謝 穎，王 晶，姜 華

（1.遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116029； 2.大連森林動物園，遼寧大連 116013）

大連市榆葉梅葉斑病的病原菌鑒定

謝 穎1，王 晶2，姜 華2

（1.遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116029； 2.大連森林動物園，遼寧大連 116013）

榆葉梅（Amygdalus triloba）是綠化美化城市園林的常見樹種，具有較高的園林觀賞價值和藥用價值。但近年來大連市園林中的榆葉梅葉斑病發(fā)生較重，因此，查明病因，對癥下藥，實(shí)為迫在眉睫。本文采集了感病葉片，以單斑分離法、分離菌株致病性測定、形態(tài)學(xué)鑒定及分子生物學(xué)鑒定等，對大連市榆葉梅發(fā)生的葉斑病進(jìn)行了病原菌鑒定。結(jié)果表明，榆葉梅葉斑病的致病菌為交鏈孢霉屬（Alternaria）的甘藍(lán)長尾交鏈孢霉［Alternaria brassicae］。

榆葉梅；葉斑??；病原菌鑒定，

榆葉梅（Amygdalus triloba）又叫小桃紅，是薔薇科、李屬落葉灌木，既可獨(dú)栽，又可叢植，廣泛用于草坪、公園、庭院的綠化和美化，是園林綠化中早春觀花樹種之一［1］。其果實(shí)內(nèi)的種子有潤燥滑腸，下氣利水等功效，可治療食積氣滯、水腫、小便不利等疾?。?］。榆葉梅是城市園林中常見的觀賞花木，也是大連市區(qū)主栽的綠化美化樹種，但近年來發(fā)生了較為嚴(yán)重的葉斑病，因此，迫在眉睫的是查明病原，以利于對癥防治。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病源

榆葉梅葉斑病感病葉片和健康植株的健康葉片。

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基

DNA Marker（DL2000）、TaqDNA 聚合 酶、dNTP、buffer等試劑購于大連TaKaRa公司；引物（Its1和 Its4）合成、DNA測序由生工生物工程（上海）公司完成；馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）等。

1.1.3 儀器

滅菌器（YM100Z）、超凈工作臺（YJ-875）、恒溫培養(yǎng)箱（HH.B11）、光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS，CX21）、PCR儀（GeneAMP 9700）、凝膠成像系統(tǒng)（GDS8000），等。

1.2 方法

1.2.1 病害調(diào)查、癥狀觀察與采樣

2016年6～9月，對大連市區(qū)內(nèi)多種園林樹木，進(jìn)行了葉斑病普查。榆葉梅葉斑病較重，故此，采集發(fā)病植株的感病葉片，同時采集健康植株葉片作對照。在榆葉梅發(fā)病區(qū)采用五點(diǎn)取樣法［3］，隨機(jī)選點(diǎn)，每點(diǎn)選5株，每株選東西南北樹枝。從發(fā)病初期每隔30 d調(diào)查1次，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率、病情指數(shù)［4］，觀察病葉癥狀。

1.2.2 病原菌單斑分離

采用單斑分離法［5］。取感病葉片在病健交界處剪取典型病斑塊，經(jīng)酒精、無菌水表面消毒后轉(zhuǎn)至PDA培養(yǎng)基上28℃恒溫培養(yǎng)，4～5 d后觀察菌落生長狀況，計(jì)算單班分離率。再重新取菌絲尖端置于PDA培養(yǎng)基中28℃下恒溫培養(yǎng)，重復(fù)操作至分離菌株純化［6］。

1.2.3 分離菌株致病性測定

制備菌懸液，據(jù)科赫法則用針刺法接種［5］，每處理接種5片葉，設(shè)對照，3次重復(fù)。接種后的葉片置于28℃保濕培養(yǎng)，觀察其發(fā)病情況。

