陳凌華，程祖鋅，許 明

(福建農(nóng)林大學(xué))

0 引言

實(shí)驗(yàn)中通過(guò)菌草栽培收集到的不同靈芝屬子實(shí)體樣品共53份，范圍涉及松杉靈芝 (Ganodermatsugae)、密紋靈芝(Ganodermatenus)、樹(shù)舌靈芝(Ganodermaapplanatum)、紫芝(Ganodermasinense)與赤芝(Ganodermalucidum)等品種.采用熱水浸提法提取靈芝子實(shí)體多糖，苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量.通過(guò)對(duì)53份來(lái)源不同的靈芝屬的子實(shí)體多糖的定量分析，發(fā)現(xiàn)各品種的多糖表達(dá)量之間具有明顯差異，該研究可為靈芝多糖等活性物質(zhì)的研發(fā)與應(yīng)用提供參考價(jià)值.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

供試靈芝菌種53份(見(jiàn)表1)，由福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心保藏，菌株主要分為以下幾類： 赤芝(38個(gè)，編號(hào)1-38)，樹(shù)舌靈芝(1個(gè)，編號(hào)39)，紫芝(3個(gè)，編號(hào)40-42)，密紋靈芝(2個(gè)，編號(hào)43-44)與松杉靈芝 (9個(gè)，編號(hào)45-53).對(duì)照品2個(gè)，分別是同期栽培的菌草靈芝與段木靈芝.

表1 靈芝菌種

續(xù)表1 靈藝菌種

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000mL.

菌草培養(yǎng)料：水∶石膏∶麥皮∶芒萁∶五節(jié)芒=55∶1∶10∶15∶24.

1.1.3 試劑

高職院校生物化學(xué)教學(xué)改革的探討永遠(yuǎn)在路上。作為授課教師，應(yīng)在教學(xué)實(shí)踐中不斷探索新的教學(xué)思路和方法，使學(xué)生在有限的學(xué)習(xí)時(shí)間內(nèi)，既掌握專業(yè)基礎(chǔ)理論知識(shí)，又具備從事本專業(yè)實(shí)際工作的基本技能和初步能力。

無(wú)水葡萄糖(基準(zhǔn)純)、以及乙醇、濃硫酸、苯酚等生化試劑(分析純).

1.2 方法

1.2.1 熱水法提取靈芝子實(shí)體多糖

子實(shí)體多糖提取采用實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的熱水法[8]，步驟具體如下：稱取子實(shí)體粉末(過(guò)10目篩)5 g，95%乙醇100 ℃浸提3次，每次30 min(去除脂溶性物質(zhì)).抽濾，取料渣按1∶30的料水比在100 ℃熱水條件下浸提3 h，浸提液減壓濃縮后，乙醇4 ℃沉淀過(guò)夜，凍干得粗多糖樣品.

1.2.2 靈芝多糖含量測(cè)定：苯酚-硫酸法

(1)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別用吸量管移取體積為0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40 mL濃度為1.25 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，加蒸餾水至2.00 mL，依次加入1.00mL的5%苯酚溶液混勻，快速加入5.00mL的濃硫酸，立即振蕩混勻并于冰浴放置20 min.以2.00mL蒸餾水為試劑空白，室溫下選擇490 nm波長(zhǎng)測(cè)定上述溶液的吸光度，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線.

(2)53種不同來(lái)源靈芝子實(shí)體多糖的含量測(cè)定

稱取凍干保存的粗多糖10.00 mg，定容于50.00 mL容量瓶，取粗多糖樣品溶液按上述相同操作并測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到樣品液中的葡萄糖濃度ρ(mg/mL).

公式中ρ為樣品液的葡萄糖濃度(mg/mL)，V為配制的多糖樣品液體積(mL)，m為粗多糖的取樣質(zhì)量(mg).

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝多糖含量測(cè)定

2.1.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

苯酚-硫酸法繪制的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線為：A=49.887×ρ+0.011，回歸系數(shù)γ=0.9994 (A表示吸光度，ρ表示葡萄糖濃度).

2.1.2 多糖含量測(cè)定

53份靈芝子實(shí)體多糖含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2.

子實(shí)體多糖含量(%)=粗多糖提取率×粗多糖中多糖含量

53份來(lái)源不同的靈芝屬子實(shí)體多糖定量測(cè)定結(jié)果顯示，不同靈芝屬子實(shí)體的多糖含量之間有明顯差異(見(jiàn)表3)：(1)在粗多糖平均提取率方面，紫芝最高(6.33%)，樹(shù)舌靈芝次之，赤芝的平均粗多糖提取率僅為紫芝的32.54%；3個(gè)紫芝品種中42號(hào)的粗多糖提取率最高(7.60%)，為對(duì)照品菌草靈芝的2.04倍.(2)粗多糖中多糖平均含量方面，赤芝最高(35.74%)，其次是密紋靈芝與松杉靈芝，紫芝較低；紫芝粗多糖中的多糖平均含量?jī)H為赤芝的76.11%；38個(gè)赤芝品種中粗多糖的多糖含量最高的為27號(hào)(43.52%)，為對(duì)照品菌草靈芝的1.29倍.(3)子實(shí)體多糖平均含量方面：子實(shí)體多糖含量高低是由粗多糖的提取率、粗多糖中多糖含量這兩個(gè)方面共同決定的.子實(shí)體的多糖平均含量最高的是紫芝(1.72%)，其次為樹(shù)舌靈芝，赤芝的子實(shí)體多糖的平均含量較低，僅為紫芝品種的(42.44%)；3個(gè)紫芝品種中子實(shí)體多糖含量最高的為42號(hào)(2.05%)，為對(duì)照品菌草靈芝的1.64倍.

