郭婉姝 史寶和 王楠 陳曉虹

補(bǔ)體C3d-p28對(duì)阿爾茨海默病DNA疫苗的免疫增強(qiáng)作用

郭婉姝 史寶和 王楠 陳曉虹

目的探討補(bǔ)體C3d-p28作為分子佐劑，在阿爾茨海默病DNA疫苗基因免疫中的作用。方法在第1、8、22、43、64、85、106、127天，將重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10、p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3和pcDNA3.1(+)肌肉注射于APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠后腿股四頭肌內(nèi)。疫苗接種前、自第2次注射開始每次接種后7天取鼠眶靜脈血共8次，以ELISA法檢測(cè)抗Aβ抗體的滴度和分型；第8次(最后1次)眶靜脈取血后進(jìn)行6 d的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，通過(guò)定位航行和空間探索實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，以ELISA法檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中白細(xì)胞介素4(IL-4)和 干擾素γ(IFN-γ)水平，免疫組化染色法檢測(cè)小鼠腦內(nèi)Aβ斑的表達(dá)。結(jié)果p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組抗Aβ抗體水平高于p(Aβ3-10)10組〔(55.03±8.93)μg/mLvs.(27.32±7.69)μg/mL，t=-4.455，P<0.05〕，p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組抗體類型主要是IgG1型〔(50.64±6.96)μg/mL〕，明顯高于p(Aβ3-10)10組〔(14.15±3.16)μg/mL，P<0.05〕。與p(Aβ3-10)10組比較，p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)平均逃避潛伏期變短、穿越平臺(tái)次數(shù)和穿越平臺(tái)所在象限停留的時(shí)間比例明顯增多(均P<0.05)；脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4水平增高〔(110.22±18.12)pg/mLvs.(170.12±22.16)pg/mL，P<0.05〕、IFN-γ水平減低〔(800.12±80.11)pg/mLvs.(640.12±70.53) pg/mL，F(xiàn)=6.152，P<0.05〕；腦內(nèi)沉積的Aβ斑塊明顯減少(P<0.05)。結(jié)論補(bǔ)體C3d-p28分子佐劑使p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3抗Aβ抗體的產(chǎn)生增加、Th2型免疫反應(yīng)增強(qiáng)，轉(zhuǎn)基因鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力提高。

阿爾茨海默病；β淀粉樣蛋白；DNA疫苗；C3d-p28分子佐劑； APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease， AD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其典型病理特征為細(xì)胞外老年斑(SP)和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFTs)的形成。Aβ免疫治療可阻止Aβ產(chǎn)生、聚集和/或增加Aβ清除，被認(rèn)為是治療AD的有效治療策略。作為安全、有效的Aβ主動(dòng)免疫疫苗，不僅應(yīng)具有治療作用的抗Aβ抗體，避免Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)，同時(shí)還需要具有減緩認(rèn)知功能減退的作用。現(xiàn)有研究表明，C3d分子佐劑通過(guò)與B細(xì)胞表面的補(bǔ)體受體2(CR2)結(jié)合，誘發(fā)強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)[1]，可將免疫應(yīng)答模式由Th1型向Th2型轉(zhuǎn)變[2]。而p28分子是補(bǔ)體C3d分子與CR2特異性結(jié)合的結(jié)合域，p28分子與全長(zhǎng)C3d分子有相似的佐劑性質(zhì)[3]，但p28分子大小僅占C3d分子全長(zhǎng)的9%[4]，這將更增強(qiáng)了DNA疫苗的有效利用。據(jù)此，本文作者設(shè)計(jì)了一個(gè)新的質(zhì)粒DNA疫苗p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3，該疫苗中加入了鼠補(bǔ)體C3d-p28分子佐劑來(lái)增強(qiáng)p(Aβ3-10)10抗原的免疫原性。

本次試驗(yàn)中以重組質(zhì)粒疫苗p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3免疫APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠進(jìn)行研究，評(píng)價(jià)補(bǔ)體C3d-p28作為分子佐劑，能否增強(qiáng)疫苗的有效性和安全性，以及其能否增強(qiáng)疫苗對(duì)認(rèn)知功能的影響。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1主要?jiǎng)游铮?2月齡雌性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠21只，體質(zhì)量(30±2)g，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，并在SPF(specific pathogen free)級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.1.2主要試劑：重組質(zhì)粒疫苗p(Aβ3-10)10和p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3由湖南長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司合成；抗Aβ抗體6E10(Signet，美國(guó))；羊抗鼠IgG1-HRP、羊抗鼠IgG2a-HRP、羊抗鼠IgG2b-HRP(Zymed，美國(guó))；小鼠白細(xì)胞介素-4(IL-4)ELISA試劑盒、小鼠干擾素γ(IFN-γ) ELISA試劑盒(Bender Med Systems GmbH，奧地利)。

