張雪迪，宋悅凡，汪秋寬，何云海，劉舒，任丹丹，武龍，叢?；?/p>

苷苔巖藻聚糖硫酸酯分離純化及結(jié)構(gòu)研究

張雪迪，宋悅凡，汪秋寬，何云海，劉舒，任丹丹，武龍，叢?；?/p>

(大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，國家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心，遼寧水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連116023)

為探究苷苔Ecklonia cava巖藻聚糖硫酸酯粗品 (EC－FUC)的組成結(jié)構(gòu)，以產(chǎn)自韓國濟(jì)州島海岸的苷苔Ecklonia cava中提取的EC－FUC為原料，利用DEAE－Sepharose fast flow陰離子交換層析和Sephacryl S－300、S－400凝膠柱層析對EC－FUC進(jìn)行分離純化及分子量的測定，采用苯酚－硫酸法和明膠－BaCl2法分別測定純化各組分的總糖含量及硫酸根含量，采用高效液相色譜法、紅外光譜法、核磁共振波譜法分別測定各個純化組分的單糖組成并分析多糖結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明:EC－FUC純化后得到ECF－1、ECF－2和ECF－3組分，其總糖含量分別為41.7%、57.79%、75.78%，硫酸根含量分別為3.68%、3.41%、18.03%，回收率分別為6.27%、8.77%、16.19%，其相對分子質(zhì)量分別為16 430、16 430、222 460；ECF－1單糖組成主要為葡萄糖，ECF－2單糖組成主要為甘露糖醛酸、葡萄糖醛酸和巖藻糖，ECF－3單糖組成主要為巖藻糖和葡萄糖醛酸；紅外光譜分析顯示，ECF－1、ECF－2和ECF－3硫酸基主要連接在巖藻糖的C2、C3位置；13C核磁共振分析顯示，ECF－2中存在甘露糖醛酸，ECF－3在17.97×10－6處出現(xiàn)α－L－吡喃巖藻糖C6信號峰。本研究結(jié)果可為苷苔藻聚糖硫酸酯組成結(jié)構(gòu)提供豐富的信息。

苷苔；巖藻聚糖硫酸酯；分離純化；結(jié)構(gòu)分析

巖藻聚糖硫酸酯具有抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、降血壓、調(diào)節(jié)血脂、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和體液免疫力等多種生物活性[1]。巖藻聚糖硫酸酯廣泛存在于褐藻細(xì)胞壁基質(zhì)中，其基本成分為L－巖藻糖和硫酸基團(tuán)，另外還含有半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖、鼠李糖等。其結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣化，相對分子質(zhì)量跨度范圍較大，不同的褐藻種類、生長環(huán)境、生長季節(jié)等均會對巖藻聚糖硫酸酯的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[2]。因此，探究不同褐藻中巖藻聚糖硫酸酯的結(jié)構(gòu)組成和生理活性具有深遠(yuǎn)意義。

苷苔Ecklonia cava隸屬于褐藻門、海帶目、巨藻科、昆布屬[3]，主要生長于韓國濟(jì)州島沿岸潮下帶區(qū)域，可作為傳統(tǒng)食品及民間草藥[4]，每年的2月和5月為其收獲期[5]。研究表明，苷苔巖藻聚糖硫酸酯單糖組成包含巖藻糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖和木糖等[6]，其相對分子質(zhì)量從幾萬至幾十萬不等，具有抗腫瘤、抗凝血[7]、抗氧化[8]、抗炎[5]等生物活性。Kang等[5]研究表明，苷苔巖藻聚糖硫酸酯通過抑制iNOS和COX－2的表達(dá)降低NO的生成，同時降低炎性細(xì)胞因子TNF－α、 IL－6、 IL－1的分泌， 以共同達(dá)到抗炎的作用。Wijesinghe等[7]研究表明，苷苔巖藻聚糖硫酸酯在體外試驗(yàn)中能夠明顯地延長活化部分凝血活酶時間 (APTT)、凝血酶時間 (TT)、凝血酶原時間 (PT)，起到抗凝血作用。

