朱大玲, 唐嘯龍, 張寶玉, 楊振芳, 王樂普, 秦樂寧, 張 蕾

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一株海藻多糖降解菌的分離鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

朱大玲1, 唐嘯龍2, 張寶玉3, 楊振芳2, 王樂普1, 秦樂寧1, 張 蕾1

(1. 天津市海洋化學(xué)與資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院, 天津 300457; 2. 天津科技大學(xué) 海洋與環(huán)境學(xué)院, 天津 300457; 3. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071)

從大型褐藻藻體分離獲得一株具有高效降解瓊膠和褐藻膠能力的革蘭氏陰性菌菌株ST-6。16S rDNA序列分析結(jié)果表明, 該菌株與海綿假單胞菌的相似度達(dá)到99%, NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹也與海綿假單胞菌歸為一類, 鑒定為海綿假單胞菌ST-6。在2216E培養(yǎng)基、30℃培養(yǎng)條件下, 海綿假單胞菌ST-6的生長(zhǎng)曲線表明, 接種10~48 h為菌株的指數(shù)生長(zhǎng)期, 48~72 h為生長(zhǎng)穩(wěn)定期。產(chǎn)酶結(jié)果表明, 菌株ST-6在指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)菌液的胞外瓊膠酶相對(duì)酶活力較高, 在接種48 h時(shí), 菌液的瓊膠酶相對(duì)酶活力最高為249.15 U/mL。此外, 發(fā)現(xiàn)菌株ST-6的瓊膠酶和褐藻膠酶的分泌類型分別為非誘導(dǎo)型和誘導(dǎo)型。采用單因素分析法對(duì)其生長(zhǎng)和產(chǎn)酶條件進(jìn)行分析, 結(jié)果表明, 海綿假單胞菌ST-6最適生長(zhǎng)條件為: 溫度25~35℃, pH值5~9; 最適產(chǎn)瓊膠酶條件為: 溫度30℃, pH值為7, 瓊膠濃度0.3%。最適產(chǎn)褐藻膠酶條件為: 溫度35℃, pH值為9。在溫度30℃、pH9和褐藻酸鈉濃度0.15%的培養(yǎng)條件下, 海綿假單胞菌ST-6獲得最高胞外褐藻膠酶相對(duì)酶活力為135.54 U/mL。

海綿假單胞菌; 瓊膠酶酶活; 褐藻膠酶酶活; 3,5-二硝基水楊酸比色法; 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

大型海藻是重要的海洋資源, 具有廣泛的開發(fā)前景。近年來, 隨著化石燃料短缺和環(huán)境保護(hù)需要, 海藻作為生物燃料和化工產(chǎn)品生產(chǎn)原料的應(yīng)用越來越受到關(guān)注[1]。大型海藻海帶和江蘺的養(yǎng)殖技術(shù)成熟, 使得其作為生物燃料和化工產(chǎn)品生產(chǎn)原料的應(yīng)用可行性大大提高。目前我國(guó)海帶和江蘺養(yǎng)殖已經(jīng)遍布沿海地區(qū), 其中海帶產(chǎn)量居世界首位[2]。因此, 在我國(guó)開展利用大型海藻生產(chǎn)生物燃料和化工產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用具有得天獨(dú)厚的條件。大型海藻具有生長(zhǎng)環(huán)境要求寬泛, 生長(zhǎng)速度快, 不含木質(zhì)素, 易于養(yǎng)殖和收獲等特點(diǎn), 使其作為生物質(zhì)原料利用的成本大大降低。同時(shí), 大型海藻的光合速率高, 規(guī)?；B(yǎng)殖大型海藻吸收環(huán)境中的CO2, 具有一定的環(huán)境效益[3]。然而, 海藻多糖的降解是限制大型海藻作為生物質(zhì)原料開發(fā)利用的瓶頸問題。