1.2方法

1.2.1分組：APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠21只，按隨機(jī)數(shù)字表法分成重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10組、重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組、空載體pcDNA3.1(+)組 3組，每組7只。

1.2.2免疫方法：于小鼠左后腿股四頭肌肌肉注射疫苗抗原： 重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10、重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3和pcDNA3.1(+)，每只鼠注射100 μL(1.0 μg/μL)。3組小鼠按第1、8、22、43、64、85、106、127天免疫，共免疫8次。

1.2.3檢測(cè)血清抗Aβ抗體滴度及分型：疫苗接種前、自第2次注射開始每次接種后7天取鼠眶靜脈血共8次，每次0.5 mL，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)血清中抗Aβ抗體滴度及各分型(IgG1、IgG2a和IgG2b)的滴度[5]。

1.2.4Morris 水迷宮檢測(cè)鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能：(1)定位航行實(shí)驗(yàn)：于第8次(最后1次)眶靜脈取血后進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。第1～2天進(jìn)行可視平臺(tái)訓(xùn)練。每天訓(xùn)練4次，分上、下午兩個(gè)時(shí)段，池壁標(biāo)明東、南、西、北四個(gè)入水點(diǎn)，水池等分為四個(gè)象限，將小鼠面向池壁，分別從4個(gè)入水點(diǎn)放入水中，記錄小鼠從入水到找到平臺(tái)并站立其上所需的時(shí)間，即逃避潛伏期(escape latency)。第3～5天進(jìn)行隱藏平臺(tái)訓(xùn)練。將平臺(tái)隱藏于水下1 cm，實(shí)驗(yàn)方法同上。

(2)空間探索實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)第6天，撤去平臺(tái)，選擇平臺(tái)相對(duì)象限的入水點(diǎn)，將小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)和穿越平臺(tái)所在象限停留的時(shí)間比例。

1.2.5檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子的水平：水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，3組小鼠經(jīng)10%(0.03 mg/kg)水合氯醛腹腔麻醉后處死，其中每組取2只小鼠的脾臟用于細(xì)胞培養(yǎng)。ELISA試劑盒檢測(cè)脾臟細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ水平。

1.2.6檢測(cè)腦內(nèi)Aβ斑的表達(dá)：其余5只小鼠被剪開右心耳，從左心室快速灌注生理鹽水100 mL，迅速分離出大腦(剪開顱蓋骨)，以4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛緩沖液固定，常規(guī)制備石蠟切片，厚度約4 μm，每只小鼠取大致相同位置3張切片。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)腦內(nèi)Aβ斑的表達(dá)[9]。一抗：1︰1000稀釋的6E10。結(jié)果判斷：以棕色/棕褐色、顆粒狀斑塊結(jié)構(gòu)為Aβ斑。Image J圖像分析軟件進(jìn)行Aβ斑面積的定量分析。測(cè)定海馬區(qū)或皮質(zhì)區(qū)的總面積和相應(yīng)的Aβ斑面積，計(jì)算海馬區(qū)或皮質(zhì)區(qū)Aβ斑面積百分比。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD法；抗Aβ抗體滴度的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1血清抗Aβ抗體滴度及分型的檢測(cè)經(jīng)p(Aβ3-10)10和p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3免疫的小鼠均產(chǎn)生了抗Aβ抗體，并且在第2次免疫后血清抗Aβ抗體的滴度平穩(wěn)增長(zhǎng)，與p(Aβ3-10)10組比較，p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組抗Aβ抗體滴度明顯增高(P<0.05)，pcDNA3.1(+)組免疫的小鼠未檢測(cè)出抗Aβ抗體(表1)。與p(Aβ3-10)10組抗IgG1 抗體滴度比較，p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組滴度明顯增高〔(14.15±3.16)μg/mLvs.(50.64±6.96)μg/mL，t=12.177，P=0.000〕，p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組IgG2a和IgG2b滴度低于p(Aβ3-10)10組〔IgG2a滴度分別為(5.27±1.18)μg/mLvs.(7.35±1.60)μg/mL，t=-2.302，P=0.040；IgG2b滴度分別為(7.89±2.43)μg/mLvs.(13.12±4.56)μg/mL，t=2.909，P=0.044〕，p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組IgG1/IgG2a的比值明顯高于p(Aβ3-10)10組(9.77±0.68vs.1.94±0.11，t=19.688，P=0.000)。

