袁振杰,陳秋月,姜運(yùn)良,唐 輝,李顯耀,康 麗*

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院與動物醫(yī)學(xué)院,山東 泰安 271018 2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,山東 泰安 271018

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）已廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)方面的研究。在qRT-PCR應(yīng)用中，由于不同樣品間RNA的初始量、cDNA合成效率以及PCR反應(yīng)擴(kuò)增效率等存在差別，從而影響目標(biāo)基因表達(dá)差異的準(zhǔn)確性，因此，需要引入穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因予以校正[1]。常用的內(nèi)參基因多為持家基因，如18S核糖體RNA基因（18S rRNA）、beta-肌動蛋白基因（β-actin）和3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）等。然而，近年來的研究表明，在不同類型細(xì)胞、組織器官、不同實(shí)驗(yàn)處理?xiàng)l件及相同組織的不同發(fā)育階段等情況下，持家基因的表達(dá)量并非總是恒定的[2]。因此，在特定目標(biāo)基因表達(dá)研究中對候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)，篩選出最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因，是保證研究結(jié)果真實(shí)可靠的關(guān)鍵。

家禽的繁殖性狀受下丘腦-垂體-性腺軸（Hypothalamus-pituitary-gonad,HPG)的調(diào)控，目前，對于雞性腺軸上功能基因的表達(dá)研究較多，但用于內(nèi)參的持家基因其組織表達(dá)穩(wěn)定性尚不清楚。因此，本研究利用qRT-PCR方法檢測雞性發(fā)育過程中下丘腦和卵巢組織中常用內(nèi)參基因的表達(dá)，并采用geNorm、NormFinder和Bestkeeper軟件對這些基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析，篩選出用于雞性腺軸上基因表達(dá)研究最合適的內(nèi)參基因。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動物

分別隨機(jī)選取30 d、60 d、90 d、100 d、110 d、140 d未開產(chǎn)和140 d開產(chǎn)的濟(jì)寧百日雞各4只，頸靜脈放血處死后取下丘腦和卵巢組織，迅速投入液氮并保存。試驗(yàn)所用雞只遺傳背景相同，采用相同的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件，自由采食、自由飲水、自然光照。

1.2 RNA提取和cDNA合成

使用總RNA提取試劑盒（天根，北京）提取不同發(fā)育階段雞下丘腦和卵巢組織RNA，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，并用紫外分光光度計(jì)（Eppendorf,Hamburg,Germany）檢測總RNA濃度和純度，A260/280=1.8～2.0，RNA于－80°C保存?zhèn)溆谩?/p>

cDNA合成采用PrimerScript RT reagent Kit（TaKaRa，大連）反轉(zhuǎn)錄試劑盒，具體操作按說明書，取1μL總RNA，以O(shè)ligo-dT18為引物，完成一鏈cDNA的合成，并于－20°C保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，使用DNAMAN 6.0軟件，分別設(shè)計(jì)GAPDH、β-actin和18S rRNA基因的定量PCR引物（見表1），并由上海生物工程有限公司合成。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測所用候選內(nèi)參基因的引物信息Table 1 Primer information of candidate reference genes used in qRT-PCR

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）反應(yīng)在Stratagene Mx3000P熒光定量PCR儀上，按照Takara的SYBR premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進(jìn)行，模板、引物濃度及退火溫度等經(jīng)過摸索獲得最佳反應(yīng)條件如下：PCR反應(yīng)體系為15μL包括cDNA模板1.5μL，上下游引物各0.2μL，2×SYBR Premix Ex TaqTM Buffer 7.5μL，RoxII0.3μL，ddH2O 補(bǔ)足至 15μL；PCR 反應(yīng)程序?yàn)?95°C 預(yù)變性 5 min；95°C變性30 s，56°C退火30 s，72°C延伸25 s；在延伸階段收集熒光信號強(qiáng)度，共40個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析：95°C 1 min；58°C 30 s，95°C，30 s，58～95°C每個(gè)循環(huán)全程采集熒光信號1次。每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù)，儀器自帶軟件自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線，3個(gè)基因的溶解曲線均為單一峰，說明內(nèi)參基因引物特異性好，無引物二聚體和非特異條帶擴(kuò)增。獲得3個(gè)內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)變化范圍為0.996～0.998，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的擴(kuò)增效率為97.3～100.8%。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用2-△Ct（△Ct=各樣本Ct值?最小Ct值）方法計(jì)算各基因表達(dá)的相對定量數(shù)據(jù)，用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件對3個(gè)內(nèi)參基因在濟(jì)寧百日雞不同發(fā)育時(shí)期下丘腦和卵巢中的Ct值變化趨勢以及表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)參基因Ct值比較