目前，國外對苷苔多糖活性方面的研究較多[5－6，9]，而對多糖的組成及結(jié)構(gòu)分析較少。本研究中，以從國家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心提取的苷苔巖藻聚糖硫酸酯粗品 (EC－FUC)為原料，利用陰離子交換柱層析、凝膠柱層析法進(jìn)行多糖的純化工作，采用高效液相色譜法、紅外光譜法、核磁共振波譜法進(jìn)行多糖的結(jié)構(gòu)探究，旨在豐富巖藻聚糖硫酸酯組成結(jié)構(gòu)信息，為促進(jìn)中國海藻多糖產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用苷苔產(chǎn)自韓國濟(jì)州島海岸，苷苔巖藻聚糖硫酸酯粗品 (EC－FUC)由大連海洋大學(xué)國家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心提供；DEAE－Sepharose fast flow填料、Sephacryl S－300、S－400填料為 Pharmacia進(jìn)口分裝；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品 (Dextran) (相對分子 質(zhì) 量 11 000、 35 000、 45 000、 64 000、76 000、150 000)購自美國Sigma公司；藍(lán)色葡聚糖 (Blue Dextran，type 2000)購自上海伯奧生物科技有限公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品 (巖藻糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸)購自美國Sigma公司；乙腈、甲醇 (色譜純)購自美國Muskegon公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器:SBS－100型數(shù)控計滴自動部分收集器 (上海滬西分析儀器廠)、721型紫外分光光度計 (上海光譜儀器有限公司)、ScientZ－30D型真空冷凍干燥機(jī) (寧波新芝生物科技有限公司)、1260型高效液相色譜儀 (美國 Agilent公司)、Nicolet－470型紅外光譜儀 (美國Nicolet公司)。

1.2 方法

1.2.1 EC－FUC的提取 準(zhǔn)確稱取粉末狀苷苔樣品，加入15倍體積的水混勻，通過復(fù)合酶解法提取EC－FUC，98℃下水浴3 h，冷卻至室溫，離心取上清液。經(jīng)由四步醇沉法[10]，制得EC－FUC。

1.2.2 DEAE－Sepharose fast flow陰離子交換柱分離純化 稱取0.4 g EC－FUC溶解于20 mL 0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液 (pH 7.4)中，加載至DEAE－Sepharose fast flow陰離子交換柱 (300 mm×26 mm)進(jìn)行粗多糖的分離純化。利用0～2.5 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫流速為0.75 mL/min。利用自動部分收集器進(jìn)行多糖收集，每管收集3 mL。通過苯酚－硫酸法監(jiān)測每管中總糖含量，于490 nm波長處比色并繪制吸收曲線，多次收集并合并各個峰的多糖樣品，透析、冷凍干燥、密封、避光保存。

1.2.3 總糖含量的測定 采用苯酚硫酸法[11－12]，稱取待測樣品，用去離子水溶解配制成一定濃度的多糖溶液。配制L－巖藻糖和D－半乳糖 (3∶1)標(biāo)準(zhǔn)品溶液和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以標(biāo)準(zhǔn)品糖含量(mg)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，通過苯酚硫酸法繪制L－巖藻糖和D－半乳糖 (3∶1)標(biāo)準(zhǔn)曲線和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法測定待測樣品的吸光值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中總糖含量。

1.2.4 硫酸根含量的測定 采用明膠 BaCl2法[11－12]，稱取待測樣品，利用鹽酸進(jìn)行酸解，經(jīng)活性炭脫色處理后收集濾液，調(diào)節(jié)pH，定容于50 mL容量瓶中。配制一定濃度的K2SO4標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制硫酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線測定待測樣品的吸光值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中硫酸根含量。

1.2.5 巖藻聚糖硫酸酯純度的測定 因巖藻聚糖硫酸酯單糖組成中的巖藻糖攜帶有一定質(zhì)量的硫酸基團(tuán)，故以總糖質(zhì)量百分?jǐn)?shù)與硫酸基質(zhì)量百分?jǐn)?shù)之和定義為巖藻聚糖硫酸酯純度，其計算公式為

1.2.6 Sephacryl S－300、 S－400 凝膠柱層析分離純化[11－12]裝填 Sephacryl S－300、 S－400 凝膠柱(1.6 cm×100 cm)， 用 15 mmol/L Tris－HCl緩沖溶液 (pH 7.4)平衡32 h。利用藍(lán)葡聚糖 (相對分子質(zhì)量為2 000 000)測定凝膠柱的外水體積，用相對分子質(zhì)量為11 000、35 000、76 000的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品繪制Sephacryl S－300 lgM－Kav分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線；用相對分子質(zhì)量為45 000、64 000、150 000的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品繪制Sephacryl S－400 lgM－Kav分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取20 mg經(jīng)過DEAE－Sepharose fast flow分離純化后的多糖組分，溶于1 mL 15 mmol/L的Tris－HCl緩沖溶液 (pH 7.4)中，分別加載于凝膠柱中進(jìn)行分離純化，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線估算各純化多糖組分的分子量。分配系數(shù) (Kav)的計算公式為

