郭 勤，苗瑾超，張宏舉，王 慧，高 蕾

（新疆大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院阿克蘇校區(qū)，新疆阿克蘇 843000）

江西某鈾礦堆浸尾渣微生物群落演替研究

郭 勤，苗瑾超，張宏舉，王 慧，高 蕾

（新疆大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院阿克蘇校區(qū)，新疆阿克蘇 843000）

應(yīng)用16SrDNA基因文庫(kù)技術(shù)研究了江西某鈾礦堆浸尾渣冬季到次年夏季微生物群落演替情況。結(jié)果表面：冬季Acidimicrobium ferrooxidans占48.5%，Leptospirillum ferriphilum占17.5%，Xanthomonas albilineans占11.3%，Mycobacterium sp占7.2%，其它異養(yǎng)菌占15.5%。夏季Leptospirillum ferriphilum占87.40%，Nitrobacter winogradskyi占1%，其它異養(yǎng)菌占11.6%，Acidimicrobium ferrooxidans未檢出。

生物冶金；16SrDNA基因文庫(kù)；微生物群落結(jié)構(gòu)；鈾礦

微生物應(yīng)用于冶金工藝能顯著降低能耗，減少投資，縮短工藝流程，降低環(huán)境污染。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外微生物冶金技術(shù)應(yīng)用于低品位和難處理鈾礦石的浸出取得了良好的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益，這使得微生物浸鈾技術(shù)［1］成為世界許多國(guó)家鈾礦資源提取和鈾生產(chǎn)的支撐性術(shù)。用于鈾礦生物浸出的微生物主要包含氧化亞鐵硫桿菌、氧化硫硫桿菌、鐵氧化鉤端螺旋菌以及嗜酸性硫桿菌等化能自養(yǎng)菌，還包括一些異養(yǎng)菌，真菌、酵母菌甚至藻類(lèi)，多種微生物協(xié)同作用促進(jìn)浸礦反應(yīng)的進(jìn)行，構(gòu)成一個(gè)完整的微生態(tài)系統(tǒng)［2］。分析浸鈾過(guò)程中礦石表面附著微生物的群落結(jié)構(gòu)，可以了解不同微生物在浸鈾過(guò)程中發(fā)揮的作用，能夠推測(cè)浸鈾過(guò)程中不同微生物之間的種間關(guān)系。浸鈾不同階段和不同的調(diào)控工藝會(huì)影響微生物群落結(jié)構(gòu)。通過(guò)分析浸鈾過(guò)程中各階段的微生物群落結(jié)構(gòu)，可以找出最有利于浸鈾的群落分布，確定最佳的調(diào)控工藝。

自然界中99%的微生物都不能在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)［3］，傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)不能反映礦石樣品中微生物的豐度。微生物冶金工藝中大量1環(huán)境微生物的不可培養(yǎng)導(dǎo)致傳統(tǒng)微生物生態(tài)學(xué)在揭示生物冶金工藝中微生物群落結(jié)構(gòu)、生態(tài)功能及其相互關(guān)系的研究存在巨大障礙［4］。近年來(lái)由于分子生物學(xué)的理論和技術(shù)應(yīng)用于環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)中的研究逐步深入，環(huán)境微生物和冶金微生物多樣性的研究有了突破性進(jìn)展，微生物實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用使得其檢測(cè)結(jié)果更加真實(shí)，大量以前未知的微生物新物種及其新基因得到鑒定和應(yīng)用。隨著16SrDNA序列分析技術(shù)作為微生物分類(lèi)系統(tǒng)的主要方法和依據(jù)也得到了業(yè)內(nèi)的認(rèn)同［5］。近年來(lái)微生物核糖體DNA數(shù)據(jù)庫(kù)的日益完善，16SrDNA基因測(cè)序技術(shù)成為細(xì)菌分類(lèi)和物種分析鑒定的一個(gè)有效工具。16SrDNA基因序列分析、核酸指紋圖譜分析以及建立16SrDNA基因克隆文庫(kù)等分子生物學(xué)技術(shù)也為微生物物種多樣性和物種功能基因組的研究提供了嶄新思路。經(jīng)過(guò)近幾年的發(fā)展，16SrDNA技術(shù)已經(jīng)日趨成熟，其研究方法更加完善，結(jié)果更加精確［6］。