大型海藻海帶和江蘺的主要成分為褐藻膠和瓊膠, 兩者分別是褐藻和紅藻細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的重要多糖。褐藻膠由1,4---甘露糖醛酸和1,4---古羅糖醛酸兩種單體組成, 褐藻膠以多聚甘露糖醛酸、多聚古羅糖醛酸或兩者交替排列的線性無分支長(zhǎng)鏈形式存在[4]。瓊膠以1,3-O---吡喃半乳糖和1,4--3,6-內(nèi)醚---吡喃半乳糖交替連接組成的鏈狀分子形式存在[5]。因結(jié)構(gòu)組成的特殊性和復(fù)雜性使得褐藻膠和瓊膠難以被普通微生物降解, 常被用于實(shí)驗(yàn)室中微生物培養(yǎng)的基質(zhì)或是固定化培養(yǎng)的基質(zhì)[6]。與化學(xué)方法相比, 海藻多糖的生物酶解法溫和、高效及環(huán)境友好, 是海藻多糖降解的首選方法[7]。微生物酶解法因其生長(zhǎng)速度快, 產(chǎn)酶量高, 較海洋動(dòng)物產(chǎn)酶的成本低, 是海藻多糖降解的研究熱點(diǎn)。

已報(bào)道的褐藻膠和瓊膠降解菌株大多分離自海洋環(huán)境, 其中包括弧菌屬[8]、鏈霉菌屬[9]、交替單胞菌屬[10]、假別單胞菌屬[11]、假單胞菌屬[12]、嗜瓊膠菌屬[13]等微生物菌株。不同菌株所產(chǎn)降解酶的種類多樣, 不同降解酶的酶解位點(diǎn)具有專一性, 這也使得不同菌株所產(chǎn)酶的降解產(chǎn)物呈現(xiàn)多樣性。例如: Li等[14]從假單胞菌sp.HJZ216的發(fā)酵液中純化的褐藻膠裂解酶能將褐藻膠裂解成六種寡糖, 其中包括二糖和三糖。Kim等[15]從韓國(guó)釜山附近的沿海沼澤中分離到菌株所產(chǎn)降解酶既能降解褐藻膠又能降解昆布多糖?；【鷮倬阺p. PO-303所產(chǎn)酶可降解瓊膠生成5種新瓊寡糖[16]。白色噬瓊膠菌OAY2可產(chǎn)兩種瓊膠酶, 分別可降解瓊膠生成三種新瓊寡糖(NA2、NA4和NA6)和二種新瓊寡糖(NA4和NA6)[17]。然而, 不同降解菌株所產(chǎn)降解酶的多樣性及其降解產(chǎn)物的多樣性使得大型海藻作為生物質(zhì)原料的開發(fā)利用成本升高。目前利用大型海藻制備生物燃料和化工產(chǎn)品的研究報(bào)道仍停留在實(shí)驗(yàn)階段或是小試階段。因此, 降解底物寬泛、降解產(chǎn)物單一等高效微生物菌株的獲得仍是解決大型海藻開發(fā)利用的重要途徑之一。

本研究從褐藻藻體中分離鑒定了一株既能降解褐藻膠又能降解瓊膠的高效菌株, 對(duì)其性能及其產(chǎn)酶條件進(jìn)行分析, 以期為大型海藻多糖的高值化和能源化利用提供前提條件。

1 材料與方法

1.1 樣品和培養(yǎng)基

樣品為深圳汕頭海濱潮間帶采集野生大型褐藻鼠尾藻藻體。褐藻膠分離培養(yǎng)基(g/L): 褐藻酸納3, NaCl 30, KH2PO43, K2HPO47, (NH4)2SO42, MgSO40.1, FeSO40. 1, pH 6.0。固體培養(yǎng)基加入1.5%的瓊脂。純化培養(yǎng)基是在2216E海水細(xì)菌培養(yǎng)基中添加了褐藻酸鈉, 具體組分如下(g/L): 蛋白胨5, 酵母粉1, 檸檬酸鐵0.011, 褐藻酸鈉15, 陳海水定容至1 L, pH7.6。

