楊東敏， 王化敏， 丁鑒鋒、2， 楊鳳、2， 閆喜武、2

越冬期前后菲律賓蛤仔體成分變化研究

楊東敏1， 王化敏1， 丁鑒鋒1、2， 楊鳳1、2， 閆喜武1、2

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023；2.遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116023)

為研究菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum的低溫耐受機制，對采集于大連市金石灘體質(zhì)量為(15.45±1.00)g的越冬期蛤仔生理生化物質(zhì) (結(jié)合水、糖原、甘油、脂肪、脂肪酸和氨基酸)含量的變化進行了檢測。結(jié)果表明:與越冬前相比，越冬期后菲律賓蛤仔的糖原和脂肪含量均顯著降低 (P＜0.05)，甘油含量則顯著升高 (P＜0.05)； 脂肪酸 C18∶0、 C20∶4n－6、 C22∶5n－6和 C22∶5n－3含量顯著降低 (P＜0.05)，C20∶5n－3(EPA)含量顯著升高 (P＜0.05)；異亮氨酸、谷氨酸和賴氨酸含量顯著升高 (P＜0.05)。研究表明，蛤仔體成分的變化與其低溫耐受能力存在密切聯(lián)系，該研究可為菲律賓蛤仔越冬期管理提供理論參考。

菲律賓蛤仔；結(jié)合水；糖原；脂肪酸；氨基酸

菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum屬廣溫、廣鹽性貝類，是中國重要的海洋生物資源，主要棲息于內(nèi)灣、河口和沿海灘涂等區(qū)域[1－4]，在水產(chǎn)品消費、漁業(yè)經(jīng)濟和貿(mào)易等方面占有十分重要的地位。

研究發(fā)現(xiàn)，低溫影響生物體正常的生長和代謝，當(dāng)溫度降低時生物體會通過一系列的適應(yīng)對策減少體液過冷對組織和細胞的損傷。目前，關(guān)于生物抗寒性的研究多見于昆蟲。黃國洋等[5]報道，黃地老虎Agrotis segetum幼蟲的抗寒系統(tǒng)主要由小分子糖、氨基酸、糖蛋白組成。王鵬等[6]研究發(fā)現(xiàn)，桃小食心蟲Carposia niponensis幼蟲在越冬期間，主要由總蛋白、總糖、總脂肪組成抗寒系統(tǒng)以增強其自身防護能力。另有報道表明，耐寒性昆蟲主要通過維持蟲體的過冷卻狀態(tài)以免在越冬期間的嚴寒，而其過冷卻能力的維持與體內(nèi)生化物質(zhì)的種類和含量變化有密切關(guān)系[5－8]。在貝類研究中發(fā)現(xiàn)，越冬期低溫的海水可對貝類養(yǎng)殖造成較大的影響。煙臺海區(qū)曾由于冬季海水溫度變化導(dǎo)致的溶氧和pH降低等造成貝類大量死亡[9]。在蛤仔養(yǎng)殖的研究中，室外培育的蛤仔苗種在越冬期間成活率要遠低于其他時期[1]。對長牡蠣Crassostrea gigas體成分季節(jié)性變化的檢測也發(fā)現(xiàn)，在不同季節(jié)其體成分會發(fā)生相應(yīng)的變化，冬季體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)減少，繁殖過程出現(xiàn)休止期[10]。對貝類的耐低溫研究已有少量報道，福壽螺Pomacea canaliculata在越冬期到來前通過改變體內(nèi)糖原、脂肪、水分、氨基酸和蛋白質(zhì)等成分含量增強其耐寒能力[11－13]，貽貝Mytilus edulis血淋巴中的牛磺酸和丙氨酸已被證實可作為血淋巴的低溫保護劑[14]。在蛤仔的養(yǎng)殖研究中發(fā)現(xiàn)，成體菲律賓蛤仔能在低于零度的海水中存活，表明其體內(nèi)可能具有應(yīng)對低溫條件的機制。目前，國內(nèi)外對菲律賓蛤仔低溫機制的研究尚未見相關(guān)報道，為此，本研究中對菲律賓蛤仔越冬期間體成分的變化及耐低溫機制進行初步探討，旨在為蛤仔越冬抗寒策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用菲律賓蛤仔為大連市金石灘北方野生群體，分別于12月和翌年3月進行采集。選取殼長為 (2.50±0.50)cm、 體質(zhì)量為 (15.45±1.00)g健康且殼型完整的蛤仔進行試驗。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 隨機選取越冬期前、后的蛤仔各35只，放在濾紙上干露24 h，解剖取出軟體部，用于結(jié)合水、脂肪、糖原、甘油、氨基酸和脂肪酸含量測定。

