildew is in the middle and late yellowing period, the best time to control tobacco mildew is before 22.3 h.

flue curing; mildew; tobacco midrib; ultrastructure

S572.01

A

1007-1032(2017)06-0626-04

2017–06–02

2017–09–19

中國煙草總公司云南省公司項目(2016YN10)

陳二龍(1992—)，男，河南商丘人，碩士研究生，主要從事煙草調(diào)制加工研究，celyctz@163.com；

通信作者，宋朝鵬，博士，副教授，主要從事煙草調(diào)制與加工研究，ycszp@163.com

投稿網(wǎng)址：http://xb.hunau.edu.cn