1.2 菌株的篩選

將樣品組織經(jīng)研磨后加入褐藻膠分離培養(yǎng)基, 30℃振蕩培養(yǎng)72 h。取菌液稀釋后涂布在褐藻膠分離培養(yǎng)基平板上, 用封口膜將平板密封, 置30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3 d, 挑取使培養(yǎng)基明顯液化的單菌落, 進(jìn)一步在純化培養(yǎng)基平板上劃線純化, 重復(fù)進(jìn)行3次, 直至獲得純化菌株。純化菌株–80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌株的鑒定

1.3.1 菌株的形態(tài)學(xué)觀察

通過光鏡(Olympus, 日本)對(duì)菌體的形態(tài)進(jìn)行觀察。革蘭氏鑒定采用KOH法。

1.3.2 16S rDNA序列分析

細(xì)菌基因組DNA提取用酚–氯仿抽提法。根據(jù)Pitcher等[18]的描述稍作改動(dòng): 純菌株接種于2216E培養(yǎng)基, 30℃振蕩養(yǎng)48 h, 5 000 r/min離心10 min后, 棄上清取沉淀, 加入TE緩沖液洗滌2次; 菌體重懸在200 μL TE緩沖液, 加入溶菌酶(25 μg/mL)混勻, 65℃孵育1 h; 加入蛋白酶K(250 μg/mL)和10% SDS 10 μL混勻, 55℃孵育30 min, 溶菌產(chǎn)物暫時(shí)置于冰上。加入抽提液(酚︰氯仿︰異戊醇=25︰24︰1), 輕輕混勻, 此過程進(jìn)行2次, 取水相。加入2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇沉淀。沉淀DNA重溶在無菌水中, –20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增16S rRNA基因, 引物按文獻(xiàn)報(bào)道[19], 在上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成, 序列如下: 27F(5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGCTACCTTGTTACGA CTT-3′)。以94℃預(yù)變性2 min; 94℃ 30 s, 55℃30 s, 72℃ 2 min, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min 程序步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠(含適量的EB)電泳, 用Gene-Genius凝膠成像系統(tǒng)拍照、記錄分析。擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序, 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

根據(jù)獲得16S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast搜索同源序列, 并以BioEdit軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)。通過MEGA 4.0等軟件, 以鄰接法建立系統(tǒng)進(jìn)化樹, Bootstrap置信值估算重復(fù)次數(shù)1 000次。

1.4 菌株的生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酶情況分析

無菌操作將5 μL菌液接種到250 mL 2216E培養(yǎng)基(250 mL錐形瓶)中, 30℃, 120 r/min振蕩條件下培養(yǎng), 10、12、16、20、24、34、36、40、48、58、60、64、68、72 h分別取菌液, 測(cè)定菌液的生物量積聚和菌液上清中的瓊膠酶和褐藻膠酶相對(duì)酶活力。生物量積聚測(cè)定采用分光光度計(jì)法, 即測(cè)定菌液在600 nm處的吸光值。瓊膠酶和褐藻膠酶相對(duì)酶活力測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS法)。

1.5 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

以2216E海水培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基, 分別對(duì)溫度、起始pH、瓊脂粉濃度、褐藻酸鈉濃度四個(gè)主要產(chǎn)酶條件進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn), 其中對(duì)溫度、起始pH、瓊脂粉濃度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)都加入了體積分?jǐn)?shù)為0.15%的褐藻酸鈉, 其他條件相同。其中溫度實(shí)驗(yàn)組為5個(gè)水平, 分別為10、20、25、30、35℃; 起始pH值實(shí)驗(yàn)組為6個(gè)水平, 分別為5、6、7、8、9、10; 瓊脂粉濃度實(shí)驗(yàn)組為6個(gè)水平, 分別為0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%; 褐藻酸鈉濃度實(shí)驗(yàn)組為5個(gè)水平, 分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置三個(gè)平行, 無菌操作將5 μL菌液接種到50 mL 2216E培養(yǎng)基(100 mL錐形瓶)中, 分別在30℃, 120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h后取樣, 測(cè)定菌液的生物量積聚和菌液上清的瓊膠酶和褐藻膠酶相對(duì)酶活力。生物量積聚測(cè)定采用分光光度計(jì)法。瓊膠酶和褐藻膠酶相對(duì)酶活力測(cè)定采用DNS法。

