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(1.長沙醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，湖南 長沙410219； 2.湖南九典制藥股份有限公司；3.上海修實(shí)生物科技有限公司)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

丹參乙酸鎂減輕腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用及機(jī)制

婁崢1,周雅倩1,徐獻(xiàn)1,雷文枚2,任賢1,3*

(1.長沙醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，湖南 長沙410219； 2.湖南九典制藥股份有限公司；3.上海修實(shí)生物科技有限公司)

目的探討丹參乙酸鎂對(duì)于大鼠腦缺血/再灌注損傷中的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用大鼠線栓法缺血/再灌注模型，使大鼠腦缺血2 h后，再灌注24 h。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)采用NG108-15神經(jīng)細(xì)胞株缺氧/復(fù)氧模型，低氧無糖培養(yǎng)2 h后，復(fù)氧24 h。檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡、NADPH氧化酶 (NOX)活性及H2O2水平。結(jié)果

與模型組比較,丹參乙酸鎂組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯下降,NOX活性和H2O2水平均降低。結(jié)論丹參乙酸鎂具有抗腦缺血/再灌注損傷的作用,其機(jī)制與抑制NOX活性，減少H2O2生成有關(guān)。

丹參乙酸鎂； 缺血/再灌注； 氧化應(yīng)激

臨床治療過程中對(duì)于缺血性腦卒中通常使用組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator，t-PA)進(jìn)行溶栓，給藥使其恢復(fù)血液灌流后，除缺血外，再灌注本身也能給腦造成損傷，統(tǒng)稱為缺血/再灌注損傷 (cerebral ischemia reperfusion injury,CI/R)。氧化應(yīng)激是指機(jī)體活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生過多和/或抗氧化能力降低，使得ROS 在細(xì)胞內(nèi)大量蓄積而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、壞死的氧化損傷過程[1]，是造成腦缺血/再灌注損傷的機(jī)制之一。

丹參多酚酸鹽是中藥丹參的水溶性提取物，已用于輔助治療心絞痛等缺血性心臟病，其中丹參乙酸鎂是其主要藥理活性成分[2]。丹參乙酸鎂具有抗血小板聚集作用，對(duì)血管栓塞性疾病缺血期即發(fā)揮溶栓治療作用，同時(shí)在再灌注期具有良好的抗氧化特性。基于氧化應(yīng)激是導(dǎo)致腦缺血/再灌注損傷的重要機(jī)制之一，本研究擬探討丹參乙酸鎂對(duì)腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)凋亡作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料健康雄性SD大鼠，體重 250～300 g，中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。NG108-15細(xì)胞株(小鼠神經(jīng)細(xì)胞瘤與大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤融合細(xì)胞株)購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。實(shí)驗(yàn)儀器：組織包埋機(jī)(LEICA)、石蠟切片機(jī)(LEICA)、生化培養(yǎng)箱(Thermo)、多功能酶標(biāo)儀(Beckman)。實(shí)驗(yàn)試劑：丹參乙酸鎂(上海綠谷制藥股份有限公司)、依達(dá)拉奉(中國計(jì)量科學(xué)研究院)、Caspase-3活性檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)、NADPH氧化酶(NADPH oxidase，NOX)活性試劑盒(杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)、VAS2870(NOX特異性抑制劑，Sigma)、TUNEL原位雜交試劑盒(Roche)。

1.2方法動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建線栓法腦缺血/再灌注(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型[3]：10%水合氯醛腹腔麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，暴露并分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，頸外動(dòng)脈(ECA) 和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。結(jié)扎CCA近心端及ECA，用動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉ICA。于CCA遠(yuǎn)心端放置一打好結(jié)的備用絲線，在此線下端剪一小口，將MCAO栓線(購于北京沙東生物技術(shù)有限公司，栓線頭部直徑為0.40±0.02 mm)插入至頸內(nèi)動(dòng)脈，收緊絲線，放開ICA上的動(dòng)脈夾，順I(yè)CA 將栓線送至顱內(nèi)，從CCA分叉處算起，插入深度為約20 mm。阻斷血流2 h后，栓線取出以實(shí)現(xiàn)再灌注，同時(shí)將備用線結(jié)扎CCA遠(yuǎn)心端，并縫好皮膚，再灌注24 h后處理動(dòng)物。