2.2免疫小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的檢測(cè)第1-2天的可視平臺(tái)訓(xùn)練中，3組小鼠平均逃避潛伏期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第3-5天的隱藏平臺(tái)定位航行實(shí)驗(yàn)中，3組小鼠平均逃避潛伏期呈逐漸下降的趨勢(shì)，與p(Aβ3-10)10組和pcDNA3.1(+)組比較，p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組平均逃避潛伏期明顯減低(P<0.05，表2)。在第6天空間探索實(shí)驗(yàn)中，與其他2組比較，1 min內(nèi)，p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組在平臺(tái)所在象限停留的時(shí)間和穿越平臺(tái)的次數(shù)均增高(P<0.05，表2)。

2.3脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子水平比較與 p(Aβ3-10)10組和pcDNA3.1(+)組比較， p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組IL-4水平明顯增高(P<0.05，表3)，而前2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組和pcDNA3.1(+)組IFN-γ水平均低于p(Aβ3-10)10組(P<0.05，表3)，而前2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 接種后各組APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠不同時(shí)間點(diǎn)抗Aβ抗體的滴度比較 (n=7 ，±s，μg/mL)

注：與p(Aβ3-10)10 組比較，*P<0.05；表中時(shí)間點(diǎn)按取眶血次數(shù)為計(jì)

注：與p(Aβ3-10)10組 比較，*P<0.05;與pcDNA3.1(+)組比較，#P<0.05

表3 三組大鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子水平及皮質(zhì)、海馬區(qū)AB斑面積比較 (n=7，±s，)

注：與p(Aβ3-10)10組比較，*P<0.05；與pcDNA3.1(+)組比較，#P<0.05

2.4三組大鼠腦內(nèi)Aβ斑比較3組小鼠皮質(zhì)和海馬均可見(jiàn)Aβ斑，與p(Aβ3-10)10組和pcDNA3.1(+)組比較， p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組Aβ斑的數(shù)量明顯減少(圖1)。p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組皮質(zhì)和海馬Aβ斑面積與p(Aβ3-10)10組和pcDNA3.1(+)組比較明顯減少，p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組皮質(zhì)的Aβ斑數(shù)量較p(Aβ3-10)10組減少39.0%，海馬的Aβ斑數(shù)量較p(Aβ3-10)10組減少36.0%(均P<0.05，表3)。

3 討論

本研究中發(fā)現(xiàn)融入了補(bǔ)體C3d-p28的重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3疫苗免疫12月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠產(chǎn)生了有效的、安全的作用，沒(méi)有產(chǎn)生不良的Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)，同時(shí)還減緩了認(rèn)知功能的減退。

從疫苗的有效性角度來(lái)看，現(xiàn)有研究已表明編碼不同抗原基因(西尼羅病毒、乙肝病毒、豬繁殖和呼吸綜合征病毒、瘧原蟲環(huán)孢子蛋白)的DNA疫苗在融合了補(bǔ)體C3d-p28分子佐劑后，抗原的免疫原性大大地增強(qiáng)了，DNA疫苗的有效性也大大提高[5]。本次試驗(yàn)，第2次免疫后，重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3免疫的小鼠產(chǎn)生了較高滴度的抗Aβ抗體，抗體滴度明顯高于p(Aβ3-10)10組，并且腦內(nèi)Aβ斑定量分析顯示重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3免疫的小鼠腦皮質(zhì)和海馬沉積的Aβ斑較p(Aβ3-10)10組明顯減少。腦內(nèi)Aβ斑塊沉積是AD診斷的決定性指標(biāo)，臨床通常以其清除效果用來(lái)評(píng)價(jià)AD模型鼠的療效。本研究結(jié)果顯示融入了補(bǔ)體C3d-p28的Aβ3-10疫苗產(chǎn)生了足夠的抗Aβ抗體水平，而且所產(chǎn)生的抗Aβ抗體既能穿透血腦屏障，又能與腦內(nèi)Aβ斑特異性結(jié)合而清除Aβ斑塊，這與抗Aβ 6E10抗體產(chǎn)生了相似的治療作用；腦內(nèi)Aβ斑較p(Aβ3-10)10組明顯減少，表明補(bǔ)體C3d-p28分子佐劑增強(qiáng)了Aβ3-10疫苗的免疫原性。

從疫苗的安全性來(lái)分析，現(xiàn)有研究業(yè)已證實(shí)，Th2型免疫反應(yīng)主要誘導(dǎo)IgG1抗體，通過(guò)產(chǎn)生IL-4，IL-5等細(xì)胞因子增強(qiáng)體液免疫反應(yīng)；Th1型免疫反應(yīng)主要產(chǎn)生IgG2a抗體，通過(guò)產(chǎn)生IFN-γ，IL-2等細(xì)胞因子誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，如AN1792臨床試驗(yàn)中出現(xiàn)了Th1型免疫反應(yīng)誘發(fā)的腦膜腦炎[6-7]，前者是本研究所需要的，后者正是本研究實(shí)驗(yàn)中所要避免的。本研究中，重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3免疫小鼠產(chǎn)生了以IgG1為主的抗體，而p(Aβ3-10)10組則產(chǎn)生了Th1/ Th2混合型的免疫反應(yīng)；并且p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組IgG1/IgG2a的比值明顯高于p(Aβ3-10)10組。上述情況表明融入了補(bǔ)體C3d-p28的Aβ3-10疫苗產(chǎn)生了傾向于Th2型的免疫反應(yīng)。重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-4水平高、IFN-γ水平低，而p(Aβ3-10)10組IL-4水平低和IFN-γ水平高。細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果再次說(shuō)明了融入了補(bǔ)體C3d-p28的Aβ3-10疫苗產(chǎn)生了Th2型免疫反應(yīng)，這樣就降低了發(fā)生炎性反應(yīng)的可能性。

