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(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床藥學(xué)科，湖南 衡陽 421001；2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3.南華大學(xué)藥學(xué)與生命科學(xué)院；4.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科；5.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

蛞蝓有效提取物抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤生長

王娟1，曹建國2，姚旭3，秦勇4，劉毅4，鄭自通4，申文娟5*

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床藥學(xué)科，湖南 衡陽 421001；2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3.南華大學(xué)藥學(xué)與生命科學(xué)院；4.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科；5.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科)

目的觀察蛞蝓有效提取物(EL-3)對宮頸癌HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的影響。方法制備宮頸癌HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，檢查EL-3對瘤體積、瘤重及VEGF蛋白表達(dá)的影響，評估EL-3在體內(nèi)治療宮頸癌的有效性。結(jié)果EL-3(10、30和100 mg/kg)實驗組的瘤體積顯著低于生理鹽水組(P<0.05)，同時，其移植瘤的瘤重抑制率分別為42.0%、67.0%和83.0%，提示EL-3在體內(nèi)抗宮頸癌作用較強，且呈劑量依賴性；采用免疫組化檢測證實EL-3下調(diào)宮頸癌裸鼠移植瘤細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)。結(jié)論EL-3具有抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的作用，其機理可能與抑制腫瘤血管生成有關(guān)。

宮頸癌； 蛞蝓； 蛞蝓有效提取物； HeLa細(xì)胞 ； 治療作用

蛞蝓(Agriolimax agrestis Linnaeus，Limax)為有肺的軟體動物，屬腹足綱，柄眼目，蛞蝓科，我國各地有產(chǎn)。因其體表布滿黏液，形似蝸牛而無殼，故又俗稱“黏蟲、鼻涕蟲”[1]。蛞蝓具有多種生物學(xué)活性和藥理學(xué)效應(yīng)，其中以抗腫瘤作用最為突出[2]。曾振東等人研究發(fā)現(xiàn)蛞蝓對小鼠S180肉瘤具有抑制作用[3]。本課題組研究蛞蝓的抗腫瘤作用，也有一定前期工作基礎(chǔ)[4]。本文作者已應(yīng)用現(xiàn)代藥物化學(xué)技術(shù)，以鮮蛞蝓勻漿，60%乙醇沉淀，三氯乙酸脫蛋白獲得蛞蝓有效提取物(extraction of limax-3,EL-3)，并通過實驗證實EL-3具有抑制A549細(xì)胞錨定生長和增殖、誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡以及體內(nèi)抗肺癌的作用[5]。

宮頸癌是一種婦科常見惡性腫瘤，對女性健康安全威脅極大。清華大學(xué)藥物研究所王釗等[6]人發(fā)現(xiàn)蛞蝓提取物對人宮頸癌HeLa細(xì)胞體外生長具有明顯抑制作用。本研究擬用實驗進(jìn)一步觀察蛞蝓有效提取物EL-3對宮頸癌HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的影響。評估 EL-3在體內(nèi)治療宮頸癌的有效性，并對其可能的機制進(jìn)行初步探討，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1動物SPF 級 BALB/C 裸鼠，年齡4～5周，雌性，重量約18～20 g左右，由上海斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供，飼養(yǎng)于屏障環(huán)境 (百級無菌室)中。

1.2細(xì)胞宮頸癌HeLa細(xì)胞從中科院上海細(xì)胞生物研究所購買，用含10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，常規(guī)傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3藥物及試劑蛞蝓有效提取物EL-3，性狀為淡黃色粉末狀，由浙江工業(yè)大學(xué)生物環(huán)境工程學(xué)院多糖研究室提供。注射用順鉑(cisplatin,DDP)，齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：10mg/瓶，批號：7C0081B02。紫杉醇注射液(paclitaxell,TAX)，海口市制藥廠有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：30 mg/5 mL/支，批號：12161105。以上藥物置于4 ℃ 冰箱中保存，用時以生理鹽水稀釋成所需濃度。DAB 免疫組化染色試劑盒及兔抗人VEGF多克隆抗體由美國Santa Cruz公司生產(chǎn)，購于上海研卉生物科技有限公司。