1.2.2 蛤仔體成分指標的測定與計算

(1)結(jié)合水。隨機選取越冬期前、后各10只蛤仔樣品軟體部并稱重記為w；放入烘箱 (60℃)中烘至恒重，稱重記為w1；在105℃下烘至恒重，稱重記為w2。結(jié)合水含量計算公式為

(2)糖原。隨機選取越冬期前、后各10只蛤仔樣品的軟體部，采用冷凍干燥法烘干，研磨成干粉后采用蒽酮比色法進行糖原含量測定，按照南京建成生物工程研究所糖原試劑盒說明書進行操作。

(3)甘油。參考仵均祥[15]的方法并做改進，取0.02 g冷凍干燥的蛤仔粉末放入勻漿器，加入1 mL蒸餾水充分勻漿，再用1 mL蒸餾水沖洗干凈玻璃棒。在室溫下以10 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入10 mL帶塞試管中。取1 mL上清液加蒸餾水稀釋1倍，通過制作標準曲線測定吸光值。計算公式為

(4)脂肪。隨機選取越冬期前、后各10只蛤仔樣品軟體部，放入60℃烘箱烘至恒重，磨成干粉，采用索氏提取法 (GB 5009.6—1985)測定樣品脂肪含量。

(5)脂肪酸。隨機選取越冬期前、后各10只蛤仔樣品新鮮軟體部，放入剪切勻漿機中研碎，采用氣相色譜法 (GB/T5009.168—2003)測定樣品脂肪含量。

(6)氨基酸。取0.03 g經(jīng)冷凍干燥處理的蛤仔干粉，采用酸水解法，使用氨基酸自動分析儀(日立835－50)，測定樣品中的氨基酸含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對試驗結(jié)果進行分析，對蛤仔體成分指標數(shù)據(jù)進行t檢驗，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 越冬期前后菲律賓蛤仔結(jié)合水、糖原、甘油、脂肪含量的變化

從表1可見，與越冬期前相比，越冬期后，蛤仔結(jié)合水含量較略有降低，但無顯著性變化 (P＞0.05)，糖原含量和脂肪含量顯著下降 (p＜0.05)，而甘油含量則顯著升高 (p＜0.05)。

表1 越冬期前后菲律賓蛤仔結(jié)合水、糖原、甘油、脂肪含量的變化Tab.1 Changes in contents of hydration water， glycogen，glycerol and fat in Manila clam Ruditapes philippinarum before and after overwintering

2.2 越冬期前后蛤仔脂肪酸含量變化

蛤仔越冬期前后脂肪酸含量變化如表2所示，在蛤仔體內(nèi)共檢測出19種脂肪酸，其中飽和脂肪酸 (SFA)3種，單不飽和脂肪酸 (MUFA)4種，多不飽和脂肪酸 (PUFA)12種。在越冬期后，其中 C18∶0、 C20∶4n－6、 C22∶5n－6、 C22∶5n－3含量較越冬期前顯著降低 (p＜0.05)， C20∶5n－3(EPA) 含量則顯著升高 (p＜0.05)。

2.3 越冬期前后蛤仔氨基酸含量變化

蛤仔越冬期前后氨基酸含量變化如表3所示，在蛤仔體內(nèi)共檢測出16種氨基酸，在越冬期后，其中賴氨酸、谷氨酸和丙氨酸含量較越冬期前顯著升高 (p＜0.05)，而其他氨基酸含量無顯著性變化(P＞0.05)，且氨基酸總量也無顯著性變化 (P＞0.05)。

3 討論

當(dāng)外界溫度下降時，變溫動物為防止體液過冷對自身產(chǎn)生危害，其體溫調(diào)節(jié)系統(tǒng)會作出反應(yīng)，該系統(tǒng)主要通過抗寒物質(zhì)發(fā)揮作用，如結(jié)合水、甘油、小分子糖、冰核成劑和抗凍蛋白等[12，16]。