qRT-PCR中，Ct值的大小反應(yīng)了基因表達(dá)的豐度，Ct值越小，基因表達(dá)量越高；反之，Ct值越大，基因表達(dá)量越低。在同一組織中每個(gè)持家基因所用每個(gè)cDNA模板量均相同，比較三個(gè)基因的Ct值發(fā)現(xiàn)，雞性發(fā)育過程中每個(gè)內(nèi)參基因在下丘腦和卵巢組織的表達(dá)水平均有一定的變化。如圖1所示，在卵巢中β-actin的Ct值最?。ㄖ形粩?shù)=17.01），表明其表達(dá)量最高，18S rRNA和GAPDH兩個(gè)基因表達(dá)量相對偏低（中位數(shù)分別為17.77，17.86），而在下丘腦組織中，18S rRNA的Ct值最?。ㄖ形粩?shù)=16.83），說明其在下丘腦中表達(dá)豐度最高，其次是GAPDH（中位數(shù)=19.85），β-actin表達(dá)量最低（中位數(shù)=20.44）。這也表明三個(gè)內(nèi)參基因在雞卵巢和下丘腦組織中的表達(dá)量存在差異。

圖1 各內(nèi)參基因在下丘腦和卵巢組織中Ct值比較Fig.1 The Ct values comparison analysis of every reference gene in hypothalamus and ovary tissue

分別對三個(gè)內(nèi)參基因在30 d、60 d、90 d、100 d、110 d、140 d未開產(chǎn)和140 d開產(chǎn)濟(jì)寧百日雞7個(gè)不同發(fā)育階段下丘腦及卵巢組織中，所有樣本的Ct值變化分析發(fā)現(xiàn)，不同基因間Ct值最大值（max）和最小值（min）（見表2，表3）的差值大?。O差）存在差異，這個(gè)差值越大，說明該基因在各個(gè)樣本間表達(dá)的均一程度越差，在下丘腦中各基因極差值由小到大為18S rRNA（1.85）＜GAPDH（2.76）＜β-actin（3.89）；在卵巢中各基因極差值由小到大為18S rRNA（3.79）＜GAPDH（4.29）＜β-actin（4.37），但無論在下丘腦還是卵巢組織，β-actin的Ct值極差均表現(xiàn)為最大。

在基因定量表達(dá)分析中，有時(shí)需要同時(shí)選擇多個(gè)內(nèi)參基因，分析基因間的表達(dá)相關(guān)性，可為多個(gè)內(nèi)參基因的選擇提供依據(jù)。分別對三個(gè)內(nèi)參基因在卵巢及下丘腦組織中表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示，在下丘腦中，β-actin與GAPDH的相關(guān)性也最高（相關(guān)系數(shù)=0.86），而18S rRNA與GAPDH和β-actin的相關(guān)性均較低（相關(guān)系數(shù)=0.42）。在卵巢中，β-actin與GAPDH的相關(guān)性最高（相關(guān)系數(shù)=0.76），18S rRNA與GAPDH的相關(guān)性最低（相關(guān)系數(shù)=0.25）。

2.2 geNorm軟件分析

通過2–△Ct算法將qRT-PCR得到的Ct值轉(zhuǎn)換成對應(yīng)的表達(dá)量并輸入geNorm程序，然后計(jì)算基因表達(dá)穩(wěn)定度M值，并對內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定度進(jìn)行排序，M值越小，基因表達(dá)越穩(wěn)定。結(jié)果由圖3可知，三個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性從大到小排序?yàn)椋合虑鹉X中GAPDH(0.599)＞β-actin（0.710)＞18S rRNA（0.789）；卵巢中β-actin（1.070)＞GAPDH（1.292）＞18S rRNA（1.395)。說明不同發(fā)育時(shí)期濟(jì)寧百日雞的下丘腦中GAPDH表達(dá)穩(wěn)定性最好，而在卵巢中β-actin的表達(dá)最為穩(wěn)定。

圖3 ge Norm軟件分析內(nèi)參基因在發(fā)育不同階段下丘腦和卵巢組織中表達(dá)穩(wěn)定性M值Fig.3 The expression stability(M values)of reference genes in chicken hypothalamus and ovary tissue by geNorm