1.4稱量器具美耐特牌電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺，上海美耐特實業(yè)有限公司生產(chǎn)，型號：150T，測量范圍：0～150 mm，分辨率：0.01 mm，誤差值：±0.02 mm。上海卓精電子分析天平，上海卓精電子科技有限公司生產(chǎn)，型號：BSM-120.4，分度值0.1 mg，量程120 g，秤盤尺寸φ90 mm。凱豐高精密動物電子秤，凱豐集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，分度值0.01 g，最大稱量300 g，秤盤尺寸φ115 mm。

1.6移植瘤免疫組織化學(xué)觀察移植瘤免疫組織化學(xué)觀察在顯微鏡下進(jìn)行，觀察前需要進(jìn)行7步準(zhǔn)備工作：①固定(將移植瘤組織放置于10 %的中性福爾馬林中24 h)；②脫水；③常規(guī)石蠟包埋；④切片；⑤染色(用兔抗人VEGF多克隆抗體進(jìn)行染色)；⑥顯色(用 DAB 免疫組化染色試劑盒進(jìn)行顯色)；⑦復(fù)染(用蘇木素復(fù)染1 min后水洗)。在400倍顯微鏡下對經(jīng)過處理的組織切片進(jìn)行觀察，胞核或者胞漿呈棕色則為陽性細(xì)胞。對于顯微鏡觀察得到的圖片，采用Image Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行定量分析，測量免疫組化結(jié)果中陽性細(xì)胞的積分光密度(integrated optical density，IOD)。積分光密度是表示整個視野內(nèi)所有選定對象的反應(yīng)強度的總和。在本文中，陽性細(xì)胞的積分光密度=平均光密度×陽性細(xì)胞的面積，積分光密度值越高，陽性細(xì)胞的反應(yīng)強度越大，其蛋白含量越高。

2 結(jié) 果

2.1 EL-3對宮頸癌HeLa細(xì)胞裸鼠異種移植瘤生長的影響本文成功地建立宮頸癌HeLa細(xì)胞裸鼠異種移植瘤模型。在實驗期間，EL-3實驗組的裸鼠體重較對照組無明顯差異，無裸鼠死亡。圖1A和 圖1B可見：高(EL-3 100 mg/kg)、中(EL-3 30 mg/kg)、低(EL-3 10 mg/kg)劑量組的移植瘤顯著小于生理鹽水模型對照組，各用藥組瘤體積明顯小于生理鹽水組(P<0.05)(圖2)，100、30和10 mg/kg的EL-3對移植瘤的瘤重抑制率分別為：83.0%、67.0%和42.0%，而同一實驗條件下10 mg/kg的紫杉醇和2 mg/kg的順鉑對宮頸癌HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤的瘤重抑制率分別為93.0%和84.0%(表1)。以上結(jié)果顯示：EL-3顯著抑制HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長，呈劑量依賴性。

圖1 EL-3對宮頸癌HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤大體形態(tài)的影響A’:裸鼠處死大體觀； B’:皮下移植瘤大體觀. A：生理鹽水對照組；B：TAX對照組；C：DDP對照組；D：EL-3 100 mg/kg 組；E：EL-3 30 mg/kg組；F：EL-3 10 mg/kg 組

圖2 EL-3對宮頸癌HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的影響(n=5)與生理鹽水對照組比較，**P<0.01

組別瘤重(mg)瘤重抑制率(%)生理鹽水對照組392±103—TAX對照組28±1793.0aDDP對照組61±3884.0aEL-3100mg/kg組66±1383.0aEL-330mg/kg組127±6667.0aEL-310mg/kg組226±7842.0b