其中:Ve為洗脫體積 (mL)；Vo為外水體積(mL)；Vt為總體積 (mL)。

1.2.7 用高效液相色譜法分析單糖組成 稱取干燥至恒重的單糖標(biāo)準(zhǔn)品 (甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸)共20 mg，定容至10 mL。稱取待測樣品20 mg溶解于超純水中，潤漲過夜。利用三氟乙酸(TFA)溶液酸解，水解后的樣品進(jìn)行柱前1－苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮 (PMP)衍生化反應(yīng)，衍生化反應(yīng)終止后利用三氯甲烷反復(fù)萃取，除去溶液中的有機(jī)相，將剩余的水相經(jīng)過0.45 μm的水系膜過濾，進(jìn)行高效液相色譜分析。

分析條件:色譜柱，Agilent ZORBAX Eclipse XDB C－18(5 μm， 4.6 mm×250 mm)， 柱溫 30℃；流動相 A，15%乙腈 (體積分?jǐn)?shù))＋50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液 (pH 6.0)；流動相 B，40%乙腈＋50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液 (pH 6.0)；時間設(shè)為0、10、55、65 min；對應(yīng)的緩沖液濃度設(shè)為100%、85%、50%、100%；流速為1 mL/min，紫外檢測波長為250 nm，進(jìn)樣體積為20 μL。

1.2.8 傅里葉紅外光譜分析 取待測樣品2 mg，加入適量干燥后的溴化鉀反復(fù)研磨均勻，壓制成透明均勻的薄片。利用Nicolet－Nexus 470傅里葉變換紅外光譜儀，掃描400～4000 cm－1波長范圍內(nèi)的光譜吸收值。

1.2.913C核磁共振波譜分析 將純化后的樣品利用Bruker AVANCE III核磁共振波譜儀進(jìn)行分析，在工作頻率為500 MHz、溫度為25℃的條件下，進(jìn)行13C NMR核磁共振分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DEAE－Sepharose fast flow陰離子交換柱分離 EC－FUC

由DEAE－Sepharose fast flow陰離子交換柱分離EC－FUC的結(jié)果如圖1所示，EC－FUC經(jīng)純化后得3個組分，分別命名為ECF－1、ECF－2、ECF－3。從圖1可見:ECF－1為流出峰，ECF－2、ECF－3為鹽梯度洗脫峰；ECF－1、ECF－2兩個峰無拖尾現(xiàn)象，分離效果較好，ECF－3有拖尾現(xiàn)象發(fā)生。

圖1 巖藻聚糖硫酸酯梯度洗脫曲線Fig.1 Gradient elution curve of fucoidan

ECF－1、 ECF－2、 ECF－3的組成特性如表1所示。ECF－1總糖含量通過葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，ECF－2、ECF－3總糖含量通過L－巖藻糖和D－半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算。從表1可見:純化得到的ECF－1、ECF－2組分均為低硫組分，硫酸基含量分別為3.68%、3.41%，ECF－3中硫酸基含量最高，為18.03%；純化組分ECF－3中總糖含量也最高，為75.78%，ECF－1中總糖含量最低，為41.7%。其中，ECF－3中總糖含量、硫酸基含量均較高，巖藻聚糖硫酸酯純度為93.81%。

表1 各組分理化性質(zhì)分析Tab.1 Physical and chemical properties of each fraction %

2.2 Sephacryl S－300、 S－400 凝膠柱層析

由DEAE－Sepharose fast flow陰離子交換柱分離的 ECF－1、 ECF－2、 ECF－3進(jìn)一步由 Sephacryl S－300、S－400凝膠柱層析進(jìn)行純化。由于ECF－3經(jīng)過Sephacryl S－300純化后的洗脫體積與外水體積一致，根據(jù)其相對分子質(zhì)量分布情況，通過Sephacryl S－400估算ECF－3的相對分子質(zhì)量，通過 Sephacryl S－300估算 ECF－1、 ECF－2的相對分子質(zhì)量，結(jié)果如圖2所示。由圖2－A、圖2－B可見， ECF－1、 ECF－2經(jīng)過 Sephacryl S－300分離純化后均為單一峰，說明組成成分單一；由圖2－C可見，ECF－3經(jīng)過Sephacryl S－400分離純化后峰形單一，說明分離純化效果較好，相對分子質(zhì)量組成單一。依據(jù)lgM－Kav葡聚糖相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線計算ECF－1、ECF－2和ECF－3各組分的相對分子質(zhì)量分別為16 430、16 430、222 460。

