李長玲, 陳健冰, 黃翔鵠

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中心硅藻梅尼小環(huán)藻淡水株和海水株亞顯微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)差異

李長玲, 陳健冰, 黃翔鵠

(廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 廣東 湛江 524088)

本文利用18S rRNA基因?qū)?株經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定的梅尼小環(huán)藻()進(jìn)行了分子鑒定。結(jié)果顯示, 這4株分離自淡水環(huán)境(2株)和海水環(huán)境(2株)的梅尼小環(huán)藻的18S rRNA基因序列基本一致, 并與已經(jīng)報(bào)道的梅尼小環(huán)藻(登錄號(hào)為GQ148712和AY496212)聚為一支, 不同方法所構(gòu)建的系統(tǒng)樹的支持率分別為99%(鄰接法)和98%(最大似然法), 表明這4株來自不同環(huán)境的藻為同一物種——梅尼小環(huán)藻。隨后作者利用掃描電鏡技術(shù)在亞顯微水平上對(duì)這4株梅尼小環(huán)藻進(jìn)行了觀察, 結(jié)果顯示: 梅尼小環(huán)藻淡水株和海水株具有相當(dāng)不同的亞顯微結(jié)構(gòu)特征。生活在海水的梅尼小環(huán)藻藻株具有更大的細(xì)胞以及更多的中央支持突。此外, 本文還對(duì)造成梅尼小環(huán)藻種內(nèi)高水平形態(tài)差異的原因以及18S rRNA基因序列是否可以作為小環(huán)藻屬物種鑒定的分子標(biāo)記做了分析和討論。

硅藻; 梅尼小環(huán)藻(); 亞顯微結(jié)構(gòu); 掃描電鏡; 18S rRNA

梅尼小環(huán)藻()隸屬于硅藻門(Bacillariophyta), 中心藻綱(Centricae), 圓篩藻目(Stephanodiscales), 圓篩藻科(Stephanodiscaceae), 小環(huán)藻屬(), 是一種廣鹽性浮游藻類, 在養(yǎng)殖池塘中較為常見。梅尼小環(huán)藻作為初級(jí)生產(chǎn)者, 在養(yǎng)殖池塘生態(tài)系統(tǒng)的食物鏈中占據(jù)著重要的地位, 同時(shí)也是水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中水質(zhì)調(diào)控的有益藻類[1]。此外, 它在漁業(yè)生產(chǎn)中也非常重要, 是魚、蝦、貝類等經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)動(dòng)物優(yōu)質(zhì)的餌料[2]。梅尼小環(huán)藻還被認(rèn)為是生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和短鏈飽和脂肪酸的優(yōu)良藻株, 在生物能源方面具有一定的開發(fā)潛力[3]。本文利用18S rRNA基因序列對(duì)4株經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定的, 來自淡水和海水的梅尼小環(huán)藻進(jìn)行了分子鑒定, 并用掃描電鏡技術(shù)對(duì)這4株梅尼小環(huán)藻進(jìn)行了亞顯微結(jié)構(gòu)的觀察, 首次在亞顯微水平上對(duì)生長在不同環(huán)境下的梅尼小環(huán)藻進(jìn)行了形態(tài)學(xué)差異比較研究, 以期為梅尼小環(huán)藻進(jìn)一步的開發(fā)研究提供形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)參考。

1 材料和方法

1.1 藻種來源和培養(yǎng)

淡水梅尼小環(huán)藻藻株FACHB-1030、FACHB-1661分離自武漢東湖, 由中國科學(xué)院淡水藻種庫提供(Freshwater Algae Culture Collection at the Institute of Hydrobiology, Wuhan, China, FACHB)。海水梅尼小環(huán)藻藻株GDOU1和GDOU2分離自湛江對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘。

藻種用 250 mL三角瓶中培養(yǎng), 培養(yǎng)光照度為2 000 lx, 光照周期12L︰12D, 培養(yǎng)溫度為22℃。其中, 藻株FACHB-1661、FACHB-1030培養(yǎng)在DM培養(yǎng)基里[4], 藻株GDOU1、GDOU2培養(yǎng)在改良后的f/2海水培養(yǎng)基里[5]。