與生理鹽水對照組比較,a：P<0.01,b：P<0.05

2.2 EL-3對宮頸癌HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤VEGF表達(dá)的影響本文采用兔抗人VEGF多克隆抗體檢測移植瘤細(xì)胞中VEGF蛋白的表達(dá)。生理鹽水對照組中的大部分細(xì)胞核及胞漿呈棕黃色顆粒狀，VEGF呈強陽性表達(dá)(圖3A)；紫杉醇對照組中VEGF呈陰性表達(dá)(圖3B)；順鉑對照組，小部分瘤細(xì)胞核著色，呈黃色，VEGF呈弱陽性表達(dá)(圖3C)；高劑量EL-3實驗組，小部分瘤細(xì)胞核著色，呈黃色，VEGF呈弱陽性表達(dá)(圖3D)；中劑量EL-3實驗組，部分瘤細(xì)胞核著色，呈黃色，VEGF呈中等陽性表達(dá)(圖3E)。低劑量EL-3實驗組，較大部分瘤細(xì)胞核著色呈黃色，VEGF呈較強陽性表達(dá)(圖3F)。以上結(jié)果顯示EL-3具有抑制宮頸癌裸鼠移植瘤細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)的作用。從圖3G中可以看出，高、中、低EL-3劑量組裸鼠移植瘤細(xì)胞中的IOD值較生理鹽水組的IOD值有明顯降低，并呈劑量依賴性。

3 討 論

宮頸癌是全球婦女最常見的惡性腫瘤之一[8]。宮頸癌的治療以手術(shù)和放化療為主，但對于宮頸癌晚期和復(fù)發(fā)的患者，則主要采用化療。目前，宮頸癌新輔助化療中常用的藥物包括：順鉑、異環(huán)磷酰胺、紫杉醇、卡鉑、氟尿嘧啶、絲裂霉素等。這些藥物單獨使用的有效率在6%～30%之間，并且存在嚴(yán)重化療毒副反應(yīng)，聯(lián)合用藥毒副反應(yīng)更大，通常在臨床治療中需嚴(yán)格限制其使用劑量[9]。因此，尋找和研制新的高效、低毒、不良反應(yīng)小的宮頸癌治療藥物，具有重大的社會、經(jīng)濟(jì)效益和廣闊的臨床應(yīng)用前景[10]。

臨床使用中藥抗腫瘤歷史悠久，主要是依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)調(diào)節(jié)臟腑功能失調(diào)的理論進(jìn)行治療，存在實際應(yīng)用中可操作性不強的缺點。同時，中藥抗腫瘤最主要的問題在于發(fā)揮抗腫瘤療效的有效成分尚不明確。但隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)生物學(xué)和藥學(xué)不斷發(fā)展，中藥的抗腫瘤研究已逐步深入到其有效部位或(和)活性成分對腫瘤細(xì)胞和腫瘤動物移植瘤模型作用的研究層次。因此，從天然動、植物或(和)中草藥中尋找能相對選擇性地抑制或殺滅腫瘤細(xì)胞、毒副作用較小的有效部位或(和)活性藥物分子具有重要科學(xué)意義。

圖3 EL-3抑制宮頸癌裸鼠移植瘤細(xì)胞VEGF表達(dá) 光學(xué)顯微鏡(400×)A：生理鹽水對照組；B：TAX對照組；C：DDP對照組；D：EL-3 100 mg/kg組；E：EL-3 30 mg/kg組；F：EL-3 10 mg/kg組G:EL-3劑量依賴性降低宮頸癌裸鼠移植瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)(n=5) . 與生理鹽水對照組比較，*：P<0.05