江西某鈾礦5 000 t級(jí)微生物堆浸工業(yè)化生產(chǎn)中經(jīng)過(guò)酸化、浸出、洗堆三個(gè)步驟后，鈾礦品位從1.76‰降低至0.1‰左右，浸出率達(dá)到90%以上。浸出尾期礦堆采用表面覆蓋薄膜的辦法繼續(xù)放置，讓微生物進(jìn)一步作用于礦堆，達(dá)到提高浸出率、減少環(huán)境污染的目的。采用16SrDNA技術(shù)，通過(guò)構(gòu)建重組基因文庫(kù)，分析礦石表面吸附的細(xì)菌群落和組成，研究該堆浸尾渣從冬春季節(jié)放置6個(gè)月到次年夏季微生物種群的演替和變化規(guī)律，為研究浸鈾微生物群落結(jié)構(gòu)變化的影響因素提供參考。

1 試驗(yàn)方法

1.1 樣品來(lái)源

江西某鈾礦微生物堆浸浸出工業(yè)化試驗(yàn)尾期，尾渣礦堆中心，距表面40～50 cm深度的礦石樣品，礦石表面濕潤(rùn)，呈現(xiàn)顆粒狀，灰白色。第一次取樣時(shí)間為2015年12月23日，第二次取樣為2016年7月11日。

1.2 礦石表面吸附菌體收集及預(yù)處理

將25 g礦石樣品放入50 mL無(wú)菌離心管中，加入25 mL pH為1.8的無(wú)菌水，通過(guò)漩渦振蕩器（AVS－100）1 500 r／min反復(fù)多次震蕩，將菌體從礦石表面洗脫。采用GL－21M高速冷凍離心機(jī)2 000 r／min離心 5 min，沉淀細(xì)沙和稀泥；采用 13 000 r／min離心20min沉淀菌體，用pH為8.0的TE緩沖溶液洗滌3次，獲得白色透明的菌體。

1.3 細(xì)菌全基因組的提取及16SrDNA基因擴(kuò)增

采用TaKaRa Fast DNA spin kit for soil試劑盒提取總DNA（具體操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)）。采用1%瓊脂糖凝膠電泳，90 V電壓，電泳30 min檢測(cè)全基因組的提取質(zhì)量。

16SrDNA是細(xì)菌的系統(tǒng)分類(lèi)研究中最有用的和最常用的分子鐘，其種類(lèi)少，含量大（約占細(xì)菌RNA含量的80%），分子大小適中，存在于所有的生物中，其進(jìn)化具有良好的時(shí)鐘性質(zhì)，在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度的保守性，素有“細(xì)菌化石”之稱(chēng)。16SrDNA由于大小適中，約1.5 Kb左右，既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，又能利用測(cè)序技術(shù)較容易地得到其序列，故被細(xì)菌學(xué)家和分類(lèi)學(xué)家接受。采用1387R和27F引物對(duì)和EXtap DNA聚合酶對(duì)細(xì)菌全基因組16S核糖體RNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系見(jiàn)表1。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓90 V，電泳30 min左右檢測(cè)。

表1 樣品基因組16SrDNA擴(kuò)增反應(yīng)體系

反應(yīng)程序：（1）94℃預(yù)熱處理 5 min；（2）94℃變性40 s；（3）47℃退火30 s；（4）72℃延伸90 s；從（2～4），進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；（5）72℃充分延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳，TAE緩沖體系，電壓90 V，電泳30 min左右。

1.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的純化回收

擴(kuò)增產(chǎn)物中除了含有目的基因以外，還含有大量的酶、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，需進(jìn)一步純化后才能進(jìn)行克隆文庫(kù)的構(gòu)建。通過(guò)電泳切膠回收工藝能對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行有效回收：采用2%的瓊脂糖凝膠電泳20～30 min分離DNA片段；在360 nm的紫外波長(zhǎng)下，盡可能快地把所需的DNA片段切下來(lái)，之后采用TaKaraDNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化?；厥债a(chǎn)物采用在1.5%的瓊脂糖凝膠，90 V電壓電泳20 min，檢測(cè)回收效果。

1.5 重組克隆文庫(kù)的構(gòu)建

取1μL P－easy－T3連接體系，加入4μL回收PCR產(chǎn)物，在25℃溫浴15min。采用translation1感受態(tài)細(xì)胞，42℃，熱激65 s，獲得重組克隆子。重組細(xì)胞均勻涂布于終濃度為100μg／mL AMP（氨芐青霉素）、40μL 2%X－gal和7μL 20%IPTG的新配LB固體培養(yǎng)基中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h，觀察菌落數(shù)目，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。