1.6 酶活測(cè)定方法

分別以半乳糖和葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品, 測(cè)定OD520 nm值分別制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。菌液在4℃、5 000 r/min條件下離心15 min后, 取上清作為粗酶液分別測(cè)定菌株胞外瓊膠酶相對(duì)酶活力和褐藻膠相對(duì)酶活力。相對(duì)酶活力測(cè)定在Miller(1959)操作的基礎(chǔ)上稍作改進(jìn)[20], 具體步驟如下: 100 μL的粗酶液分別與100 μL的瓊膠底物溶液/褐藻酸鈉底物溶液(用pH7.6的0.1 mol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液配置)混合均勻, 40℃水浴條件下反應(yīng)30 min, 然后在反應(yīng)體系中加入150 μL DNS混勻, 煮沸5 min后用蒸餾水定容至2.5 mL。以煮沸滅活的上清液做空白對(duì)照測(cè)其在520 nm處的吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定相對(duì)酶活力大小。在上述反應(yīng)條件下每分鐘產(chǎn)生1 μg還原糖的酶量作為一個(gè)酶活力單位, 相對(duì)酶活力為每毫升細(xì)菌培養(yǎng)液的酶活力單位。相對(duì)酶活力(U/mL)=/×1000×/×10,為在波長(zhǎng)為520 nm條件下的吸光值,為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率,為粗酶液稀釋倍數(shù),為反應(yīng)時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與鑒定

從汕頭野生褐藻鼠尾藻藻體中分離獲得一株具有降解瓊膠和褐藻膠能力的高效菌株ST-6。光鏡下形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)該菌株為橢球狀。經(jīng)KOH法鑒別該菌為革蘭氏陰性菌。經(jīng)PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定獲得菌株ST-6的16S rRNA基因序列片度, 長(zhǎng)度為1 399 bp, 該序列的NCBI登錄號(hào)為KY327836。16S rRNA基因相似性分析發(fā)現(xiàn)菌株ST-6的16S rRNA基因與海綿假單胞菌()相似性最高。其中EU603457(EU419930)和AB125367(NR040991)等菌株的相似性為99%, 與NR044415和DQ288951的相似度為97%, 采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 結(jié)果表明菌株ST-6與海綿假單胞菌歸為一類(圖1)。因此, 菌株ST-6鑒定為海綿假單胞菌ST-6。

圖1 菌株ST-6的16S rRNA基因序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 菌株的生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酶情況分析

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

以半乳糖為標(biāo)準(zhǔn)品, 測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2a所示, 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為=3.919 2–0.022 2,2=0.976 8,線性關(guān)系良好, 標(biāo)準(zhǔn)曲線可信度高。因此, 菌株的胞外瓊膠酶相對(duì)酶活力(U/mL) =(+0.022 2)/3.919 2× 1 000×/×10, 式中:為波長(zhǎng)520 nm條件下的吸光值; 0.0222為截距; 3.919 2為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率;為酶液的稀釋倍數(shù);為反應(yīng)時(shí)間。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品, 測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2b所示, 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為=5.917 8-0.030 8,2=0.988 7, 線性關(guān)系良好, 標(biāo)準(zhǔn)曲線可信度高。因此, 菌株的胞外褐藻膠酶相對(duì)酶活力(U/mL) =(+0.030 8)/ 5.917 8× 1 000×/×10, 式中:為520 nm下的吸光值; 0.0308為截距; 5.917 8為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率;為酶液的稀釋倍數(shù);為反應(yīng)時(shí)間。