54只SD大鼠隨機(jī)平均分為以下6組：正常對(duì)照組(Control組)：不作任何處理；假手術(shù)組(Sham組)：分離出CCA、ECA和ICA，不插入栓線；腦缺血再/灌注組(I/R組)：缺血2 h，再灌注24 h；丹參乙酸鎂+腦缺血/再灌注組(I/R+MLB組)：再灌注后30 min舌下靜脈給藥(用量：20 mg/kg 0.9%NaCl溶解)；依達(dá)拉奉+腦缺血/再灌注組(I/R+Edaravone組)：再灌注后30 min舌下靜脈給藥(用量：6 mg/kg 溶于60 ℃0.9%NaCl溶液)；溶媒+腦缺血/再灌注組(I/R+Vehicle組)：再灌注后30 min舌下靜脈給藥0.9%NaCl溶液。

處死動(dòng)物后橫切一部分腦組織做TUNEL染色等組織學(xué)檢驗(yàn)，取缺血側(cè)腦組織檢測Caspase-3酶活性、NOX活性、H2O2含量等生物化學(xué)檢驗(yàn)。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[4]：構(gòu)建缺氧/復(fù)氧模型(H/R)：接種NG108-15細(xì)胞株于6孔板或12孔板中，待其貼壁以后，棄掉正常培養(yǎng)的12%血清高糖培養(yǎng)基，孔內(nèi)滴入無血清高糖培養(yǎng)基繼續(xù)常溫常氧培養(yǎng)12～18 h而使細(xì)胞周期同步化。細(xì)胞周期同步化后棄掉無血清培養(yǎng)基，滴入滅菌平衡鹽溶液，放入低氧(1%)37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，即低氧無糖處理。棄掉平衡鹽溶液，繼續(xù)使用12%血清高糖培養(yǎng)基常溫常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，即復(fù)氧處理。復(fù)氧過程后按照不同檢測方法進(jìn)行相關(guān)檢測。

實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組(Control組)：同步化后2 h改用12%血清高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；缺氧/復(fù)氧模型組(H/R組)：按上述方法造模；丹參乙酸鎂+缺氧/復(fù)氧組(H/R+MLB組)：在造模復(fù)氧階段，在培養(yǎng)基中加入丹參乙酸鎂溶液，濃度為10-5mol/L；依達(dá)拉奉+缺氧/復(fù)氧組(H/R+Edaravone組)：在造模復(fù)氧階段，在培養(yǎng)基中加入以0.1%DMSO溶解的濃度為10-5mol/L依達(dá)拉奉(不溶于37 ℃培養(yǎng)基)；VAS2870+缺氧/復(fù)氧組(H/R+VAS2870組)：在造模復(fù)氧階段，在培養(yǎng)基中加入以0.1% DMSO溶解濃度為10-5mol/L的VAS2870(不溶于37℃培養(yǎng)基)；溶媒組+缺氧/復(fù)氧組(H/R+Vehicle組)：在造模復(fù)氧階段，在培養(yǎng)基中加入0.1%DMSO。H/R處理后，進(jìn)行Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡程度、測定NOX活性以及H2O2含量等生物化學(xué)檢驗(yàn)，每組進(jìn)行6次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞凋亡檢測腦組織細(xì)胞凋亡采用TUNEL染色。凋亡細(xì)胞使得內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活，細(xì)胞DNA在內(nèi)切酶作用下出現(xiàn)斷裂，隨之出現(xiàn)單鏈或雙鏈DNA缺口，并產(chǎn)生與DNA斷點(diǎn)數(shù)目相當(dāng)?shù)?′-OH末端。暴露的3′-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT) 的催化下加上熒光素(FITC) 標(biāo)記的dUTP (fluorescein-dUTP)，形成不溶性的深藍(lán)色至藍(lán)紫色的NBT-formazan。顯微鏡觀察，細(xì)胞核深藍(lán)色至藍(lán)紫色顆粒者為TUNEL陽性細(xì)胞，每張切片各取5個(gè)不重疊視野，統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)(每平方毫米的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目)，數(shù)目越多則表明細(xì)胞凋亡越多。具體步驟按試劑盒廠家提供的說明進(jìn)行(Roche公司，瑞士)。

NG108-15神經(jīng)細(xì)胞的凋亡檢測采用Hoechst染色。Hoechst 33258染色凋亡細(xì)胞，由于染色質(zhì)會(huì)固縮，在熒光顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會(huì)呈碎塊狀致密濃染或呈致密濃染，顏色相對(duì)正常細(xì)胞顏色呈白色。每組每樣本隨機(jī)選取3個(gè)視野，計(jì)算細(xì)胞凋亡率(凋亡細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量)。

