， ， 匡希

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科,湖南 衡陽 421001;2.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

痰熱清注射液及藥效成分黃芩苷對心梗模型小鼠心肌細胞損傷的保護作用

英姿1*，黃斌2，匡希斌2

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科,湖南 衡陽 421001;2.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科)

目的探討痰熱清及其藥效成分黃芩苷對小鼠心肌梗死后心肌細胞損傷的保護作用。方法將小鼠隨機均分為假手術(shù)組、心梗模型組和痰熱清高、中、低劑量組，以及高劑量組痰熱清對應(yīng)的黃芩苷含量100 mg/kg作為藥效成分組。分別測定小鼠24 h心肌病理形態(tài)學(xué)檢查、梗塞面積、心肌細胞凋亡數(shù)目比例、HMGB1、TLR4、NF-kB的表達活性、IL-6、TNF-α、MDA、caspase-3等指標。結(jié)果和心梗模型組相比，痰熱清高劑量組與藥效成分黃芩苷組均能顯著改善心肌病理，降低梗死邊緣區(qū)的心肌細胞凋亡率和梗死區(qū)面積，下調(diào)心梗小鼠心肌組織中HMGB1/TLR4/NF-kB信號通路以及IL-6、TNF-α、MDA、caspase-3的表達。結(jié)論痰熱清與其藥效成分黃芩苷具有類似的心臟保護藥效，其機制涉及改善HMGB1/TLR4/NF-kB信號通路及下游炎性因子，氧化應(yīng)激及凋亡因子的表達，從而降低小鼠心肌梗死后心肌細胞損傷。

痰熱清； 黃芩苷； 心肌梗死； 細胞凋亡

急性心肌梗死是人類健康的重要殺手，其病理本質(zhì)為冠狀動脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死，炎性因子、氧化應(yīng)激、細胞凋亡均參與了心梗后心肌損害的發(fā)生和發(fā)展[1]。心梗中醫(yī)名為胸痹，古代文獻雖然認為胸痹發(fā)病多為陽微陰弦，但古代醫(yī)家提出的“熱結(jié)心痛”“毒損心絡(luò)”以及現(xiàn)代醫(yī)家的臨床研究發(fā)現(xiàn)均提示了心梗與痰熱密切相關(guān)。痰熱清注射液由黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花和連翹組成，具有較強的清熱、解毒、化痰之功。近幾年痰熱清在心血管內(nèi)科的療效也不斷得到證實，既往文獻報道了其對冠心病心絞痛，急性心梗，高血壓和高血脂的療效，與本院心內(nèi)科的使用經(jīng)驗相吻合，引起了本文作者極大的興趣[2-3]。本實驗采用急性心肌梗死小鼠模型，觀察痰熱清對小鼠心肌梗死后心肌細胞凋亡及信號通路的影響，探討痰熱清對心臟保護的作用機制及可能的藥效成分。

1 材料與方法

1.1實驗動物與主要試劑8周齡的C57BL/6小鼠80只購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號SCXK(湘)2016-0002。痰熱清購于上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，黃芩苷購于成都曼思特生物科技有限公司，純度≥98%，HMGB1、TLR4、NF-kB抗體購于長沙鼎國生物技術(shù)有限公司，IL-6、TNF-α、MDA、caspase-3的ELISA試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司。

1.2實驗方法動物模型小鼠被40 mg/kg (腹腔注射)劑量的戊巴比妥鈉麻醉。小鼠在氣管導(dǎo)管插管后予呼吸器，用室內(nèi)空氣輔助通氣，通氣參數(shù)：潮氣量8 mL/100 g，呼吸頻率68 cycles/min，呼吸頻率為2∶1。如果需要，實驗中繼續(xù)予麻醉藥(一般不再給予)。在消毒條件下，從第四肋骨的位置進行胸廓切開手術(shù)?？梢钥匆娦呐K懸浮在心包中。通過錐型針，用1.0號的絲線穿過左冠狀動脈前降支的起始處，絲線兩端之間，通過，試管用于當(dāng)扎緊線時使冠狀動脈閉塞。通過左心室相應(yīng)階段出現(xiàn)局部蒼白、膨脹，心肌缺血得到確定[4]。將造模成功62只實驗小鼠隨機分六組(每組10只):(1)假手術(shù)組；(2)模型組：于術(shù)后腹腔注射生理鹽水(3 mg/kg)溶液；(3)痰熱清高(H-TRQ)、中(M-TRQ)、低劑量組(L-TRQ)：于術(shù)后30 min立即單次腹腔注射痰熱清高劑量(18 mL/kg)、中劑量(6 mL/kg)和低劑量(2 mL/kg)溶液 ；(4)吸收成分黃芩苷組(BCL)：根據(jù)痰熱清高劑量(18 mL /kg)中大約含黃芩苷100 mg/kg，于術(shù)后30 min立即腹腔注射黃芩苷100 mg/kg，與母方痰熱清進行療效對比。