2.2.2 生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酶情況分析

海綿假單胞菌ST-6的生長(zhǎng)曲線如圖3所示, 結(jié)果表明在2216E培養(yǎng)基、30℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)條件下, 接種后10~48 h為菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 48 h時(shí)后菌株生物量達(dá)到穩(wěn)定, 48~72 h為生長(zhǎng)平穩(wěn)期, 期間OD600 nm值維持在2.02。在海綿假單胞菌ST-6菌株生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)的同時(shí), 對(duì)其所產(chǎn)胞外酶進(jìn)行分析, 結(jié)果表明在生長(zhǎng)指數(shù)期早期, 即接種后20~36 h菌株胞外瓊膠酶相對(duì)酶活力隨時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì), 在接種后36 h達(dá)到最高值為243.51 U/mL。在指數(shù)生長(zhǎng)期后期, 即36~48 h菌株ST-6的胞外瓊膠酶相對(duì)酶活力先下降后上升, 48 h時(shí)達(dá)到最高值為249.15 U/mL。進(jìn)入生長(zhǎng)平穩(wěn)期, 菌株的胞外瓊膠酶相對(duì)酶活力呈下降趨勢(shì), 72 h時(shí)胞外瓊膠酶相對(duì)酶活力有所回升, 為216.38 U/mL。另外, 菌液的褐藻膠酶活也進(jìn)行了測(cè)定, 結(jié)果表明盡管該菌株是以降解褐藻酸鈉進(jìn)行富集篩選獲得的, 但是在以2216E為培養(yǎng)基, 不含褐藻酸鈉的培養(yǎng)條件下, 海綿假單胞菌菌株ST-6不產(chǎn)胞外褐藻膠酶。因在生長(zhǎng)指數(shù)期時(shí), 菌株的胞外瓊膠酶相對(duì)酶活力較高, 故選擇培養(yǎng)時(shí)間為48 h進(jìn)行取樣進(jìn)行下一步產(chǎn)酶條件優(yōu)化研究。

圖3 菌株ST-6生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酶情況分析

2.3 不同培養(yǎng)條件對(duì)海綿假單胞菌ST-6生長(zhǎng)情況的影響

溫度對(duì)海綿假單胞菌ST-6生長(zhǎng)的影響如圖4A, 結(jié)果表明不同溫度對(duì)菌株ST-6的生長(zhǎng)影響顯著, 在25~35℃時(shí), 菌株生長(zhǎng)良好, OD600 nm值為2.00左右。生長(zhǎng)最適溫度為25℃和35℃。10℃時(shí)菌株生長(zhǎng)速度較慢, OD600 nm值僅為1.09。起始pH值對(duì)菌株ST-6生長(zhǎng)的影響如圖4B, 結(jié)果表明不同pH值對(duì)菌株的生長(zhǎng)影響不顯著, 在pH6~9之間菌株的生長(zhǎng)速度快且相近, 分別在1.52~1.75之間。在pH10堿性條件下, 生長(zhǎng)受到抑制, 生長(zhǎng)速度變慢, OD600 nm值僅為1.25。瓊脂粉濃度對(duì)菌株ST-6生長(zhǎng)的影響如圖4C, 瓊脂粉濃度對(duì)菌株的生長(zhǎng)影響不顯著, 瓊脂粉濃度為0.1%~ –0.4%時(shí), 菌株ST-6的生長(zhǎng)狀態(tài)皆較好, OD600 nm值為1.60左右。海藻酸鈉濃度對(duì)菌株ST-6生長(zhǎng)的影響如圖4D, 結(jié)果表明不同起始海藻酸鈉濃度對(duì)菌株的生長(zhǎng)影響不顯著, 在海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%~0.5%之間菌株的生物積聚量相近, OD600 nm值為1.60左右。因此, 海綿假單胞菌ST-6的生長(zhǎng)條件要求寬泛, 溫度為25~ 35℃、pH6-9條件下生長(zhǎng)速度較快, 海藻多糖濃度對(duì)該菌株的生長(zhǎng)影響不顯著。