1.2 DNA提取, PCR擴(kuò)增和測序

總基因組DNA用植物DNA試劑盒(Qiagen, Germany)進(jìn)行提取。18S rRNA基因序列的擴(kuò)增用Taq PCR混合試劑盒進(jìn)行。反應(yīng)體系為25 μL: 12.5 μL Taq mix 2×酶; 上下游引物各1.0 μL (引物保存濃度10 μmol/L); DNA模版1.0 μL; 最后加9.5 μL ddH2O定容到25 μL。PCR循環(huán)擴(kuò)增在iCycler(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)中進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性4 min, 94℃變性30 s, 57℃退火30 s, 72℃延伸2 min共35個(gè)循環(huán), 再72℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測, EB染色, 凝膠成像系統(tǒng)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。隨后用UNIQ-10 DNA純化試劑盒, 根據(jù)使用說明的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行膠純化回收(Sangon, China), 并對(duì)純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆, 克隆成功后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.3 系統(tǒng)學(xué)分析

將測序成功獲得的序列上傳到美國國立生物信息中心(the National Center for Biotechnology Information, NCBI, http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站上, 應(yīng)用Blast搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool, BLAST)對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的基因序列進(jìn)行 Blast相似性比對(duì)分析, 確定目標(biāo)片段是否正確, 同時(shí)進(jìn)行同源性檢測。

根據(jù) Blast 比對(duì)結(jié)果, 從GenBank中下載包括外群在內(nèi)的其他相關(guān)的基因序列用于系統(tǒng)樹構(gòu)建。用Clustal X 1.83[6]進(jìn)行比對(duì), 比對(duì)后的序列用MEGA 5.0軟件手動(dòng)切掉兩端不整齊的冗余序列, 然后進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析, 并采用鄰接法(Neighbor Joining, NJ)和最大似然法(Maximum Likelihood, ML)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 計(jì)算bootstrap值, 重復(fù)1 000次[7]。

1.4 電鏡樣品制備及拍攝

取50 mL左右對(duì)數(shù)生長期的新鮮小環(huán)藻樣品, 3 000 r/min離心10 min, 濃縮成藻泥。硅藻殼的制備是在離心濃縮后的樣品中加入同等體積97%的濃硫酸, 放60℃水浴加熱10~20 min, 直至原生質(zhì)被除掉。之后用蒸餾水清洗5次, 將樣品洗至中性。干燥后鍍金, 用中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院的Hitachi S-4800掃描電子顯微鏡觀察, 拍照。

2 結(jié)果

2.1 基于18S rRNA基因的系統(tǒng)樹構(gòu)建

利用最大似然法和鄰接法構(gòu)建的18S rRNA基因序列的系統(tǒng)樹具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu), 本文僅顯示了以最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu), 如圖1所示。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示: 本次實(shí)驗(yàn)所采用的4株梅尼小環(huán)藻與已經(jīng)報(bào)道過的梅尼小環(huán)藻[8-9](登錄號(hào)為GQ148712、AY496212)聚為一支, 其中鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)樹支持率為99%, 最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)樹支持率為98%。表明這4株來自不同環(huán)境的藻為同一物種——梅尼小環(huán)藻。

圖1 基于18S rRNA基因序列的ML系統(tǒng)樹

內(nèi)部節(jié)點(diǎn)上顯示重復(fù)1 000次計(jì)算的自展支持率, 分別由鄰接法和最大似然法產(chǎn)生。分支的長度代表進(jìn)化距離, 用0.01的標(biāo)尺顯示。具有加粗字體和灰色背景的序列為本研究獲得的新序列

Bootstrap values are shown at the internal nodes for neighbor joining (NJ: 1 000 replications) and maximum likelihood (ML: 1 000 replications), respectively. Branch lengths correspond to evolutionary distances. A distance of 0.01 is indicated by the scale. The new sequences obtained in our study are bold and shaded in gray

2.2 細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)觀察

2.2.1 梅尼小環(huán)藻淡水株的亞顯微結(jié)構(gòu)