1.4 Caspase-3活性檢測Caspase-3活性是反映細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)。Caspase-3酶可催化底物Ac-DEVD-pNA產(chǎn)生黃色的pNA，通過測定pNA吸光度可計(jì)算Caspase-3活性。一個(gè)酶活性單位定義為當(dāng)?shù)孜镲柡蜁r(shí)，在37 ℃可以催化1 nmol Ac-DEVD-pNA生成1nmol pNA的Caspase-3的酶量。腦組織Caspase-3活性檢測具體步驟按試劑盒廠家提供的說明進(jìn)行(碧云天生物技術(shù)研究所，江蘇南京)。

1.6 H2O2水平檢測H2O2是NOX下游的重要氧化物，也是造成細(xì)胞損傷的重要活性氧。按廠家提供標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，在將腦組織勻漿液和NG108-15神經(jīng)細(xì)胞裂解液與試劑盒工作液反應(yīng)，于酶標(biāo)儀540 nm檢測吸光度值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中H2O2水平，詳細(xì)步驟按試劑盒廠家提供的說明進(jìn)行(碧云天生物技術(shù)研究所，江蘇南京)。

1.7統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS20.0軟件，數(shù)據(jù)表示均為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，多組均數(shù)比較采用ANOVA及Bonferroni’s多重比較t檢驗(yàn)分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1丹參乙酸鎂對(duì)缺血/再灌注大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的作用見圖1。對(duì)照組和假手術(shù)組腦組織中幾乎未見陽性細(xì)胞，缺血/再灌注組TUNEL陽性細(xì)胞明顯增加。

圖1 丹參乙酸鎂對(duì)缺血/再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響(n=6) A:顯微鏡下TUNEL染色陽性細(xì)胞(200×);B:顯微鏡下TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)量；C:Caspase-3相對(duì)活性. 與Sham比較,**:P<0.01;與I/R比較，++:P<0.01

凋亡細(xì)胞核固縮，細(xì)胞核染成深藍(lán)色至藍(lán)紫色顆粒。給予丹參乙酸鎂后， TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.01)。陽性對(duì)照藥依達(dá)拉奉也能顯著降低TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目(圖1B)。缺血/再灌注組腦組織Caspase-3活性顯著升高，給予丹參乙酸鎂或依達(dá)拉奉可以顯著降低Caspase-3活性(P<0.01，圖1C)，該結(jié)果與TUNEL結(jié)果一致。丹參乙酸鎂的溶媒(生理鹽水)對(duì)TUNEL染色和Caspase-3活性均明顯無影響。

2.2丹參乙酸鎂對(duì)缺血/再灌注大鼠腦組織NOX活性和H2O2生成的影響如圖2所示，對(duì)照組和假手術(shù)組腦組織NOX活性和H2O2含量無顯著差別，排除了造模手術(shù)本身影響。缺血/再灌注組腦組織NOX活性和H2O2含量較假手術(shù)組有顯著升高。給予丹參乙酸鎂或陽性對(duì)照藥依達(dá)拉奉可以顯著降低NOX活性和H2O2含量，而溶媒生理鹽水對(duì)NOX活性和H2O2含量均明顯無影響。

2.3丹參乙酸鎂對(duì)低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的NG108-15神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用如圖3A所示，對(duì)照組Hoechst染色陽性細(xì)胞較少，低氧/復(fù)氧組Hoechst染色陽性細(xì)胞明顯增加(箭頭所示)。丹參乙酸鎂、依達(dá)拉奉或NOX特異性抑制劑VAS2870處理后Hoechst染色陽性細(xì)胞較低氧/復(fù)氧組顯著減少(圖3B)。丹參乙酸鎂溶媒對(duì)Hoechst染色無明顯影響。

2.4丹參乙酸鎂對(duì)低氧/復(fù)氧處理的NG108-15神經(jīng)細(xì)胞NOX活性和H2O2生成的影響如圖4所示，低氧/復(fù)氧組NG108-15神經(jīng)細(xì)胞NOX活性和H2O2水平較對(duì)照組顯著升高。丹參乙酸鎂、依達(dá)拉奉及NOX特異性抑制劑VAS2870處理后可顯著降低NOX活性和H2O2水平。1%DMSO溶媒對(duì)NOX活性和H2O2生成無明顯影響。

圖2 丹參乙酸鎂對(duì)缺血/再灌注大鼠腦組織NOX活性和H2O2生成的影響(n=6)A：NOX活性;B:H2O2水平 與Sham比較，**:P<0.01;與I/R比較，++:P<0.01

圖3 丹參乙酸鎂對(duì)低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的NG108-15神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響(n=6)A:細(xì)胞學(xué)形態(tài)學(xué)(200×)；B:凋亡率相對(duì)百分?jǐn)?shù) 與Control比較，**:P<0.01;與H/R比較，++:P<0.01