圖4 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株ST-6生長(zhǎng)情況的影響

圖中不同字母代表在=0.05水平差異顯著, 下同

Different letters in figure represent significant difference at the level of= 0.05. The same as below

2.4 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株ST-6產(chǎn)胞外瓊膠酶的影響

溫度對(duì)菌株ST-6產(chǎn)胞外瓊膠酶的影響如圖5A, 結(jié)果表明不同溫度對(duì)菌株的胞外瓊膠酶相對(duì)酶活力的影響顯著。溫度為30℃時(shí), 菌液的胞外瓊膠酶相對(duì)酶活力最高為179.68 U/mL。其次為溫度20℃時(shí)菌液的胞外瓊膠酶相對(duì)酶活力為152.98 U/mL。起始pH值對(duì)菌株ST-6的產(chǎn)胞外瓊膠酶情況影響如圖5B, 結(jié)果表明不同pH值對(duì)菌株的產(chǎn)酶影響顯著, pH7時(shí)菌液的瓊膠酶相對(duì)酶活力最高為203.40 U/mL, pH8時(shí)為170.00 U/mL。中性pH值利于該菌株產(chǎn)胞外瓊膠酶, 弱酸或弱堿pH值條件都不利于菌株產(chǎn)胞外瓊膠酶。瓊脂粉濃度對(duì)菌株ST-6產(chǎn)酶情況的影響如圖5C, 瓊脂粉濃度對(duì)菌株ST-6的產(chǎn)胞外瓊膠酶的影響顯著, 低濃度的瓊脂粉濃度條件下, 菌液的胞外瓊膠酶相對(duì)酶活力較低。瓊脂粉濃度為0.3%時(shí), 菌液的瓊膠酶相對(duì)酶活力最高為205.96 U/mL。這可能是由于菌株所產(chǎn)的胞外瓊膠酶與瓊脂粉作用, 降解生成單糖或寡糖用于細(xì)菌生長(zhǎng)所需。海藻酸鈉濃度對(duì)菌株ST-6的產(chǎn)瓊膠酶情況影響如圖5D, 結(jié)果表明不同海藻酸鈉濃度對(duì)菌株的產(chǎn)酶影響顯著。當(dāng)海藻酸鈉濃度為0.1%時(shí), 菌液的瓊膠酶相對(duì)酶活力最高為189.36 U/mL; 其次, 當(dāng)海藻酸鈉濃度為0.3%時(shí), 菌液的瓊膠酶相對(duì)酶活力為187.09 U/mL。