生活在淡水的梅尼小環(huán)藻, 直徑范圍在5~25 μm。從小環(huán)藻樣品的外觀來看(圖2中的1和3), 殼面的中央?yún)^(qū)或多或少有點(diǎn)起伏, 中央?yún)^(qū)大小約占?xì)っ嬷睆降?.4~0.6。殼面中央?yún)^(qū)不規(guī)則地分布著小的硅質(zhì)顆粒(Siliceous granules, SG)。邊緣區(qū)域條紋和非條紋區(qū)間隔分布, 圍繞著中央?yún)^(qū), 每5 μm有5~8個(gè)條紋。每個(gè)條紋包含四行網(wǎng)紋從中央?yún)^(qū)與邊緣區(qū)之間的過渡區(qū)域開始逐漸擴(kuò)大到七行延伸到殼套處。在殼面和殼套接合處的非條紋區(qū)存在著刺狀突起(Spine, S)。從內(nèi)部殼面觀來看(圖2中的2和4), 一般情況殼面只有一個(gè)中央支持突(Central fultoportula, cFP), 圍著3個(gè)圍孔。在邊緣區(qū), 有6~13個(gè)殼緣支持突(Marginal fultoportula, mFP)圍繞著2個(gè)圍孔, 位于每一個(gè)或者每兩個(gè)肋脈之間。單一的唇形突(Rimoportula, RP)在向上方向形成一個(gè)長莖和唇形開口。

圖2 梅尼小環(huán)藻淡水株的亞顯微結(jié)構(gòu)

外殼面觀. 1和3; 內(nèi)殼面觀. 2和4; 1和2的比例尺為3 μm, 3的比例尺為5 μm, 4的比例尺為4 μm; SP =刺狀突起; SG =硅質(zhì)顆粒; cFP =中央支持突; mFP =殼緣支持突; RP =唇形突

Exterior of the valves: 1 and 3; Internal views of the valves: 2 and 4. The scale bar: Fig 1 and 2 is 3 μm, Fig 3 is 5 μm, Fig 4 is 4 μm; SP = Spine; SG = Siliceous granules; cFP = central fultoportula; mFP = marginal fultoportula; RP = rimoportula

2.2.2 梅尼小環(huán)藻海水株的亞顯微結(jié)構(gòu)

生活在海水的梅尼小環(huán)藻常以單細(xì)胞存在, 很少形成短鏈(如2~3個(gè)細(xì)胞), 直徑為12~30 μm。在掃描電子顯微鏡下, 從外殼面觀來看(圖3中的5和7), 殼面被分成兩個(gè)完全不同的區(qū)域, 中央?yún)^(qū)域幾乎平整, 可見三開口的中央支持突, 中央?yún)^(qū)占?xì)っ姘霃降?.3~0.5。殼面邊緣區(qū)具有相等長度的條紋, 4行網(wǎng)隙從殼面的中央?yún)^(qū)擴(kuò)增為6行延伸到殼套, 每5 μm 有4~6個(gè)條紋。在殼面和殼套接合處的非條紋區(qū)可以發(fā)現(xiàn)有刺狀突起。從內(nèi)殼面觀來看(圖3中的6和8), 殼面是平滑的, 每個(gè)殼面有3~14個(gè)中央支持突和16~23個(gè)殼緣支持突, 所有這些支持突都向外開口, 并且每一個(gè)支持突都圍繞著3個(gè)圍孔, 具有唇形開口的唇形突, 但并不明顯。

圖3 梅尼小環(huán)藻海水株的亞顯微結(jié)構(gòu)

外殼面觀. 1和3圖; 內(nèi)殼面觀. 2和4圖; 3圖比例尺為10 μm, 其他圖的比例尺為5 μm; SP = 刺狀突起; SG =硅質(zhì)顆粒; cFP =中央支持突; mFP =殼緣支持突

Exterior of the valves: 1 and 3; Internal views of the valves: 2 and 4. Except the scale bar of Fig 3 is 10 μm, others are 5 μm; SP = Spine; SG = Siliceous granules; cFP = central fultoportula; mFP = marginal fultoportula