從水迷宮試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組的平均逃避潛伏期明顯短于p(Aβ3-10)10組和pcDNA3.1(+)組。在探索試驗(yàn)中，p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組穿越平臺(tái)次數(shù)和穿越平臺(tái)所在象限停留的時(shí)間比例均高于p(Aβ3-10)10組和pcDNA3.1(+)組，表明重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3組與p(Aβ3-10)10組和pcDNA3.1(+)組比較小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善。因此，融入了補(bǔ)體C3d-p28的Aβ疫苗免疫小鼠可增強(qiáng)該疫苗改善認(rèn)知的能力。

綜上所述，融入了補(bǔ)體C3d-p28的重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3免疫APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠后，不僅僅能夠增強(qiáng)抗原的免疫原性，增強(qiáng)誘發(fā)Th2型免疫反應(yīng)的能力，還能夠增強(qiáng)改善小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的功能。

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ImmunoenhancementofcomplementC3d-p28onAlzheimer’sdiseaseDNAvaccine

GUOWanshu，SHIBaohe，WANGNan，CHENXiao-hong

DepartmentofNeurology，ThePeople’sHospitalofChinaMedicalUniversity，ThePeople’sHospitalofLiaoningProvince，ShenyangLiaoning110016，China

CHEN Xiaohong，Email： cxh_ly@163.com

ObjectiveTo discuss the effect of complement C3d-p28 in the genetic immunization of Alzheimer’s disease DNA vaccine.MethodsOn day 1，8，22，43，64，85，106，127， the recombinant plasmid p(Aβ3-10)10， recombinant plasmid p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3 and pcDNA3.1(+)were injected intramuscularly into the musculi quadriceps femoris of APP/PS1 double transgenic mouse hind leg. Before the vaccination and 7 days after the second injection， the orbital vein blood was taken 8 times. ELISA was used to detect the titer of serum anti-Aβ antibody， isotypes of immunoglobulin. After the eighth orbital vein blood collection， Morris water maze test was conducted to evaluate the spatial learning and memory ability of the mice through the positioning navigation and space exploration tests for 6 days. The mice were killed at the end of the water maze test， and the contents of IL-4 and IFN-γ in the supernatant of spleen cell culture were detected by ELISA. The β-amyloid plaques in mouse brains were detected by immunohistochemistry.ResultsThe titers of anti-Aβ antibodies in the p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3 group were higher than those in the p(Aβ3-10)10 group [(55.03±8.93)μg/mLvs.(27.32±7.69)μg/mL，t=-4.455，P<0.05]. The type of antibody in the p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3 group was mainly IgG1 type[(50.64±6.96)μg/mL]，apparently higher than p(Aβ3-10)10 group[(14.15±3.16)μg/mL，P<0.05].In the Morris water maze， the p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3 group showed shorter escape latency and spent significant more time in the target quadrant and crossed the platform significantly more often than p(Aβ3-10)10 immunized mice. In the p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3 group， the content of IL-4 in the supernatant of spleen cell culture was higher [(170.12±22.16) pg/mL，P<0.05]， the content of IFN-γ was lower[(640.12±70.53) pg/mL，F(xiàn)=6.152，P<0.05]， and the deposition of amyloid burden in hippocampal and cortex was significantly reduced (P<0.05),compared with the p(Aβ3-10)10 group.ConclusionsComplement C3d-p28 molecular adjuvant enhanced the production of anti Aβ antibody of recombinant plasmid p(Aβ3-10)10-C3d-p28.3，enhanced the Th2 type immune response， and improved the spatial learning and memory ability of transgenic mice

Alzheimer’s disease; Amyloid-β; DNA vaccine; C3d-p28 molecular adjuvant; APP/PS1 transgenic mice

10.3969/j.issn.1006-2963.2017.06.005

遼寧省博士啟動(dòng)基金(2016011039-301)

110016 遼寧省人民醫(yī)院 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

陳曉虹，Email：cxh_ly@163.com

R741.05

A

1006-2963(2017)06-0401-05

2017-02-08)

鄒晨雙)