2.5 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株ST-6產(chǎn)胞外褐藻膠酶的影響

溫度對(duì)菌株ST-6產(chǎn)胞外褐藻膠酶的影響如圖6A, 結(jié)果表明溫度對(duì)菌株ST-6產(chǎn)胞外褐藻膠酶的影響顯著。最適的產(chǎn)褐藻膠酶溫度為35℃, 菌液的褐藻膠酶相對(duì)酶活力最高為108.43 U/mL。此外, 相對(duì)較低的溫度利于菌株產(chǎn)褐藻膠酶, 在溫度為10~ 20℃時(shí), 菌株ST-6的胞外褐藻膠酶相對(duì)酶活力為是25~30℃酶活的2倍。起始pH值對(duì)菌株ST-6產(chǎn)胞外褐藻膠酶情況影響顯著如圖6B, 結(jié)果表明pH9時(shí)菌液的褐藻膠酶相對(duì)酶活力最高為135.54 U/mL, 其次, pH7時(shí)菌液的褐藻膠酶相對(duì)酶活力為130.67 U/mL。然而, pH8時(shí)菌液的褐藻膠酶相對(duì)酶活力最低為63.72 U/mL。瓊脂粉濃度和褐藻酸鈉濃度對(duì)菌株ST-6產(chǎn)胞外褐藻膠酶情況的影響分別如圖6C和6D, 結(jié)果表明瓊脂粉濃度對(duì)菌液的褐藻膠酶相對(duì)酶活力有影響, 較低的瓊脂粉濃度時(shí), 菌液的褐藻膠酶相對(duì)酶活力較高, 但是最高也僅為26.40 U/mL。褐藻酸鈉濃度對(duì)菌液的褐藻膠酶相對(duì)酶活力影響不顯著, 當(dāng)褐藻酸鈉濃度為0.1%~0.4%時(shí), 菌液的褐藻膠酶相對(duì)酶活力為80.26~85.40 U/mL。

圖5 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株ST-6產(chǎn)胞外瓊膠酶的影響

3 討論

從大型海藻藻體中分離獲得一株具有分泌胞外瓊膠酶和褐藻膠酶的高效細(xì)菌菌株ST-6, 經(jīng)16S rRNA 基因序列分析, 該菌株鑒定為海綿假單胞菌。海綿假單胞菌隸屬于假單胞菌科(Pseudomonadaceae)假單胞菌屬()該菌種菌株多分離自海洋環(huán)境, 有關(guān)該菌種的研究報(bào)道較少[21]。有報(bào)道該菌種的菌株具有降解石油的能力, 尚未見該菌種菌株具有降解海藻多糖的能力[22]。海綿假單胞菌ST-6具有同時(shí)降解瓊膠和褐藻膠的能力, 具有較好的應(yīng)用前景。

通過分析海綿假單胞菌ST-6的生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酶情況監(jiān)測(cè)分析, 發(fā)現(xiàn)該菌株在不添加瓊膠和褐藻膠的2216E培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好, 分泌瓊膠酶, 不產(chǎn)褐藻膠酶, 這表明該菌株的瓊膠酶分泌類型為非誘導(dǎo)型, 而褐藻膠酶分泌類型為誘導(dǎo)型。此外, 菌株在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期后期和生長(zhǎng)平穩(wěn)期早期生物量較高, 而相應(yīng)時(shí)期菌株的胞外瓊膠酶相對(duì)酶活力卻較低, 這可能是由于菌株分泌的瓊膠酶在胞外與底物發(fā)生酶解反應(yīng)生成瓊膠寡糖, 瓊膠寡糖的濃度達(dá)到較高水平反饋抑制了瓊膠酶的分泌, 菌株的代謝機(jī)制及反饋機(jī)制有待深入的研究進(jìn)行闡明。

綜合比較不同培養(yǎng)條件下菌株的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶情況, 結(jié)果表明在不同溫度、起始pH、瓊脂粉濃度和褐藻酸鈉濃度條件下, 菌株的生物量和胞外酶相對(duì)酶活力的變化趨勢(shì)無明顯相關(guān)性。當(dāng)溫度35℃時(shí), 菌株的生長(zhǎng)速度、胞外瓊膠酶相對(duì)酶活力和胞外褐藻膠酶相對(duì)酶活力最高。起始pH為7時(shí)菌株的生長(zhǎng)速度、胞外瓊膠酶相對(duì)酶活力和胞外褐藻膠酶相對(duì)酶活力皆較高。瓊脂粉濃度為0.30%時(shí), 菌株的生長(zhǎng)速度和胞外瓊膠酶相對(duì)酶活力高。褐藻酸鈉濃度為0.1%時(shí), 菌株生長(zhǎng)、胞外瓊膠酶相對(duì)酶活力和胞外褐藻膠酶相對(duì)酶活力較高。在瓊脂粉和褐藻酸鈉兩種多糖皆存在的條件下, 細(xì)胞分泌瓊膠酶量高而褐藻膠酶量較低, 這可能是由于在瓊膠酶和褐藻膠酶分泌及相應(yīng)的寡糖吸收利用的代謝過程中存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系, 瓊膠酶為非誘導(dǎo)型分泌, 瓊膠寡糖可能是菌株的首選碳源底物。