2.2.3 梅尼小環(huán)藻淡水株與海水株的形態(tài)學(xué)比較

成熟的梅尼小環(huán)藻的海水株與淡水株在形態(tài)學(xué)上有著明顯的不同, 見表1。其中, 海水株的直徑略大于淡水株。每5 μm的條紋數(shù)目, 海水株有4~6個(gè), 而淡水株有5~8個(gè)。海水株邊緣支持突的個(gè)數(shù)要遠(yuǎn)多于淡水株, 可達(dá)16~23個(gè), 一般每一個(gè)或兩個(gè)非條紋區(qū)就有一個(gè)邊緣支持突; 而淡水株的邊緣支持突數(shù)為6~13個(gè), 一般每兩個(gè)或三個(gè)非條紋區(qū)才有一個(gè)邊緣支持突。除此之外, 在邊緣支持突的圍孔數(shù)上兩者也存在著差異, 海水株邊緣支持突的圍孔數(shù)一般為3個(gè); 而淡水株一般為3個(gè), 但也有2個(gè)圍孔數(shù)的邊緣支持突被觀察到。海水株在每個(gè)殼面中央支持突的個(gè)數(shù)也比淡水株多, 一般在2~14個(gè)左右, 而淡水株僅有1個(gè), 但兩者中央支持突的圍孔數(shù)相同, 每個(gè)中央支持突的圍孔數(shù)都為3個(gè)。兩者都存在一個(gè)唇形突, 但海水株的唇形突不明顯。此外, 兩者在殼面和殼套接合處的非條紋區(qū)都存在刺狀突起, 在殼面中央?yún)^(qū)也都不規(guī)則地分布著硅質(zhì)顆粒。

表1 梅尼小環(huán)藻淡水株與海水株的亞顯微結(jié)構(gòu)特征比較

Tab.1 Comparison of the ultrastructures of freshwater and seawater strains of C. meneghiniana

3 討論

硅藻的祖先來自海洋, 但很多時(shí)候它們獨(dú)立地生活在淡水中, 鹽度被認(rèn)為是硅藻分布的一個(gè)屏障。然而, Alverson[10]的研究結(jié)果顯示鹽度屏障也沒有作者先前想象的那么強(qiáng)大, 例如,已經(jīng)被推測作為一個(gè)大枝系, 在海洋, 半咸水和淡水都有生存的物種。海水-淡水轉(zhuǎn)變的方向目前還不清楚, 在歷史事件中, 藻株在海水和淡水之間轉(zhuǎn)變成功的例子非常少, 而且繁殖后代是不可逆的。在淡水和海水中, 或者在這兩個(gè)中間的棲息地都能發(fā)現(xiàn)小環(huán)藻物種, 因此, 小環(huán)藻被稱為“廣鹽性”物種, 以及預(yù)測它可能代表為數(shù)不多由海洋棲息地到淡水轉(zhuǎn)變的分類群的例子[11]。

梅尼小環(huán)藻是“廣鹽性”硅藻物種中最常見的一種[12], 其形態(tài)特征已經(jīng)被很多文獻(xiàn)報(bào)道過[13-17], 但也有將隱秘小環(huán)藻()在形態(tài)學(xué)觀察下錯(cuò)誤的推斷為梅尼小環(huán)藻的報(bào)道[18]。由此可見, 形態(tài)學(xué)特征并不總是小環(huán)藻界定物種和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的可靠指標(biāo), 如果沒有分子水平上的研究, 僅僅依據(jù)顯著的形態(tài)學(xué)差異來鑒定物種, 那么來自淡水和海水的梅尼小環(huán)藻很有可能會(huì)被錯(cuò)誤的鑒定為不同的物種。利用分子生物技術(shù)可以提高作者在硅藻物種的分類和界定研究中發(fā)現(xiàn)和提取細(xì)微差異的能力[19-20], 因此, 作者對(duì)4株經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定為梅尼小環(huán)藻的藻株進(jìn)行了以18SrRNA基因?yàn)榉肿訕?biāo)記的分子鑒定, 用以確定所研究的藻株為梅尼小環(huán)藻無誤, 并在此鑒定的結(jié)果上進(jìn)行形態(tài)學(xué)上的比較研究, 這樣則更有利于人們推斷不同環(huán)境下造成同一種藻不同形態(tài)的原因。