表2 53份靈芝子實(shí)體的的粗多糖提取率與多糖含量

續(xù)表2 53份靈芝子實(shí)體的的粗多糖提取率與多糖含量

注： 粗多糖提取率(%)=粗多糖質(zhì)量/子實(shí)體質(zhì)量 子實(shí)體多糖含量(%)=粗多糖提取率×粗多糖中多糖含量

表3 不同亞屬靈芝的的平均粗多糖提取率與平均多糖含量

該實(shí)驗(yàn)除了以同期生產(chǎn)的菌草靈芝作為對(duì)照品外，還測(cè)定了段木靈芝的粗多糖含量，結(jié)果表明：盡管菌草靈芝的粗多糖中純多糖的含量不及段木靈芝，但由于菌草靈芝具有較高的粗多糖提取率，因此菌草靈芝子實(shí)體的多糖含量(1.99%)在1%的顯著水平下仍然明顯高于段木栽培靈芝(1.92%)，這也從量上反映出靈芝的菌草栽培可有效代替段木栽培.

3 討論

靈芝在我國(guó)具有悠久的藥用歷史，其活性成分多糖含量的高低已成為衡量靈芝品質(zhì)的重要指標(biāo).由于靈芝品種繁多，種間與品種間的不同均有可能引起有效成分多糖在含量表達(dá)上的差異[9].即使是相同的菌株，在生長(zhǎng)過(guò)程中因外界環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)與栽培形式的不同，仍可引起多糖含量表達(dá)的不同.該研究對(duì)收集到的53份靈芝屬材料，在嚴(yán)格控制客觀的栽培環(huán)境下，重點(diǎn)研究遺傳背景的差異對(duì)靈芝多糖含量的影響.該實(shí)驗(yàn)采用綠色環(huán)保的菌草栽培技術(shù)，從母種，原種、栽培袋的制備過(guò)程中，嚴(yán)格控制接菌量、培養(yǎng)基量的一致，并在相同的大棚栽培環(huán)境下(相對(duì)濕度90%，溫度22～28℃，通風(fēng)，散射光照射)進(jìn)行生長(zhǎng)，并做到同期接菌、同期采收.

排除了客觀的栽培條件或營(yíng)養(yǎng)條件差異可能對(duì)子實(shí)體多糖含量的影響，多糖含量差異主要就由其遺傳背景或種性決定.本實(shí)驗(yàn)的多糖含量測(cè)定結(jié)果表明，靈芝不同亞屬間的多糖含量存在顯著性差異：紫芝子實(shí)體多糖的平均含量最高(1.72%)，其次為樹(shù)舌靈芝(1.53%)，然后依次是密紋靈芝(0.94%)、赤芝(0.73%)與松杉靈芝(0.63%)；其中赤芝的子實(shí)體多糖的平均含量(0.73%)僅為紫芝品種的42.44%.此外，即使是同一亞屬的靈芝菌株，由于其遺傳背景或來(lái)源不同，多糖含量也存在明顯差異，例如本實(shí)驗(yàn)中的38個(gè)赤芝菌株，其子實(shí)體的多糖含量分布較為廣泛，多糖含量最高的品種(36號(hào)南韓靈芝1.55%)是最低的品種(16號(hào)京大0.51%)的3倍以上.

目前市場(chǎng)供求的靈芝品種比較豐富，但缺乏有效的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其質(zhì)量高低進(jìn)行甄別，而種質(zhì)資源的優(yōu)劣是影響食用菌產(chǎn)量及質(zhì)量的關(guān)鍵因素.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于高多糖靈芝種質(zhì)的選育以及靈芝活性多糖的研發(fā)具有一定的參考依據(jù).多糖含量測(cè)定結(jié)果表明，由于遺傳種性的不同，不同亞屬、以及同一亞屬下的不同菌株的靈芝子實(shí)體多糖含量之間存在明顯差異.目前市面上應(yīng)用最為廣泛的主栽品種為赤芝，其次為紫芝.赤芝和紫芝都是《中國(guó)藥典》[10]正式收錄的藥用真菌.有研究表明紫芝、松杉靈芝、密紋靈芝等品種具有不同于赤芝的獨(dú)特生物學(xué)活性[11]，該研究通過(guò)比較不同遺傳背景的靈芝子實(shí)體在相同栽培環(huán)境下的多糖含量差異，旨在為以靈芝多糖為代表的活性物質(zhì)的研發(fā)以及不同靈芝屬多糖的藥理活性研究提供參考價(jià)值.