圖2 Sephacryl S－300、 S－400層析色譜圖Fig.2 Elution of Sephacryl S－300 and S－400 column chromatography

2.3 單糖組成分析

標(biāo)準(zhǔn)品單糖液相色譜圖如圖3所示。EC－FUC經(jīng)過分離純化后進(jìn)行高效液相色譜分析，結(jié)果如圖4所示。從圖4可見:ECF－1單糖組成主要為葡萄糖 (Glu)，ECF－2單糖組成主要為甘露糖醛酸(Man－UA)、葡萄糖醛酸 (Glu－UA)和巖藻糖(Fuc)，ECF－3單糖組成主要為巖藻糖 (Fuc)、葡萄糖醛酸 (Glu－UA)。從表2可見:ECF－1中葡萄糖 (Glu)含量高達(dá)84.69%，巖藻糖 (Fuc)含量較低，為2.61%，分析該組分為褐藻淀粉；ECF－2的高效液相色譜圖中在甘露糖左側(cè)附近出現(xiàn)強(qiáng)烈的吸收峰，估計為甘露糖醛酸所致[13]，該組分結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有待進(jìn)一步分析；ECF－3中巖藻糖(Fuc)、葡萄糖醛酸 (Glu－UA)、甘露糖 (Man)和半乳糖 (Gal)含量較高，分別為 37.47%、22.64%、14.14%和12.83%，該組分為富含巖藻糖的巖藻聚糖硫酸酯。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品單糖液相色譜圖Fig.3 High performance liquid chromatography(HPLC)of mixed standard of monosaccharides

圖4 ECF－1、 ECF－2、 ECF－3高效液相色譜圖Fig.4 High performance liquid chromatography(HPLC)of fractions ECF－1， ECF－2 and ECF－3

2.4 紅外光譜分析

經(jīng)過純化后對EC－FUC各組分進(jìn)行紅外光譜分析，結(jié)果如圖5所示。ECF－1、ECF－2、ECF－3在3600～3300 cm－1處出現(xiàn)吸收峰，為O－H伸縮振動峰和糖類紅外光譜的特征吸收峰。ECF－1、ECF－2、 ECF－3 分別在 2933 cm－1、 2935 cm－1和2942 cm－1附近出現(xiàn)吸收峰，為C－H伸縮振動峰和巖藻糖中甲基的特征吸收峰。ECF－2、ECF－3均在1610 cm－1和1417 cm－1附近出現(xiàn)明顯的吸收峰，這是由于C＝O非對稱和對稱伸縮振動引起的[2，14]，說明ECF－2和ECF－3中均含有糖醛酸組分，與ECF－2、ECF－3單糖組成中含有葡萄糖醛酸一致，ECF－2相比ECF－3的吸收峰強(qiáng)烈，但葡萄糖醛酸含量低于ECF－3，說明EFC－2中不僅含有葡萄糖醛酸，還有其他糖醛酸存在。由于高效液相色譜無法分析甘露糖醛酸組分，因此，推斷ECF－2高效液相色譜圖甘露糖左側(cè)的強(qiáng)烈吸收峰為甘露糖醛酸所致。 ECF－1、 ECF－2、 ECF－3均在 1072～1033 cm－1附近出現(xiàn)明顯的吸收峰，為C－O的伸縮振動峰[15－16]。 ECF－3 在 1253 cm－1附近出現(xiàn) S＝O 強(qiáng)吸收峰。 ECF－1、 ECF－2、 ECF－3 均在 820 cm－1附近出現(xiàn)吸收峰，為C－O－S伸縮振動 (赤道配位)，說明硫酸基連接在巖藻糖的C2、C3位置上，是平伏鍵上的硫酸根[2]。

表2 各組分單糖組成比例Tab.2 Composition ratios of neutral monosaccharide in each fraction %

圖5 ECF－1、 ECF－2、 ECF－3紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectra of fractions ECF－1， ECF－2 and ECF－3