1.3觀察指標分別測定小鼠24 h心肌病理形態(tài)學(xué)檢查(H&E染色)、梗塞面積、心肌細胞凋亡數(shù)目比例(TUNEL測定方法)、HMGB1、TLR4、NF-kB的表達活性(Western blot法)、IL-6、TNF-α、MDA、caspase-3(ELISA法)指標。

1.3.1 心梗大小測定 造模24 h后，于1 mL 2%亞斯蘭染色劑于左心室注入，并將心肌組織用PBS沖洗3次，-20 ℃冰凍，并切成1 mm厚度薄片。用TTC孵育15 min，然后ImagePro-Plus 5.0.1計算危險區(qū)及非危險區(qū)。并統(tǒng)計分析[4]。

1.3.2 凋亡心肌細胞的定量使用TUNEL 心肌組織埋入paraffin封閉，每個組織切成5 μm厚度薄片，后使用蛋白酶K，組織切片用TUNEL反應(yīng)，使用DAPI封固劑進行細胞核計數(shù)，至少每個封閉的5個切片計數(shù)。另外使用單克隆抗a輔肌動蛋白染色。每一個切片隨機選取10個視野來計算凋亡指數(shù)[5]。

1.3.3 Western blot法測HMGB1、TLR4、NF-Kb表達

心肌組織一個加入胞漿提取混合液400 μL，在冰凍下用組織勻漿機勻漿。得到的漿液離心：700×g 10 min 4 ℃。收集上清液到新的一個EP管，離心：10 000×g 30 min 4 ℃。再次收集到的上清液作為胞漿提取物。將得到的組織液用BCA法進行蛋白定量。在做好的凝膠中上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，待凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后，將PVDF膜浸入5%milk封閉。37 ℃ 2 h或者4 ℃過夜。一抗(cyt C 與5%milk按照1∶300比例配置。例如：10 mL/300=33 μL)孵育,37 ℃ 2 h或者4 ℃過夜。沖洗：PBST緩沖液洗3次，10 min/次；加入二抗(抗體 與PBST緩沖液按照1∶20 000比例配置)，孵育,37 ℃ 1 h。沖洗：PBST緩沖液洗3次，10 min/次；PBS緩沖液洗1次，10 min。曝光，然后ImagePro-Plus 5.0.1分析圖像[6]。心肌組織提取液IL-6、TNF-α、MDA、caspase-3的均采用武漢華美ELISA試劑盒說明書進行操作，反應(yīng)結(jié)束后于全自動酶標儀上讀取光密度值(波長450 nm)，繪制濃度曲線，計算樣本光密度值對應(yīng)的濃度范圍。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠的心肌組織病理與心肌細胞凋亡比較如圖1所示，假手術(shù)組大鼠心肌纖維呈粉紅色，飽滿整齊；心肌細胞漿染色均勻，細胞核分布均勻；心肌間質(zhì)未見炎癥細胞浸潤。小鼠心梗后24 h，梗死邊緣區(qū)心肌纖維排列紊亂、斷裂，肌漿嗜酸性增強；心肌細胞結(jié)構(gòu)不清，呈凝固性壞死；心肌間質(zhì)可見較多炎癥細胞浸潤及炎癥性充血，高劑量痰熱清(18 mL/kg)組能顯著改善心肌細胞變性、壞死及炎癥細胞浸潤,同時降低梗死邊緣區(qū)的心肌細胞凋亡率和梗死區(qū)面積，(與鹽水組相比均P<0.05)，同時高劑量痰熱清中所含約100 mg/kg的黃芩苷也發(fā)揮了類似的心臟保護的藥效，心肌細胞變性、壞死及炎癥細胞浸潤較少，且心肌細胞凋亡率與梗死區(qū)面積與鹽水組相比均P<0.05。而痰熱清低、中劑量均無明顯改善梗死邊緣區(qū)心肌組織病理和心肌細胞凋亡的作用。

2.2各組小鼠HMGB1/TLR4/NF-kB信號通路比較心梗模型組小鼠心肌組織的HMGB1/TLR4/NF-kB的表達顯著升高(模型組與假手術(shù)組，均P<0.05，圖2)，痰熱清與藥效成分黃芩苷均能顯著降低心梗小鼠心肌組織中HMGB1/TLR4/NF-kB 的表達，提示藥效成分黃芩苷發(fā)揮了類似與母方痰熱清調(diào)節(jié)心梗小鼠心肌組織中HMGB1/TLR4/NF-kB信號通路的藥效。