2.3 Norm Finder軟件分析

Norm Finder軟件分析內(nèi)參基因在不同發(fā)育階段濟(jì)寧百日雞下丘腦、卵巢組織中的表達(dá)穩(wěn)定性，穩(wěn)定值越小的基因表達(dá)最穩(wěn)定，比較結(jié)果見圖4，在下丘腦中3個(gè)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性從大到小為GAPDH（0.161）＞β-actin（0.226）＞18S rRNA（0.265），而卵巢中穩(wěn)定性從大到小是β-actin（0.342）＞GAPDH（0.517）＞18S rRNA（0.573），說明下丘腦和卵巢中表達(dá)穩(wěn)定性最好的分別是GAPDH和β-actin，這與geNorm的分析結(jié)果一致。

圖4 Norm Finder軟件分析內(nèi)參基因在發(fā)育不同階段下丘腦和卵巢組織中的表達(dá)穩(wěn)定值Fig.4 The expression stability values of reference genes in chicken hypothalamus and ovary tissue by Norm Finder

2.4 Bestkeeper軟件分析

Bestkeeper軟件在每個(gè)基因中直接產(chǎn)生配對相關(guān)系數(shù)和Bestkeeper指數(shù)，指數(shù)的產(chǎn)生是由所有內(nèi)參基因Ct值的幾何平均數(shù)（GM）產(chǎn)生。主要以標(biāo)準(zhǔn)變異系數(shù)（SD）和變異相關(guān)系數(shù)（CV）來判斷基因表達(dá)的穩(wěn)定性，SD和CV的值越小，表明基因表達(dá)越穩(wěn)定。從表2的參數(shù)信息可以看出，內(nèi)參基因18S rRNA在濟(jì)寧百日雞下丘腦中表達(dá)最穩(wěn)定，其次是GAPDH，相比而言，β-actin最不穩(wěn)定；而在卵巢中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是β-actin，其次是18S rRNA，最不穩(wěn)定的是GAPDH（見表3）。

表2 Bestkeeper分析內(nèi)參基因在濟(jì)寧百日雞下丘腦中的表達(dá)穩(wěn)定性相關(guān)參數(shù)Table 2 The expression stability and related parameters of reference genes analyzed by Bestkeeper in Jining Bairi chicken hypothalamus

表3 Bestkeeper分析內(nèi)參基因在濟(jì)寧百日雞卵巢中的表達(dá)穩(wěn)定性相關(guān)參數(shù)Table 3 The expression stability and related parameters of reference genes analyzed by Bestkeeper in Jining Bairi chicken ovary

3 討論

采用qRT-PCR技術(shù)對目標(biāo)基因表達(dá)分析時(shí)需要表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因?qū)Ψ磻?yīng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正，常用的內(nèi)參基因多為持家基因，但許多研究表明這些持家基因隨組織、細(xì)胞或?qū)嶒?yàn)條件的不同而并非恒定表達(dá)。研究表明，在缺氧條件下培養(yǎng)24 h的腦星形膠質(zhì)細(xì)胞中GAPDH表達(dá)顯著增加，而β-actin表達(dá)則明顯下降[3]。在血清刺激實(shí)驗(yàn)中，GAPDH和β-actin表達(dá)均顯著升高，不宜用作內(nèi)參基因，而18S rRNA表達(dá)沒有變化[5]。王紅楊等[4]采用RT-PCR和Western blotting技術(shù)對雞肌肉組織發(fā)育早期階段幾個(gè)持家基因進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)GAPDH和β-actin表達(dá)水平在所檢測胚齡期的各時(shí)間點(diǎn)差異顯著。同樣在豬肺臟、心臟、腎臟、胃、肌肉、脂肪和小腸等組織中對持家基因表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，GAPDH在肌肉組織中明顯上調(diào)表達(dá)[5]。GAPDH是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，腫瘤發(fā)生中都會加強(qiáng)此途徑，因此，所研究中若涉及糖代謝變化時(shí)則不宜使用GAPDH作為內(nèi)參，另外，β-actin是細(xì)胞骨架肌動蛋白之一，若檢測樣本中有細(xì)胞骨架系統(tǒng)發(fā)生異?；蚰繕?biāo)基因參與細(xì)胞骨架形成，此時(shí)，則不宜使用β-actin作為內(nèi)參基因[6]。顯然，持家基因的表達(dá)并非總是恒定的，若盲目地使用一種看家基因作為內(nèi)參，可能導(dǎo)致一些基因表達(dá)的微小差異難以發(fā)現(xiàn)甚至得出錯(cuò)誤的結(jié)論[1]，因此，篩選穩(wěn)定的內(nèi)參基因在目標(biāo)基因表達(dá)分析中起著至關(guān)重要的作用。