圖6 ECF－1、 ECF－2、 ECF－313C 核磁共振譜圖Fig.6 13C NMR spectra of fractions ECF－1， ECF－2 and ECF－3

2.5 核磁共振碳譜分析

經(jīng)過分離純化后對EC－FUC各個組分的13C核磁共振波譜分析，結(jié)果如圖6所示。從圖6可見:ECF－3在 (16～18) ×10－6附近出現(xiàn)明顯的巖藻糖C6信號峰，而 ECF－1、ECF－2在高場區(qū)無信號峰，說明ECF－3中巖藻糖含量最高，與液相色譜分析的單糖組成結(jié)果一致；ECF－2、ECF－3在(175～185) ×10－6附近出現(xiàn)明顯的信號峰，為羰基碳的信號峰， 且ECF－3在 (22～23) ×10－6處出現(xiàn)信號峰，為乙?；谆嫉男盘柗澹f明ECF－2、ECF－3中糖醛酸含量較高。ECF－2的13C NMR圖譜與Zvyagintseva等[17]研究中翅藻Alariamarginata甘露糖醛酸的13C NMR圖譜一致，推斷ECF－2單糖組成中含有甘露糖醛酸，與紅外光譜分析結(jié)果一致。ECF－1異頭碳 C1化學(xué)位移為105.21×10－6，說明多糖通過β型糖苷鍵連接，與褐藻淀粉糖苷鍵結(jié)構(gòu)一致。ECF－3在 (65～80) ×10－6區(qū)域呈現(xiàn)較多的信號峰，與ECF－3具有較高的硫酸根含量相關(guān)，說明該區(qū)域的取代基較多，也可能是較高的乙?；〈鶎?dǎo)致的。

3 討論

3.1 EC－FUC的單糖組成

巖藻聚糖硫酸酯具有多種生物活性，這與其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜多樣性密切相關(guān)，目前，關(guān)于巖藻聚糖硫酸酯的組成及結(jié)構(gòu)研究較多。張海霞等[18]利用DEAE－Sepharose fast flow陰離子交換柱分離純化馬尾藻褐藻多糖硫酸酯，得到 F0、F1兩個組分。F0、F1單糖組成為甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖。于龍等[19]從北大西洋瓜參體壁中提取巖藻聚糖硫酸酯，其單糖組成為巖藻糖、半乳糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖，物質(zhì)的量比為1∶0.22∶0.07∶0.07。李國瑩等[20]采用高壓均質(zhì)和復(fù)合酶結(jié)合的方法提取海帶巖藻聚糖硫酸酯，利用IC－PAD檢測巖藻聚糖硫酸酯單糖組成，主要為巖藻糖、半乳糖、甘露糖，其中，巖藻糖含量最高，為42.81%。盧茳虹[21]對海帶多糖LJPA－P進(jìn)行分離純化，得到 LJPA－P1、LJPAP2、 LJPA－P3 3個組分， LJPA－P1、 LJPA－P2單糖組成主要為鼠李糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，LJPA－P3的單糖組成為半乳糖、巖藻糖、甘露糖。本研究中，苷苔巖藻聚糖硫酸酯純化得到 ECF－1、ECF－2、ECF－3 3個組分，ECF－1單糖組成主要為葡萄糖，分析該組分為褐藻淀粉；ECF－2單糖組成主要為甘露糖醛酸、葡萄糖醛酸和巖藻糖，分析該組分可能為聚甘露糖醛酸片段與巖藻聚糖硫酸酯的混合物，或者為聚甘露糖醛酸片段與巖藻糖片段通過糖苷鍵連接的多糖大分子；ECF－3單糖組成主要為葡萄糖醛酸和巖藻糖，該組分為巖藻聚糖硫酸酯。說明不同藻種中巖藻聚糖硫酸酯純化組分及單糖組成存在一定差異。