圖4 丹參乙酸鎂對(duì)低氧/復(fù)氧處理的神經(jīng)細(xì)胞中NOX活性和H2O2生成的影響(n=6)A:NOX活性;B:H2O2濃度 與Control比較，**:P<0.01;與H/R比較，++:P<0.01

3 討 論

氧化應(yīng)激是腦缺血/再灌注損傷所涉及的重要機(jī)制之一，抗氧化劑依達(dá)拉奉可以改善腦卒中后中樞神經(jīng)功能，減輕癥狀，恢復(fù)意識(shí)和行動(dòng)能力[5]。但依達(dá)拉奉對(duì)于肝、腎等重要臟器有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，極大的限制了該藥在臨床上的使用，僅有日本和歐洲少數(shù)國家批準(zhǔn)上市。

以丹參乙酸鎂為主要成分的丹參多酚酸鹽注射劑是一個(gè)抗腦缺血/再灌注的理想候選藥物，現(xiàn)階段已經(jīng)作為一個(gè)上市藥物廣泛的用于心血管疾病的治療，如動(dòng)脈粥樣硬化、心肌缺血等，其機(jī)制涉及到抗炎、抗氧化、抗血小板等作用[6]。臨床循證醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)，丹參多酚酸鹽對(duì)于腦卒中有一定的輔助治療作用，但其作用機(jī)制尚不清楚。

本研究使用大鼠在體線栓法腦缺血/再灌注模型，通過減少腦動(dòng)脈血流量，造成一側(cè)腦部供血不足，在拔除栓線以后，其腦動(dòng)脈血流可以恢復(fù)到造模前80%左右，腦梗死區(qū)域明顯，神經(jīng)功能損傷嚴(yán)重。該模型廣泛用于模擬缺血性腦卒中的發(fā)生與恢復(fù)供血治療過程。在術(shù)后給予丹參乙酸鎂和依達(dá)拉奉后，通過TUNEL染色檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，可以觀察到對(duì)照組與假手術(shù)組TUNEL陽性細(xì)胞基本沒有出現(xiàn)，而在腦缺血/再灌注模型組，TUNEL陽性細(xì)胞明顯增多，在給予丹參乙酸鎂以及依達(dá)拉奉以后，TUNEL陽性細(xì)胞有所降低，陽性細(xì)胞顆粒顏色變淺。在細(xì)胞水平，Hoechst染色實(shí)驗(yàn)也證明在給予丹參乙酸鎂、依達(dá)拉奉后同樣可以減少低氧/復(fù)氧模型所造成的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。以上實(shí)驗(yàn)說明丹參乙酸鎂可以通過維持神經(jīng)細(xì)胞正常形態(tài)、減少細(xì)胞凋亡等方面有效保護(hù)腦卒中發(fā)生與治療過程中的腦缺血/再灌注損傷，表明丹參乙酸鎂與陽性藥依達(dá)拉奉的保護(hù)程度相似，其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明丹參乙酸鎂具有抗腦缺血/再灌注誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用，其機(jī)制與抑制NOX活性，減少ROS生成有關(guān)。

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EffectofmagnesiumlithospermateBoncerebralischemia/reperfusion-inducedapoptosisandtheunderlyingmechanisms

LOU Zheng,ZHOU Yaqian,XU Xian,et al

(CollegeofPharmacy，ChangshaMedicalUniversity,Changsha410219，Hunan,China)

ObjectiveTo investigate whether lithospermate B is able to protect the rat brain from ischemia/reperfusion injury and the underlying mechanism.MethodRats were subjected to 2 h of cerebral ischemia and 24 h of reperfusion to establish anischemia/reperfusion injury model.In a NG108-15 nerve cell hypoxia/reoxygenation (H/R) injury model,cells were cultured in 2 h of hypoxia and 24 h of reoxygenation.And cellular apoptosis,nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase (NOX)activity,and H2O2content were examined.ResultAdministration of salvia magnesium lithospermate B reduced apoptosis of nerve cells with a decrease in nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase activity and H2O2production in the rat brains,compared with model group.In the experiments,the number of iHoechst staining positive cells,nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase activity and H2O2level were decreased by the intervention of drugs.ConclusionThe results suggest that lithospermate B is able to protect the brain from ischemia/reperfusion oxidative injury,which is related to the inhibition of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase and a reduction of reactive oxygen species production.

magnesium lithospermate B; ischemia/reperfusion injury; oxidative stress

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.05.009

2016-12-01；

2017-07-26

湖南省教育廳一般項(xiàng)目(15C0161)藥學(xué)類專業(yè)校企合作人才培養(yǎng)示范基地(湘教通[2014]272號(hào)).

*通訊作者，E-mail：renxian87@163.com.

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蔣湘蓮)