作者研究結(jié)果顯示, 來自不同環(huán)境下的4株梅尼小環(huán)藻有著幾乎完全一致的18S rRNA基因序列, 但卻在亞顯微結(jié)構(gòu)上存在較大的差異。這一結(jié)果與已經(jīng)報(bào)道的另外一個(gè)硅藻物種的情況相似, 而被認(rèn)為是同一物種的不同生態(tài)表型[21]。除此之外, 物種適應(yīng)不同環(huán)境條件的能力與細(xì)胞形態(tài)多變的特征有關(guān), 如Borowitzka等[22]指出,中空泡結(jié)構(gòu)的不同可能是其生活在特定條件的適應(yīng)能力的一個(gè)重要因素。因此, 在不同環(huán)境下(淡水和海水)梅尼小環(huán)藻具有不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)的主要原因作者更傾向于是物種自身對(duì)環(huán)境條件的一種形態(tài)學(xué)響應(yīng)。目前, 作者還無法得知它是如何做出響應(yīng)的。而生活在海水的梅尼小環(huán)藻藻株具有更大的細(xì)胞以及更多的中央支持突, 可能是其生存在高鹽度、不穩(wěn)定環(huán)境的適應(yīng)能力的一個(gè)重要因素。這些研究結(jié)果將會(huì)幫助作者更加準(zhǔn)確地區(qū)分生活在不同環(huán)境下, 形態(tài)不同的同一物種。另一方面, 有研究指出, 18S rRNA基因的DNA序列處于中度保守, 更適合屬水平的系統(tǒng)發(fā)育研究[23]。從本研究的結(jié)果來看, 來源于不同區(qū)域的梅尼小環(huán)藻聚為一支, 并與其他小環(huán)藻屬的物種有著明顯的差異, 如圖1所示, 說明18S rRNA基因序列在小環(huán)藻屬物種間存在明顯的遺傳差異, 有潛力作為小環(huán)藻屬物種鑒定的分子標(biāo)記。但是人們同時(shí)也看到, 針對(duì)于來自不同環(huán)境或區(qū)域的梅尼小環(huán)藻, 種內(nèi)不同株系之間的18S rRNA基因序列遺傳差異非常小, 因此, 18S rRNA基因序列在種內(nèi)不同株系之間顯得過于保守, 可能不適合作為小環(huán)藻種內(nèi)不同株系物種鑒定的分子標(biāo)記。

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(本文編輯: 梁德海)

Ultrastructure of the centric diatom: morphological differences between freshwater and seawater strains

LI Chang-ling, CHEN Jian-bing, HUANG Xiang-hu

(Fisheries College of Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China)

In this paper, four strainswere identified using 18S rRNA gene sequences. The results show that the 18S rRNA gene sequences of these four strains (two come from freshwater and two from seawater) are very similar and that these four strains are closely related to(GQ148712 and AY496212) with high support (99/98 for neighbor joining/maximum likelihood). According to the molecular results, the four strains are of the same species, i.e.,. Then, the ultrastructure of the four strains was studied using scanning electron microscopy (SEM). The results show that the ultrastructure of freshwateris different from that of seawater, which also have larger cells and contain higher amounts of central fultoportula. In addition, this paper analyzed the causes of high-level morphology differences withinspecies and discussed whether the 18S rRNA gene can be used as a molecular marker for the identification ofspecies.

diatom;; ultrastructure; scanning electron microscopy; 18S rRNA

[Marine Fishery Science and Technology and Industry Development Project of Guangdong Province, No.A201508B08]

Dec. 9, 2016

Q179.1

A

1000-3096(2017)08-0116-06

10.11759/hykx20161023002

2016-12-09;

2017-04-01

廣東省海洋漁業(yè)科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)(A201508B08)

李長玲(1964-), 女, 河南焦作人, 教授, 碩士, 主要從事水域生態(tài)學(xué)研究, 電話: 0759-2396044, E-mail: ybcl901@126.com; 黃翔鵠, 通信作者, 教授, 博士, 電話: 0759-2396044, E-mail: hxh166@126.com