3.2 EC－FUC的紅外光譜

郭峰君等[2]通過離子交換柱法對海帶巖藻聚糖硫酸酯粗糖進(jìn)行純化，對純化組分F3、F4、F5進(jìn)行紅外光譜分析，3個組分均在1259 cm－1附近出現(xiàn)S＝O強(qiáng)吸收峰，在818 cm－1附近出現(xiàn)C－O－S赤道配位伸縮振動。硫酸根與多糖的連接位置與C－O－S伸縮振動位置相關(guān)，851 cm－1附近的吸收峰由連接在巖藻糖C4位置的直立鍵硫酸根形成，820 cm－1附近的吸收峰由連接在巖藻糖C2、C3位置的平伏鍵硫酸根形成。姜龍等[13]通過紅外光譜分析純化組分表明:SPF1在820 cm－1處出現(xiàn)吸收峰，說明硫酸基團(tuán)連接在巖藻糖C2、C3位置；SPF2、 SPF3、 SPF4 分別在 860、 855、 848 cm－1處出現(xiàn)吸收峰，說明硫酸基團(tuán)主要連接在巖藻糖C4位置。 本研究中， ECF－1、 ECF－2、 ECF－3均在820 cm－1附近出現(xiàn)吸收峰，說明硫酸基連接在巖藻糖的C2、C3位置上。這與Wijesinghe等[7]監(jiān)測的硫酸基連接位置一致。

3.3 EC－FUC的核磁共振碳譜

盛家榮等[22]在多糖提取、分離和結(jié)構(gòu)分析中提及糖苷鍵構(gòu)型分析，在13C核磁共振分析中，α型糖苷鍵連接的C1化學(xué)位移為(97～101)×10－6，β型糖苷鍵連接的C1化學(xué)位移為(103～105)×10－6，對甘露聚糖不能通過此方法判斷糖苷鍵構(gòu)型。李麗迪[12]通過核磁共振分析厚葉海帶巖藻聚糖硫酸酯純化組分，13C譜圖分析表明，(96～105)×10－6為 C1 信號峰， (16～18)× 10－6為巖藻糖C6信號峰， (68～84)×10－6為硫酸基取代信號峰。本研究中，ECF－1異頭碳C1化學(xué)位移為105.21×10－6， 說明糖苷鍵為 β 型。 ECF－2、 ECF－3均在177×10－6附近出現(xiàn)信號峰，表明純化組分中糖醛酸含量較高； ECF－3在17.97×10－6附近出現(xiàn)明顯的信號峰，其為α－L－型吡喃巖藻糖C6信號峰。

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Purification and characterization of fucoidan extracted from brown seaweed Ecklonia cava

ZHANG Xue－di， SONG Yue－fan， WANG Qiu－kuan， HE Yun－h(huán)ai，LIU Shu， REN Dan－dan， WU Long， CONG Hai－h(huán)ua
(College of Food Science and Engineering，Nation R ＆ D Branch Center For Seaweed Processing，Key and Open Laboratory of Aquatic Product Processing and Utilization of Liaoning Province， Dalian Ocean University， Dalian 116023， China)

Crude polysaccharide was separated from fucoidan(EC－FUC)extracted from brwn seaweed Ecklonia cava sampled from coast of Cheju Island in R.O.Korea by DEAE－Sepharose fast flow anion exchange chromatography， and future purified by Sephacryl S－300， S－400 gel column chromatography.The molecular weight and content of polysaccharide and sulfate of the EC－FUC were determined by phenol sulfuric acid method and BaCl2gelatin method， respectively.High performance liquid chromatography， infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance spectroscopy were used to analyze the structural characterization of purified components.The results showed that the purified EC－FUC was comprised of three peaks including ECF－1 with total polysaccharide of 41.7%and sulfate content of 3.68%，ECF－2 with total polysaccharide of 57.79%and sulfate content of 3.41%，and ECF－3 with total polysaccharide of 75.78%，and sulfate content of 18.03%.The yields were 6.27%in ECF－1，8.77%in ECF－2 and 16.19%in ECF－3， with molecular weight of 16 430 in ECF－1， 16 430 in ECF－2 and 222 460 in ECF－3.The primary monosaccharide was shown to be glucose in ECF－1， mannuronic acid， glucuronic acid and fucose in ECF－2， and glucuronic acid and fucose in ECF－3.Infrared spectrum analysis revealed that the sulfated group was combined to C2 or C3 in the three fractions and13C nuclear magnetic resonance(NMR)analysis indicated that there was mannuronic acid in ECF－2 and that 17.97×10－6regions of ECF－3 was assigned to C6 α－L－fucopyranose.

Ecklonia cava； fucoidan； isolation and purification； structural analysis

Q954.4

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.06.016

2095－1388(2017)06－0740－07

2017－04－18

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (31471610)；國家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng) (201405040)

張雪迪 (1993—)，女，碩士研究生。E－mail:1071359444＠qq.com

汪秋寬 (1962—)，女，教授。E－mail:wqk320＠dlou.edu.cn