1.6 重組克隆文庫(kù)16SrDNA基因組的ALU1酶切數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

隨機(jī)挑取陽(yáng)性克隆120個(gè)，采用T7和SP6引物和LATap聚合酶做16SrDNA基因菌落PCR。菌落PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系見(jiàn)表2。

表2 陽(yáng)性菌落PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

反應(yīng)程序：LID＝105℃，95℃ 4 min，60℃ 1 min［94℃ 40 min，55℃ 40 s，72℃ 1min 30 s］29個(gè)循環(huán)，72℃10 min hold 10℃。獲得重組克隆文庫(kù)16SrDNA以后采用限制性內(nèi)切酶ALU1于37℃反應(yīng)125 min進(jìn)行酶切分析，酶切反應(yīng)緩沖體系見(jiàn)表3。

表3 酶切反應(yīng)體系

酶切反應(yīng)產(chǎn)物在2%濃度的瓊脂糖凝膠，60 V電壓電泳40～50 min，才凝膠成像系統(tǒng)拍照分析統(tǒng)計(jì)。對(duì)酶切圖譜進(jìn)行分類(lèi)統(tǒng)計(jì)，從實(shí)驗(yàn)室酶切圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)照，對(duì)未知的圖譜挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序分析（上海生物工程有限公司）。根據(jù)測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)將統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分析對(duì)比。

2 試驗(yàn)結(jié)果及其分析

試驗(yàn)稀有度曲線如圖1所示。

圖1 試驗(yàn)克隆數(shù)目稀有度曲線

通過(guò)圖1可以看出本試驗(yàn)選取的克隆文庫(kù)選擇的樣本容量能夠代表整體。

將酶切結(jié)果以及測(cè)序后查詢NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)后的結(jié)果做統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4、表5。

通過(guò)表4可看出：堆浸結(jié)束初期（冬季）Acidimicrobium ferrooxidans占48%，Leptospirillum ferriphilum占18%，其它異養(yǎng)菌占34%，礦石表面檢測(cè)出14種不同的微生物。自養(yǎng)菌比例為66%，異養(yǎng)菌比例為34%。

通過(guò)表5可看出：堆浸尾渣放置6個(gè)月以后（夏季）Leptospirillum ferriphilum占87.4%，存在1%的Sulfobacillus acidophilus，Acidimicrobium ferrooxidans在群落中逐漸消失，其它異養(yǎng)菌的比例為11.6%，礦石表面有9種不同的微生物。自養(yǎng)菌比例為88.4%，異養(yǎng)菌比例為11.6%。

整個(gè)過(guò)程Acidimicrobium ferrooxidans菌的比例逐漸降低，由48%縮減至小于1%，Leptospirillum ferriphilum逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橹饕?，?月份的18%上升為87.4%，Sulfobacillus acidophilus等硫氧化細(xì)菌也有一定的繁殖，異養(yǎng)菌的比例由34%降低至11.6%。

表4 冬季群落結(jié)構(gòu)

表5 次年夏季群落結(jié)構(gòu)