蛞蝓作為傳統(tǒng)中藥，被國內(nèi)外多項研究證實其具有抗腫瘤作用，它與常規(guī)化療藥物相比，療效相當(dāng)，并具有低毒及協(xié)同常規(guī)化療藥物抗腫瘤等特點[11]。因此，近年來蛞蝓的抗腫瘤作用引起了廣大醫(yī)藥科研工作者的重視。焦智民等[12]人觀察了以蛞蝓為主綜合治療中晚期肺癌患者的療效，治療組采用以蛞蝓膠囊為主加中醫(yī)辯證施治及聯(lián)合化療的綜合治療，總有效率為62.5%，明顯高于應(yīng)用中醫(yī)辯證施治及聯(lián)合化療的對照1組的有效率39.1%和只用聯(lián)合化療的對照2組的有效率30.1%。本前期實驗亦發(fā)現(xiàn)蛞蝓提取物能有效地抑制 A549 細(xì)胞BrdU的摻入以及誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡、亞G1期細(xì)胞累積和基因 DNA 的非隨機性剪切，此外還發(fā)現(xiàn)蛞蝓提取物對A549細(xì)胞移植瘤生長具有抑制作用，且呈劑量依賴性[13]。

王釗等[6]人通過體外實驗發(fā)現(xiàn)蛞蝓提取物對人宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長具有明顯抑制作用。本研究則通過建立宮頸癌HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤模型開展治療實驗，進(jìn)一步驗證了蛞蝓有效提取物EL-3體內(nèi)治療宮頸癌的效果，并通過免疫組織化學(xué)觀察，分析EL-3對宮頸癌HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤VEGF表達(dá)的影響。實驗結(jié)果證實EL-3能有效地抑制HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤生長，它通過下調(diào)VEGF蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮體內(nèi)抗腫瘤作用，作用機制可能與其抑制腫瘤血管生成有關(guān)。

綜上所述，蛞蝓有效提取物EL-3具有較強抗宮頸癌作用，毒副作用小是其優(yōu)于當(dāng)前常用化療藥物的突出特點，因而具有潛在臨床應(yīng)用價值。本文也為將EL-3開發(fā)和研制成治療宮頸癌的創(chuàng)新型藥物提供了實驗依據(jù)，然而對于其抗宮頸癌作用的分子機制還需要繼續(xù)深入探索。

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InhibitoryeffectsoflimaxeffectiveextractiononthegrowthofcervicalcancerHeLacellstransplantedtumorinnudemice

WANG Juan,CAO Jianguo,YAO Xu,et al

(DepartmentofClinicalPharmacy,theSecondAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo determine the effect of EL-3,an effective extraction of limax,on the growth of cervical cancer HeLa cell xenografts in nude mice.MethodsThe model of cervical cancer HeLa cells in nude mice was established,and the effect of EL-3 on the tumor volume,tumor weight and the expression of VEGF protein were examined.The effectiveness of EL-3 in the treatment of cervical cancer in vivo was evaluated.ResultsEL-3 can effectively inhibit the growth of human cervical cancer transplanted tumor in nude mice;tumor volume of 10,30,100 mg/kg dose group of EL-3 were significantly lower than that of normal saline group (P<0.05);simultaneously,the transplanted tumor weight inhibitory rates were 42%,67% and 83% respectively,suggesting that the effect of EL-3 in vivo against cervical cancer is stronger and in a dose-dependent manner.Immunohistochemistry showed that EL-3 could down regulate the expression of VEGF protein of the transplanted tumor tissues of cervical cancer HeLa cells in nude mice.ConclusionEL-3 can inhibit the tumor growth of cervical cancer HeLa cells in nude mice,and the mechanism may be related to the inhibition of tumor angiogenesis.

cervical cancer; limax; effective extraction of limax; HeLa cells; therapeutical effect

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.06.007

2017-06-29；

2017-09-28

湖南省教育廳科學(xué)研究項目(16C1407)；廣州市科技計劃項目(2003Z3-E5131)；衡陽市科技計劃項目(2016KJ60).

*通訊作者，E-mail:278028342@qq.com.

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蔣湘蓮)