目前，針對雞生殖軸上基因表達(dá)的研究中，多以GAPDH、β-actin和18S rRNA為參照基因。楊玉等[7]在分析能量對蛋雞卵巢FSHRmRNA表達(dá)中發(fā)現(xiàn)β-actin在不同時(shí)期和不同能量水平下表達(dá)恒定，并以此為內(nèi)參基因分析FSHR是否受能量水平影響并進(jìn)一步探究和產(chǎn)蛋率的關(guān)系。何晶等[8]對FSHR和LHR在海蘭褐雞卵巢和輸卵管中的定量分析時(shí)以GAPDH為內(nèi)參，張俊珍等[9]研究CDK5基因在蛋雞卵巢中的表達(dá)時(shí)以18S rRNA為內(nèi)參基因，朱文奇等[10]研究能量水平對文昌雞下丘腦、卵巢中NPY基因表達(dá)的影響時(shí)以β-actin為內(nèi)參基因。而在探究FOXL2與TGFβ家族成員的互作對雞排卵前卵泡顆粒細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，則以18S rRNA為內(nèi)參基因[11]。因此，有必要對這些內(nèi)參基因在雞發(fā)育不同階段下丘腦、卵巢組織中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析。

本研究采用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3種軟件，對持家基因18S rRNA、β-actin和GAPDH在濟(jì)寧百日雞7個(gè)不同發(fā)育時(shí)期下丘腦和卵巢組織中的表達(dá)穩(wěn)定性分析結(jié)果表明：geNorm和NormFinder的分析結(jié)果一致，卵巢中β-actin表達(dá)最穩(wěn)定，其次是GAPDH；下丘腦中GAPDH表達(dá)最穩(wěn)定，其次是β-actin。而BestKeeper分析結(jié)果顯示卵巢中β-actin最穩(wěn)定，其次是18S rRNA而不是GAPDH；而下丘腦中最穩(wěn)定的是18S rRNA，其次是GAPDH。以上差異可能是由于軟件之間運(yùn)用的算法不同所致。我們對3個(gè)內(nèi)參基因在下丘腦和卵巢中的表達(dá)量進(jìn)行了比較發(fā)現(xiàn)：在卵巢中β-actin表達(dá)最高，18S rRNA表達(dá)最低，而在下丘腦中則相反，表明這些內(nèi)參基因的表達(dá)量存在著組織差異。王忠偉等[12]用geNorm分析籽鵝卵巢組織中內(nèi)參基因穩(wěn)定性時(shí)發(fā)現(xiàn)GAPDH的表達(dá)最穩(wěn)定，并且內(nèi)參基因的最適數(shù)目是2個(gè)。平行測定2個(gè)或以上內(nèi)參基因有助于發(fā)現(xiàn)偏差，得到獲得更可靠的分析結(jié)果[13-15]。根據(jù)18S rRNA在卵巢中的穩(wěn)定性綜合評價(jià)，不建議單獨(dú)作為內(nèi)參使用，而在下丘腦中，當(dāng)研究表達(dá)豐度較高的基因時(shí)則可以考慮使用。在特定基因的定量研究中，目前還沒有發(fā)現(xiàn)適用于對所有樣本進(jìn)行校正的內(nèi)參基因。所以，在進(jìn)行定量分析時(shí)，根據(jù)樣本的不同，選擇最合適的2個(gè)或2個(gè)以上的持家基因作為內(nèi)參，以盡可能消除不穩(wěn)定因素帶來的影響，從而保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，本研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢及下丘腦中β-actin和GAPDH的相關(guān)性最好，可同時(shí)作為內(nèi)參基因配合使用。

4 結(jié)論

本研究分析了GAPDH、β-actin和18S rRNA三個(gè)常用的內(nèi)參基因在雞性發(fā)育不同階段下丘腦和卵巢組織中的表達(dá)穩(wěn)定性，結(jié)果表明，在雞性發(fā)育不同階段的卵巢中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)棣?actin，而在下丘腦中為GAPDH。在卵巢中，雖然3個(gè)軟件分析β-actin表達(dá)穩(wěn)定性最好，但各內(nèi)參基因Ct值在樣本間變化較大，即表達(dá)均一性較差，因此，建議在雞發(fā)育不同時(shí)期卵巢的中最好同時(shí)選用2個(gè)內(nèi)參基因。

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