3 討 論

一些研究表明：鈾礦浸出微生物菌群種類(lèi)和銅礦類(lèi)似，菌群結(jié)構(gòu)有所不同。影響浸礦微生物群落結(jié)構(gòu)有很多因素，Schrenk等的研究表明Leptospirillum ferriphilum的分布與低pH值緊密相關(guān)。Edwards等利用熒光原位雜交的方法對(duì)位于美國(guó)鐵礦的Leptospirillum ferriphilum菌進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)在溫度較高、pH較低的環(huán)境下Leptospirillum ferriphilum比Acidimicrobium ferrooxidans生存得更好［7］。周洪波等的研究表明對(duì)同一pH條件不同的浸出時(shí)間進(jìn)行比較；發(fā)現(xiàn)不控制pH時(shí)，開(kāi)始階段Acidimicrobium ferrooxidans是優(yōu)勢(shì)種群，但后期Leptospirillum ferriphilum代替Acidimicrobium ferrooxidans成為優(yōu)勢(shì)種群；控制pH時(shí)，Leptospirillum ferriphilum始終是優(yōu)勢(shì)種。Cecilia S等對(duì)低品位黃銅礦堆浸工藝過(guò)程中的生物特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)演替分三個(gè)過(guò)程：從第l到第225 d，Acidithiobacillus ferrooxidans占優(yōu)勢(shì)；在第 255 d到598 d，Leptospirillum ferriphilum開(kāi)始取代 Acidithiobacillus ferrooxidans，成為浸出液中主要優(yōu)勢(shì)群體。此后，在第598 d到749 d，類(lèi)Sulfobacillus屬的菌種成為優(yōu)勢(shì)種群［8］。刁夢(mèng)雪等研究了低品位銅礦柱浸及酸性礦坑廢水微生物群落在高Fe3＋濃度下的演替規(guī)律，發(fā)現(xiàn)Acidimicrobium ferrooxidans和Leptospirillum都可利用亞鐵，而且在無(wú)三價(jià)鐵離子或低濃度三價(jià)鐵離子條件下Acidithiobacillus ferrooxidans為優(yōu)勢(shì)菌群。但在三價(jià)鐵離子濃度較高的情況下，由于Leptospirillum ferriphilum與Acidimicrobium ferrooxidans相比，對(duì)于三價(jià)鐵離子的抑制作用更不敏感，且氧化亞鐵的能力受到抑制更少，因此Leptospirillum ferriphilum比例增加［9］。

本文研究的體系，冬季采樣之前，礦堆依然在噴淋，環(huán)境中一些異養(yǎng)菌會(huì)通過(guò)噴淋液進(jìn)入礦堆內(nèi)部，導(dǎo)致異養(yǎng)菌的比例比較高。礦堆浸出結(jié)束噴淋時(shí)刻浸出液中存在1 g／L左右的Fe2＋，前人研究表明：在Fe2＋條件情況下有利于Acidithiobacillus ferrooxidans的生長(zhǎng)，而Leptospirillum ferriphilum的生長(zhǎng)受到抑制。初期由于 Fe2＋的存在使得 Acidithiobacillus ferrooxidans菌群比例較高。隨著礦堆放置的過(guò)程，礦堆內(nèi)部Fe2＋逐漸消耗，在高 Fe3＋體系下 Acidithiobacillus ferrooxidans活性受到抑制［10］，Leptospirillumferriphilum對(duì)于三價(jià)鐵離子的抑制作用更不敏感，比例會(huì)逐漸增加。在堆浸末期，耗酸物質(zhì)基本消耗完全，堆內(nèi)pH維持在1.5～2.0左右；前人研究認(rèn)為：溫度較高、pH較低的環(huán)境下 Leptospirillum ferriphilum比Acidithiobacillus ferrooxidans生存得更好。從1月份到7月份，環(huán)境溫度逐步升高，堆內(nèi)溫度也相應(yīng)提高，Leptospirillum ferriphilum菌群的比例增加。

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The Research of M icrobial Community Succession in Tailings of a Uranium M ine in Jiangxi

GUO Qin，MIAO Jin-chao，ZHANG Hong-ju，WANG Hui，GAO Lei
（Xingjiang University Institute of Science and Thechnology Akesu Campus，Akesu 843000，China）

Using 16SrDNA gene library technology，we studied the succession ofmicrobial communities in a uranium mine tailings during winter to the following summer in Jiangxi.The results surface：Acidimicrobium，ferrooxidans accounted for 48.5%，Leptospirillum ferriphilum accounted for 17.5%，Xanthomonas albilineans accounted for 11.3%，Mycobacterium SP accounted for 7.2%，and other heterotrophic bacteria accounted for 15.5%.In summer，Leptospirillum ferriphilum accounted for 87.40%，Nitrobacter winogradskyi accounted for 1%，other heterotrophic bacteria accounted for 11.6%，and Acidimicrobium ferrooxidans was not detected.

biologicalmetallurgy；16SrDNA gene library technology；microbial community structure；uranium mine

TF18

A

1003－5540（2017）06－0028－04

新疆大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院教學(xué)改革項(xiàng)目（2017020101008）新疆大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院2017版本科專(zhuān)業(yè)培養(yǎng)方案項(xiàng)目（2017020101004A5）新疆大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（2017020101009B6）

郭 勤（1989－），男，講師，主要從事濕法冶金、化學(xué)分析專(zhuān)業(yè)教學(xué)與科研工作。

2017－09－28