圖1 小鼠心肌病理與梗死形態(tài) *：與模型組相比P<0.05

圖2 小鼠心肌組織Western blot檢測 與假手術(shù)組相比，#：P<0.05;與模型組相比，*：P<0.05

2.3各組小鼠的炎性因子IL-6、TNF-α、氧化應(yīng)激與凋亡因子MDA、caspase-3的表達比較心梗模型組小鼠心肌組織的IL-6、TNF-α、MDA、caspase-3的表達顯著升高(模型組與假手術(shù)組，均P<0.05，圖3)，痰熱清與藥效成分黃芩苷均能顯著降低心梗小鼠心肌組織中IL-6、TNF-α、MDA、caspase-3 的表達(兩組與模型組均P<0.05)，提示藥效成分黃芩苷發(fā)揮了類似與母方痰熱清調(diào)節(jié)心梗小鼠心肌組織中炎性因子IL-6、TNF-α、氧化應(yīng)激與凋亡因子MDA、caspase-3的藥效。

圖3.小鼠心肌組織提取液ELISA檢測 與假手術(shù)組相比，#：P<0.05;與模型組相比，*：P<0.05

3 討 論

痰熱清注射液由黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花和連翹組成,其中黃芩為君藥,具有清熱燥濕,瀉火清毒之功效;熊膽粉、山羊角為臣藥,熊膽粉具有解痙、解毒、抑菌抗炎、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘作用;山羊角具有顯著的解熱、鎮(zhèn)靜及免疫作用;金銀花為佐藥,有廣譜抗菌作用,以助清熱解毒,宣肺化痰;連翹為使藥,具有升浮宣散之力。痰熱清可用具有抗病毒、抑菌、抗炎、解熱、化痰、鎮(zhèn)咳等作用,廣泛應(yīng)用于呼吸、消化、血液等系統(tǒng)疾病 。除此之外,痰熱清在不斷的臨床應(yīng)用中，發(fā)展了許多臨床新用途，應(yīng)用范圍不斷擴大，在治療急性膽囊炎，胰腺炎，川崎病，急性腦出血，開胸術(shù)后痰潴留，癌性發(fā)熱，腎綜合征出血熱，多器官功能衰竭綜合征，肺心病等各科疾病中均報道有良好療效[7-9]。

近幾年隨著痰熱清在心血管內(nèi)科的療效也不斷得到證實，本文作者在心內(nèi)科進行臨床療效觀察的同時，也試圖從動物實驗闡釋痰熱清的心臟保護作用。本文作者的研究參考了已有學(xué)者證實的痰熱清在急性肺損傷中發(fā)揮的調(diào)節(jié)免疫，抗氧化應(yīng)激，抑制炎癥反應(yīng)，抑制細胞凋亡作用[10-11]，并且冠心病也主要是冠狀動脈形成心梗斑塊，致管腔狹窄冠脈血流量減少后心肌缺血所致，其形成機制復(fù)雜，氧化應(yīng)激和/或炎癥均與心梗相關(guān)，推測痰熱清在急性心梗中亦可能發(fā)揮類似藥效。既往動物實驗顯示，痰熱清注射液可減少炎癥反應(yīng)及超敏反應(yīng)等損傷性反應(yīng)的發(fā)生，提高抗炎因子的表達[12]?？纱龠M機體免疫功能發(fā)揮，對T、B 淋巴細胞增殖及腹腔巨噬細胞的吞噬功能具有顯著促進作用[13]。同時還可降低炎性細胞因子的含量，保護血管內(nèi)皮細胞的形態(tài)和功能[3]。臨床研究結(jié)果表明，痰熱清注射液能顯著改善心梗的臨床癥狀及動態(tài)心電圖，有效地降低其血漿中hs-CRP 水平，對痰熱型心梗患者具有顯著的治療作用，推測其作用機制可能是通過抑制體內(nèi)炎癥反應(yīng)、抗氧自由基作用、增強機體免疫調(diào)節(jié)功能等途徑，有效地改善血管內(nèi)皮功能、穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊、降低斑塊的破裂及血栓形成而達到抑止或延緩心梗發(fā)生發(fā)展的效果[2]。