3.1 結(jié)合水

通常在冬季時，生物會排出體內(nèi)部分游離水以降低結(jié)冰的危險，而結(jié)合水無滲透活性，增加結(jié)合水的含量有利于抗寒物質(zhì)的積累，從而降低生物的過冷卻點，增強生物的抗寒能力。越冬意蜂Apis mellifera Ligustica Spinola體內(nèi)結(jié)合水含量隨溫度下降而升高，之后隨著溫度升高，在3月時其結(jié)合水含量又恢復(fù)至越冬前水平，這種變化與其過冷卻能力呈正向關(guān)[17]。桃小食心蟲結(jié)繭越冬期含水量無顯著變化，是由于其自由水含量能降低過冷卻點，而裸露幼蟲體內(nèi)含水量過高可能是造成其無法過冬的原因[6]。研究發(fā)現(xiàn)，福壽螺入冬后體內(nèi)一部分自由水轉(zhuǎn)化成結(jié)合水，這種變化過程可能與自由水含量降低有利于耐受低溫環(huán)境有關(guān)[13]。對散大蝸牛Helix aspersa的研究也發(fā)現(xiàn)，其在冬季體內(nèi)的結(jié)合水含量高于秋季[18]。本研究中，蛤仔在越冬期前后結(jié)合水含量無顯著變化，可能與采樣期 (3月)海水溫度已升高蛤仔體內(nèi)結(jié)合水含量恢復(fù)至越冬前水平有關(guān)，但這尚需進一步研究證實。

表2 越冬期前后菲律賓蛤仔脂肪酸含量變化Tab.2 Changes in fatty acid content of Manila clam Ruditapes philippinarum before and after overwintering period %

3.2 生化物質(zhì)成分

越冬生物通常會在體內(nèi)合成和積累抗寒物質(zhì)，脂肪、糖類、甘油等物質(zhì)可以與酶及其他蛋白質(zhì)共同作用起到保護生物系統(tǒng)的作用[6，17]。脂肪、糖原和蛋白質(zhì)分解成的小分子化合物也可直接參與抗寒作用[19]。如脂肪水解出的甘油在生物體內(nèi)發(fā)揮多種作用，不僅能夠儲存飽和脂肪酸并供機體能量代謝需要，還可以結(jié)合糖提供能量，并可以作為PUFA臨時的儲存庫[20－21]。糖原分解的葡萄糖也可為機體提供能量，一些生物體內(nèi)的小分子糖如海藻糖和山梨醇等是較好的抗寒物質(zhì)。這些小分子物質(zhì)的積累還能改變?nèi)苜|(zhì)濃度，降低生物的過冷卻點。游離氨基酸可以參與體內(nèi)能量代謝的過程，也是體內(nèi)蛋白質(zhì)、酶和一些激素的組成成分，在細胞滲透壓調(diào)節(jié)中也可發(fā)揮主要作用，已有研究表明，蛤蜊Macoma balthica體內(nèi)游離氨基酸的種類變化與溫度改變存在某種相關(guān)性[22]。因此，生物體內(nèi)的這些生化物質(zhì)成分可以通過直接或者間接過程參與對低溫的耐受過程，在機體抗寒系統(tǒng)中發(fā)揮作用。

表3 越冬期前后菲律賓蛤仔氨基酸含量變化Tab.3 Changes in amino acid content of Manila clam Ruditapes philippinarum before and after overwintering period %

3.2.1 糖原 糖原在生物體內(nèi)是一種重要的能量儲備物質(zhì)，溫度下降時，機體內(nèi)的糖原會停止積累并開始分解。除了作為能源物質(zhì)外，糖原分解生成的葡萄糖及其轉(zhuǎn)換的海藻糖等小分子碳水化合物，可以調(diào)節(jié)胞內(nèi)外滲透壓，從而穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，減少細胞損傷，海藻糖作為越冬昆蟲體內(nèi)的冷凍保護劑已被多個研究證實[17，23－24]。 Li等[25]研究發(fā)現(xiàn)，美國白蛾Hyphantria cunea在1—3月糖原含量低于12月，而其海藻糖在1—3月卻高于12月，推斷糖原含量降低和海藻糖含量升高有利于機體抗寒能力的增強。在對桃小食心蟲幼蟲的研究中也發(fā)現(xiàn)，在入冬后其體內(nèi)糖原含量逐漸降低[7]。郭靖等[13]對福壽螺的研究發(fā)現(xiàn)，其糖原含量在冬季時高于秋季，可能與其為入冬進行能量儲備有關(guān)。在對其他水生生物的研究中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，山東沿海牡蠣在進入冬季后糖原含量升高，在2月又出現(xiàn)降低的趨勢，表明牡蠣在越冬期前進行糖原儲備并在越冬過程中通過消耗糖原來應(yīng)對低溫環(huán)境[26－27]。本研究中，蛤仔糖原含量在越冬期后顯著降低，初步證實了蛤仔體內(nèi)的糖原在其越冬過程中發(fā)揮了重要的作用。