1.2.4 病原菌鑒定

1.2.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

肉眼觀察菌落特征，菌落正反面顏色、輪紋等；光鏡下觀察菌絲及孢子特征，分生孢子的大小、形狀、孢子梗的有無及膈膜等［6］。

1.2.4.2 分子生物學(xué)鑒定

以鋼珠法提取致病菌DNA，以瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度，以真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對致病菌 rDNA-ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增［7］。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程公司進(jìn)行DNA測序。最后，將測得的DNA序列在 NCBI網(wǎng)站進(jìn)行 blast比對，利用ClustalX軟件將測得序列與已報道的相近植物病原菌的序列進(jìn)行序列對齊和同源性序列的多重排定，用 MEGA5.0軟件進(jìn)行序列分析，鄰近法（Neighbor-Joining）構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害調(diào)查及癥狀觀察

2.1.1 病害調(diào)查

調(diào)查期間為2016年5月～2016年10月。葉斑病一般始發(fā)期在6月中旬，發(fā)病盛期在8月中旬至9月中旬。榆葉梅的始發(fā)期發(fā)病率為16%、病情指數(shù)為6%，7月中旬至8月中旬病害發(fā)展迅速，發(fā)病率為33%、病情指數(shù)升至27.33%，病害盛發(fā)期的發(fā)病率為57%、病情指數(shù)升至34.33%。

2.1.2 癥狀觀察

榆葉梅葉斑病發(fā)病部位隨機(jī)，且病斑形狀不規(guī)則、分布無規(guī)律；病斑初期褪綠發(fā)黃，進(jìn)而由黃變褐，嚴(yán)重者葉斑處枯死或穿孔，感病葉片變薄，病健交界處未見明顯黃暈（見圖1）。

圖1 榆葉梅葉斑病癥狀Figure 1 Lagerstroem ia indica and Am ygdalus trilobalm p lum disease sym ptom s

2.2 單斑分離率

從榆葉梅感病葉片單斑中，共分離出2個菌株，命名為M1和M2，其單斑分離率為18.3%和28.33%。依據(jù)單斑分離率的大小，初步推斷導(dǎo)致榆葉梅葉斑病的病原菌可能是M2。而接種健康葉片的對照組均無菌落生長。

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

榆葉梅致病菌M2：28℃、PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，菌落表面濕潤不光滑，呈青灰色，有輪紋，菌落背面呈輪紋生長中心為黑色。分生孢子梗欖褐色，有隔膜0～7個，上部屈曲，有顯著孢子痕，14～48μm×6～13μm；分生孢子單生或形成4個孢子短鏈，長卵形或倒棍棒形，有橫隔膜3～18個，縱膈膜0～15，灰欖褐色有長喙（見圖2）。初步鑒定為半知菌亞門（Deuteromycotina）、叢梗孢目（Moniliales）、暗梗孢科（Dematiaceae）、交鏈孢霉屬（Alternaria）的甘藍(lán)長尾交鏈孢霉（Alternaria brassicae）。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

以榆葉梅致病菌M2的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一個長度為536 bp的擴(kuò)增片段。PCR產(chǎn)物測序，所得的rDNA-ITS序列在NCBI網(wǎng)站上與已知序列進(jìn)行BLAST比對，菌株M2與已登錄注冊的甘藍(lán)長尾交鏈孢霉（Alternaria brassicae）比對所得分值最大，相似率最高且為99%。構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中，聚類結(jié)果見圖3。依據(jù)分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，大連榆葉梅葉斑病病原真菌是交鏈孢霉屬（Alternaria）的甘藍(lán)長尾交鏈孢霉（Alternaria brassicae）。

2.4 分離菌株的致病性

將榆葉梅感病葉片單斑分離出來的2株真菌，分別進(jìn)行單菌株和混合菌株接種。試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株M1不能導(dǎo)致接種葉片發(fā)病，而M2接種48 h后葉片開始發(fā)病，發(fā)病率為100%；用M1和M2混合接種，48 h后葉片開始發(fā)病，發(fā)病率為100%。接種葉片表現(xiàn)出的癥狀與田間自然發(fā)病癥狀相似，而對照未發(fā)病。從接種發(fā)病的病組織再次分離出真菌，菌落形態(tài)、孢子形態(tài)與接種菌株一致。由此證明了榆葉梅葉斑病是由M2侵染所致。