本文的實驗首先從心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變上驗證了小鼠梗死邊緣區(qū)心肌纖維排列紊亂、斷裂，肌漿嗜酸性增強；心肌細胞結(jié)構(gòu)不清，呈凝固性壞死；心肌間質(zhì)可見較多炎癥細胞浸潤及炎癥性充血，痰熱清與黃芩苷改善心肌細胞變性、壞死及炎癥細胞浸潤，同時降低梗死邊緣區(qū)的心肌細胞凋亡率和梗死區(qū)面積，下調(diào)HMGB1/TLR4/NF-kB信號通路的表達。對于炎癥反應(yīng)的初始觸發(fā)信號的探索中，人們發(fā)現(xiàn)了“危險信號”模式。相對于病原體基本成分或產(chǎn)物這類外源性的“危險信號分子”而言，內(nèi)源性的“危險信號分子”來自損傷或壞死的細胞，一旦被釋放到胞外，則是一種強大的致炎及趨化細胞因子。對這種內(nèi)源性“危險信號分子”如何導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失衡及免疫反應(yīng)紊亂的研究是目前國際上的前沿?zé)狳c[14]。HMGB1即是其典型代表，為廣泛存于在有核細胞胞內(nèi)均高度保守的DNA結(jié)合蛋白，具有穩(wěn)定核酸結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和基因表達等多種功能。長期以來人們對于HMGB1核外功能了解甚少。近年來研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1是機體識別損傷、啟動修復(fù)的非常重要的內(nèi)源性“危險信號分子”。在實質(zhì)細胞壞死的動物腦、肝臟和心臟等缺血模型中的研究顯示，缺血發(fā)生早期，HMGB1即向胞外釋放，應(yīng)用HMGB1抗體可以減輕缺血再灌注損傷的程度[15]。本文推測在急性心梗的早期，缺血導(dǎo)致HMGB1釋放，HMGB1通過巨噬細胞表面TLR4受體調(diào)節(jié)的NF-kB分泌，參與了心梗的發(fā)生發(fā)展[16]。圍繞HMGB1/TLR4/NF-kB信號途徑進行藥物干預(yù)，能減輕心肌缺血帶來的心肌細胞損傷，為急性心梗的治療策略提供新的理論依據(jù)參考。

本文結(jié)果顯示痰熱清可能是通過抗氧化應(yīng)激和抑制炎性因子的機制減少斑塊發(fā)生，抑制心肌細胞凋亡，發(fā)揮了心臟保護作用，其主要信號通路與HMGB1/TLR4/NF-kB相關(guān)。HMGB1與TLR4結(jié)合后受體發(fā)生二聚化，引起MyD88和MyD88依賴性NF-kB的激活，上調(diào)炎性因子TNF-α、IL-6的基因表達水平并引起大量釋放[17]。報道亦證實心肌組織缺血再灌注引起病理損傷，導(dǎo)致心肌組織MDA含量上升，凋亡增多，caspase-3上升，與HMGB1的上升呈同步相關(guān)性[18]。

綜上所述，痰熱清對小鼠心肌梗死后心肌細胞具有保護作用，具體機制涉及對HMGB1/TLR4/NF-kB信號通路的調(diào)節(jié)以及炎性因子，氧化應(yīng)激及凋亡因子等多方面機制，黃芩苷是痰熱清心臟保護作用的藥效成分之一。

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ProtectiveeffectsofTan-Re-Qinganditsabsorbedcomponentsbaicalinonmyocardialcellinjuryaftermyocardialinfarctioninmice

YING Zi,HUANG Bin,KUANG XiBin

(DepartmentofPharmacology,theSecondAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of Tan-Re-Qing and its main absorption component,baicalin,on myocardial cell injury after myocardial infarction in mice.MethodsC57BL/6 mice were randomly divided into sham operation group,myocardial infarction model group,high,medium and low dose of Tan-Re-Qing group,and baicalin 100 mg/kg contents in high dose group Tan-Re-Qing as absorbed compounds group.24 h myocardial pathology,the number of myocardial infarct size and apoptosis ratio,expression of HMGB1,TLR4 and NF-kB activity,level of IL-6,TNF-α,MDA,caspase-3 were measured and the results were statistically analyzed.ResultsCompared with myocardial infarction model group,Tan-Re-Qing and its absorbed compound baicalin could significantly improve myocardial pathology,reduced infarct marginal zone and cell apoptosis rate of myocardial infarction area,down-regulated the HMGB1/TLR4/NF-kB signaling pathway and the expression of IL-6,TNF-α,MDA,caspase-3.ConclusionTan-Re-Qing and its absorbed compound baicalin has similar heart protection effect,its mechanism relates to the improvement of HMGB1/TLR4/NF-kB signaling pathway and expression of their downstream inflammatory factors,oxidative stress and apoptosis factors,thereby reducing myocardial cell injury after myocardial infarction in mice.

Tan-Re-Qing; baicalin; myocardial infarction; apoptosis

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.06.008

2017-07-04；

2017-09-26

湖南省自然科學(xué)基金(院校聯(lián)合基金項目)；痰熱清吸收成分通過抗氧化途徑發(fā)揮心臟保護作用的機理研究，基金號：2015JJ6099.

*通訊作者，E-mail：nanhuayingzi@163.com.

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蔣湘蓮)