3.2.2 甘油 甘油 (多元醇)在水中溶解度高，無毒且相容性好，對酶或代謝過程影響較小，且能自由跨膜，是良好的抗寒保護物質(zhì)，它的合成是昆蟲應(yīng)對環(huán)境因子 (特別是低溫)的一種固有模式；而且多元醇的羥基能與水結(jié)合以減少水分流動性，保證體內(nèi)正常代謝的進行，在昆蟲越冬期間起低溫保護劑的作用，其含量高低與昆蟲的抗寒能力呈正相關(guān)[17，28]。甘油一方面可以抑制冰成核劑的生成防止體內(nèi)水分冷凍結(jié)晶；另一方面可以降低生物體液的結(jié)冰點， 增強其對寒冷的耐受能力[11，29－30]。對松阿扁葉蜂幼蟲Acantholyda posticalis Matsumura[31]和亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis[32]的研究發(fā)現(xiàn)，冬季時這兩種昆蟲體內(nèi)甘油含量增加。對福壽螺的研究中也得到了類似結(jié)果，冬季時福壽螺體內(nèi)甘油含量高于秋季，對其進行冷馴化后其體內(nèi)甘油含量也會逐漸升高，表明甘油在福壽螺的低溫耐受過程中發(fā)揮重要作用[11，13]。本研究中，越冬期后蛤仔體內(nèi)甘油含量顯著升高，進一步證實了甘油在蛤仔等貝類體內(nèi)的耐低溫耐機制中發(fā)揮了作用，但具體的作用途徑還需要進一步研究。

3.2.3 脂肪 脂肪不僅是貝類和昆蟲冬季代謝的主要能量來源，還是生物體內(nèi)重要的抗寒物質(zhì)[23，33]。在越冬期間，生物體內(nèi)的游離脂肪能被水解為甘油和脂肪酸，這些物質(zhì)可提高機體的抗寒能力；脂肪分解產(chǎn)物作為生物膜的重要組成成分，在維持細胞的正常生理功能方面具有重要的作用，尤其是在寒冷的海水環(huán)境中，它能維持生物膜正常的流動性和穩(wěn)定性[34]。研究表明，越冬期間昆蟲脂肪含量降低、甘油含量增加有利于增強其抗寒能力[35]。鄭懷平等[36]發(fā)現(xiàn)，扁玉螺Glossaulax didyma在冬季時其體內(nèi)脂肪含量顯著降低。對長牡蠣研究發(fā)現(xiàn)，越冬期內(nèi)其總脂肪含量先降低后升高，而甘油三脂含量先升高后降低，表明體內(nèi)脂肪的轉(zhuǎn)化過程是貝類對低溫環(huán)境的一種反應(yīng)機制[37]。本研究中，蛤仔在越冬期后同樣出現(xiàn)了脂肪含量降低和甘油含量升高的變化過程，可以推測，這兩種物質(zhì)間的變化與抗寒能力存在相互關(guān)系，但還需要進一步驗證，本結(jié)果初步證實了脂肪及其分解產(chǎn)物甘油在貝類越冬過程中具有重要的作用。

3.2.4 脂肪酸 貝類體內(nèi)脂肪酸含量受物種、溫度、餌料、季節(jié)等因素影響[37－38]。對生物來說，機體在溫度改變時，其飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸含量也會隨之變化，這種變化與細胞膜流動性有關(guān)，如n－3脂肪酸對于維持細胞膜的流動性具有重要作用[37，39－42]。 西伯利亞蝗 Aeropus sibiricus在溫度升高時，其體內(nèi)飽和脂肪酸含量升高，不飽和脂肪酸含量降低，細胞膜流動性減弱[43]。此外，脂肪酸也可以提高細胞因子的產(chǎn)生，增強巨噬細胞的吞噬能力，尤其是n－3系列高度不飽和脂肪酸對魚類免疫能力具有重要的調(diào)節(jié)作用[44]。本研究中發(fā)現(xiàn)，蛤仔的飽和脂肪酸 (C18∶0)在越冬期后顯著降低，而不飽和脂肪酸 (n－3脂肪酸、EPA)含量在越冬期后顯著高于越冬期前。這一結(jié)果與對澳洲鮑Haliotis laevigata和Haliotis rubra的研究結(jié)果一致，在進入冬季時，隨溫度降低其肌肉組織中n－3脂肪酸含量升高，SFA含量下降[40]。上述研究結(jié)果表明，貝類體內(nèi)的脂肪酸對其低溫耐受性具有重要作用。n－3脂肪酸含量的升高可能與蛤仔進入越冬期后，體內(nèi)免疫酶活性和細胞流動性減弱有關(guān)，n－3脂肪酸一方面可以提高蛤仔的免疫能力，另一方面可以在溫度降低時保持細胞膜的流動性、降低組織和細胞損傷的程度，因此，n－3脂肪酸可能是蛤仔體內(nèi)一種重要的耐低溫組分。