圖6 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株ST-6產(chǎn)胞外褐藻膠酶的影響

在溫度30℃、pH7.6、2216E培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下, 海綿假單胞菌ST-6獲得最高胞外瓊膠酶相對(duì)酶活力為249.15 U/mL。在溫度30℃、pH9和褐藻酸鈉濃度0.15%的培養(yǎng)條件下, 海綿假單胞菌ST-6獲得最高胞外褐藻膠酶相對(duì)酶活力為135.54 U/mL。與報(bào)道的瓊膠降解菌和褐藻膠降解菌相比, 海綿假單胞菌ST-6的產(chǎn)酶能力較高, 該菌株適合作為大型海藻開發(fā)利用的候選菌株進(jìn)行深入研究。

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Isolation identification and enzyme-producing conditions analysis of a seaweed polysaccharides-degrading bacteria

ZHU Da-ling1, TANG Xiao-long2, ZHANG Bao-yu3, YANG Zhen-fang2, WANG Le-pu1, QIN Le-ning1, ZHANG Lei1

(1. Tianjin Key Laboratory of Marine Resources and Chemistry, College of Chemical Engineering and Materials Science, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China; 2. College of Marine and Environmental Science, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China; 3. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

In this study, we isolated a marine agar and alginate-degrading Gram-negative bacterial strain ST-6 from brown seaweed. The results of our 16S rDNA sequence analysis indicate that the similarity was 99% between the strain ST-6 and the strains ofWe classified these strains as a class in phylogenetic trees using the NJ method and identified the strain asST-6. After culturing in a 2216E medium at 30℃, we simultaneously analyzed the biomass accumulation and enzyme production ofST-6. The growth curve results indicate the exponential and stationary growth phases to be 10–48 h and 48–72 h after inoculation, respectively. The enzyme production results indicate that the enzyme activity was higher in the exponential growth phase and that the highest extracelluar agarase relative activity was 249.15 U/mL 48 h after inoculation. In addition, the secretion types of agarase and alginate lyase ofST-6 were non-inducible and inducible, respectively. The optimum growth conditions were a culture temperature of 25–35℃ and initial pH values of 5 and 9, respectively. The optimum agarase-producing conditions were a culture temperature of 30℃, an initial pH value of 7, and an initial agar concentration of 0.30%. The optimum alginate lyase-producing conditions were a culture temperature of 35℃, an initial pH value of 9, and an alginate concentration of 0.30%. We obtained a maximum relative extracelluar alginate lyase activity of 135.54 U/mL in culture conditions with a temperature of 30℃, a pH value of 7, and an alginate concentration of 0.30%.

; agarase activity; alginate lyase activity; 3, 5-Dinitrosalicylic acid colorimetry method; condition optimization of enzyme production.

(本文編輯: 康亦兼)

[the Open Fund of Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, No. 0F2015N015; the Youth Innovation Foundation of Tianjin University of Science and Technology, No. 2015LG10; the Key Technologies R & D Program of Tianjin, No. 15ZXCXSF00040; National Nature Science Foundation, No. 21406169]

Dec. 22, 2016

S944

A

1000-3096(2017)08-0099-09

10.11759/hykx20161222001

2016-12-22;

2017-02-26

青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(0F2015N015); 天津科技大學(xué)青年教師創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2015LG10); 天津市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(15ZXCXSF00040); 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21406169)

朱大玲(1978-), 山東省蓬萊人, 副研究員, 碩士生導(dǎo)師, E-mail: zhudaling@tust.edu.cn