圖2 榆葉梅致病菌M 2菌落及分生孢子Figure 2 Colony morphologies and conidial shape of the pathogen M 2

圖3 菌株M 2的rDNA-ITS系統(tǒng)進(jìn)化樹Figrue 3 Neighbor-joining tree constructed from M 2 ITS sequences

3 討論

園林植物在綠化美化城市的同時，作為活體材料在生長發(fā)育過程中，極易受到各種病原微生物的侵染，引發(fā)各種病害，其中葉斑病是影響植株美觀和品質(zhì)較為嚴(yán)重的病害［6］。有關(guān)榆葉梅常見的病害有枝枯病和葉斑?。?、8、9］，但關(guān)于其葉斑病的病原菌鑒定研究鮮有報道。本研究對大連市園林中的榆葉梅葉斑病，進(jìn)行了致病菌的形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，查明了大連市榆葉梅葉斑病致病菌是甘藍(lán)長尾交鏈孢霉（Alternaria brassicae），這為園林部門針對性地防病提供了重要依據(jù)。鏈格孢菌寄主較多［10］，可導(dǎo)致多種植物發(fā)生病害，但其侵染榆葉梅鮮有報道。

［1］ 許善忠.榆葉梅常見病蟲害的發(fā)生與防治［J］.吉林農(nóng)業(yè)，2015（9）：101.

［2］ 蘭茂.滇南本草［M］.昆明：云南人民出版社，1959.

［3］ 張慶忠.園林植物常見病蟲害及其防治措施［J］.現(xiàn)代園藝，2014（2）：67～69.

［4］ 姜華，修玉萍，鄭音，等.堿蓬內(nèi)生枯草芽孢桿菌分離鑒定及抑菌活性檢測［J］.遼寧師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，34（4）：503～507.

［5］ 方中達(dá).植病研究方法［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

［6］ 魏景超.真菌鑒定手冊［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979.

［7］ 李永，岳志強(qiáng)，樸春根，等.鏈格孢屬真菌的分子復(fù)合鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹研究［J］.中國農(nóng)學(xué)通報.2013，29（27）：165～169.

［8］ 康永，陳紅，劉繼成，等.榆葉梅常見病害防治淺談［J］.現(xiàn)代園藝，2011（16）：43.

［9］ 王娜，羅樂，張啟翔，等.榆葉梅品種資源調(diào)查及已知品種數(shù)據(jù)庫管理信息系統(tǒng)構(gòu)建［J］.南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013（5）：865～870.

［10］ 姜華，鮑竹，王晶.藥用觀賞植物—鳥巢蕨葉斑病病原菌鑒定初報［J］.遼寧師范大學(xué)學(xué)報，2016，39（1）：93～97.

Identification of Pathogens on Amygdalus triloba Leaf Spot of Dalian City

XIE Ying1，WANG Jing2，JIANG Hua1（1．College of Life Science，Liaoning Normal University，Dalian，Liaoning 116029； 2．Dalian Forest Zoo，Dalian，Liaoning 116013）

Amygdalus triloba which is also called small peach，are green landscaping urban garden common species，which has a high ornamental value of the garden.and medical value.But in recent years，Dalian garden of the elm leaves plum leaf disease occurred heavier，therefore，to identify the cause，the rightmedicine，it is imminent.In this paper，we collected the susceptible leaves，identified by pathogenicity，pathogenicity identification and molecular biology identification.The pathogen identification of leaf spot in the Elm pratensis was carried out.The results showed that the pathogens of the Amygdalus triloba were Alternaria brassicae.

Amygdalus triloba；Leaf spot；Identification of Pathogens

S436.8

B

1002-1728（2017）06-0073-03

10.3969／j.issn.1002-1728.2017.06.017

2017-10-14

遼寧省教育廳大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201510165037）

謝穎（1991-），女，研究生，研究方向?yàn)橹参锊±韺W(xué)。E-mail：1398572709＠qq.com通訊作者：姜華（1958-），女，博士，教授，主要從事植物病理學(xué)研究。E-mail：jianghua1225＠163.com