3.2.5 氨基酸 生物體內(nèi)的氨基酸能夠參與機體對低溫的耐受過程[34]。如金針癭蚊 Eurosta soliddaginis幼蟲的線粒體在冬季低溫條件下可以利用脯氨酸氧化提供能量；昆蟲在冬季低溫環(huán)境下能量代謝途徑發(fā)生了轉(zhuǎn)變，主要通過無氧酵解提供能量，且體內(nèi)多肽和蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物以丙氨酸為主[45]。研究發(fā)現(xiàn)，松阿扁葉蜂和興凱湖紅鰭原鲌Cultrichthys erythropterus體內(nèi)丙氨酸含量均在冬季出現(xiàn)顯著升高的現(xiàn)象[46－47]。在極地海洋魚體內(nèi)的溫滯蛋白中有60%左右的氨基酸殘基是丙氨酸，該蛋白的主要功能是吸附潛在的晶核，其含有的丙氨酸側(cè)鏈甲基具有疏水屏障的作用，可以阻止水分子同晶核結(jié)合[48]。因此，極地海洋魚類體內(nèi)的游離丙氨酸可能參與屏蔽晶核的作用，以降低生物體冰點和過冷卻點，提高其對低溫的適應(yīng)能力。本研究中，蛤仔體內(nèi)的丙氨酸在越冬期后顯著升高，表明丙氨酸在蛤仔的越冬過程中可能也具有降低冰點和冷凍點的作用。動物體內(nèi)的谷氨酰胺在谷氨酰胺酶的作用下，能水解成谷氨酸和氨調(diào)節(jié)體內(nèi)的酸堿平衡，以維持組織和細胞的正常代謝[49]。Duman等[50]在額斑黃胡蜂Vespula maculifrons中提取的冰核蛋白中谷氨酸殘基占20%，冰核蛋白可以誘導(dǎo)昆蟲在遭遇低溫前先進行胞外結(jié)冰，從而減輕細胞損傷和滲透壓脅迫。本研究中蛤仔體內(nèi)谷氨酸含量在越冬期后顯著升高，表明其可能參與到蛤仔的耐低溫過程，但蛤仔體內(nèi)的谷氨酸是否由谷氨酰胺代謝途徑提供以及其在耐低溫過程中的具體作用機制還需進一步研究證實。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在越冬期前后蛤仔體內(nèi)脂肪、糖原、甘油、脂肪酸和氨基酸含量均發(fā)生了顯著變化，這些變化與一些昆蟲及水生生物在越冬過程中的體內(nèi)生化物質(zhì)的變化相一致，表明蛤仔體內(nèi)可能具有類似的耐低溫機制，但其具體的作用機制和途徑還需進一步地深入研究證實。本研究結(jié)果為貝類的耐低溫研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時也可為菲律賓蛤仔越冬期管理提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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Changes in biochemical composition of Manila clam Ruditapes philippinarum before and after overwintering

YANG Dong－min1， WANG Hua－min1， DING Jian－feng1，2， YANG Feng1，2， YAN Xi－wu1，2
(1.College of Fisheries and Life Science， Dalian Ocean University， Dalian 116023， China； 2.Engineering Research Center of Shellfish Culture and Breeding in Liaoning Province， Dalian 116023， China)

The contents of hydration water， glycogen， glycerol， fat， fatty acid and amino acid were determined in wild Manila clam Ruditapes philippinarum with body weight of(15.45±1.00)g collected from Jinshitan Bay in northern China in December(pre wintering)and in March(post wintering)to study cold resistance mechanism of Manila clam.The results showed that there were significantly lower contents of glycogen and fat and significantly higher glycerol levels in clams after overwintering(p＜0.05).The contents of fatty acid including C18:0， C20:4n－6，C22:5n－6and C22:5n－3were significantly decreased after winter(p＜0.05)， while the content of C20:5n－3(EPA)was significantly increased after winter(p＜0.05).The contents of amino acid including isoleucine， glutamic acid and lysine were significantly increased in the clam after overwinter(p＜0.05).These findings indicated that there was a close relationship between the clam biochemical composition and cold resistance，and that provide theoretical reference for the winter management of clam.

Ruditapes philippinarum； hydration water； glycogen； fatty acid； amino acid

5968.31

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.06.010

2095－1388(2017)06－0694－06

2017－03－07

遼寧省教育廳科研計劃項目 (L2014276)

楊東敏 (1990—)，女，碩士研究生。E－mail:ydm9110＠163.com

丁鑒鋒 (1977—)，男，博士，副教授。E－mail:jfding＠dlou.edu.cn