寧自林+儲(chǔ)衛(wèi)華

摘要：從江蘇、云南等省8家不同類(lèi)型的養(yǎng)殖場(chǎng)的排放物及其周邊的水、土壤采樣進(jìn)行金黃色葡萄球菌的分離，通過(guò)紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)調(diào)查金黃色葡萄球菌的耐藥情況，并對(duì)其產(chǎn)生主要毒力因子及生物膜形成能力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從養(yǎng)殖場(chǎng)周?chē)h(huán)境分離出20株金黃色葡萄球菌，對(duì)青霉素、氨芐西林、復(fù)方新諾明的耐藥性較高，而對(duì)氟本尼考、頭孢唑啉、丁胺卡那這三類(lèi)藥物的耐藥性較低。表明畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中金黃色葡萄球菌耐藥性嚴(yán)重，大部分環(huán)境分離菌株能產(chǎn)生溶血素和胞外蛋白酶，并能夠形成生物膜。這些菌株在自然環(huán)境中的存在，對(duì)環(huán)境生態(tài)具有一定的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)予以重視。

關(guān)鍵詞：畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)；金黃色葡萄球菌；耐藥性；毒力因子；生物膜

中圖分類(lèi)號(hào)：X713 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2017）12-0007-03

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）在自然界中無(wú)處不在，空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中都可找到，可以在動(dòng)物和人類(lèi)之間交叉感染，是醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)臨床上最常見(jiàn)的病原[1]。作為革蘭陽(yáng)性菌的代表，它可引起人和動(dòng)物的皮膚軟組織感染、敗血癥、心內(nèi)膜炎、肺炎、腸炎、腦膜炎、骨髓炎和中毒性休克綜合征等疾病[2]。獸醫(yī)臨床上常因養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)密度過(guò)大、通風(fēng)不良、衛(wèi)生條件差、動(dòng)物皮膚由于護(hù)欄等劃破而感染金黃色葡萄球菌，該病易傳染，不易治愈，給畜禽養(yǎng)殖造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，在動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中主要通過(guò)抗生素來(lái)治療。由于金黃色葡萄球菌對(duì)抗生素極易產(chǎn)生耐藥性，且其耐藥周期越來(lái)越短，因此金黃色葡萄球菌病已成為臨床治療的難題。近年來(lái)，由畜禽糞便污染引起的人畜共患病的傳播與感染現(xiàn)象已引起人們對(duì)畜禽糞便病原微生物污染的重視。有報(bào)道稱(chēng)，畜禽糞便廢棄物中有多種潛在的致病微生物，如果畜禽糞便不進(jìn)行無(wú)害化處理，直接排放到環(huán)境中，這些致病菌將污染環(huán)境。此外由于畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中大量使用抗生素，使得動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)菌耐藥菌株數(shù)量增加，而耐藥菌株隨著畜禽糞便和污水排放甚至作為農(nóng)用有機(jī)肥料施用，帶有耐藥基因的菌株進(jìn)入環(huán)境，其抗藥性基因可能通過(guò)接合、轉(zhuǎn)化等重組方式轉(zhuǎn)移到新的病原菌，這些耐藥菌可能通過(guò)“土壤-植物-動(dòng)物-人”食物鏈的途徑進(jìn)入人體，將嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。本研究對(duì)畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中金黃色葡萄球菌進(jìn)行分離，并對(duì)其耐藥性、毒力因子進(jìn)行分析，以期為畜禽養(yǎng)殖糞便無(wú)害化處理及排放提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

分別于2013年7月至2015年5月對(duì)江蘇省南京、南通、鹽城和云南省嵩明縣、曲靖市等8家不同類(lèi)型的畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)排放物及周?chē)h(huán)境進(jìn)行采樣，共采集樣品24個(gè)（其中排放物樣品、土壤樣品和水樣各8個(gè)）。

畜禽排放物樣品：采集養(yǎng)殖場(chǎng)糞便臨時(shí)堆積場(chǎng)的糞便，采集糞堆表層（1～20 cm）和中層（20～40 cm）各3個(gè)樣混合。

土壤樣品：采集養(yǎng)殖場(chǎng)附近施用過(guò)畜禽糞肥的農(nóng)田，隨機(jī)選擇3個(gè)點(diǎn)，采集表層土壤（5～10 cm），混合。

水樣：采集離養(yǎng)殖場(chǎng)污水排放口1 km左右的水體，采集距水面10～15 cm深處水樣， 每個(gè)樣品采集1 000 mL。

1.2 金黃色葡萄球菌的分離及鑒定

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g土壤/糞便樣本加入到100 mL無(wú)菌水帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩10 min，使土壤與水充分混合，制備出10-1土壤/糞便懸液。用無(wú)菌吸管吸取1 mL土壤/糞便懸液，倍比稀釋到10-2、10-3稀釋度，用移液器分別從10-2、10-3稀釋度試管中各吸取0.1 mL涂布至Baird-Parker培養(yǎng)基上；水樣取100 mL進(jìn)行過(guò)濾，將濾膜直接貼在Baird-Parker培養(yǎng)基，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)48 h培養(yǎng)，挑取可疑菌落用VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物生化鑒定儀作生化鑒定及凝固酶試驗(yàn)。

1.3 藥敏試驗(yàn)

采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)推薦的Kirby-Bauer瓊脂擴(kuò)散法[3]，選擇醫(yī)療和畜禽養(yǎng)殖最常用的10種抗生素進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)?？股丶埰ê贾菸⑸镌噭┯邢薰荆┓N類(lèi)及其抗生素含量為：復(fù)方新諾明（23.75、1.25 μg/片），環(huán)丙沙星（5 μg/片），諾氟沙星（10 μg/片），青霉素（15 U/片），氨芐西林（10 μg/片），頭孢唑啉（30 μg/片），丁胺卡那（30 μg/片），慶大霉素（10 μg/片），氟苯尼考（30 μg/片），羅紅霉素（15 μg/片），OXOID公司，從瓊脂斜面分別挑取各試驗(yàn)菌株1～2鉑耳圈接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)18～20 h，用生理鹽水進(jìn)行適當(dāng)稀釋至菌含量在105個(gè)/mL，吸取0.1 mL加到MH平板上，涂布均勻，貼上藥敏紙片，37 ℃培養(yǎng)18～20 h，測(cè)量抑菌圈直徑，按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判斷耐藥性。

1.4 毒力因子檢測(cè)

溶血素的檢測(cè)：將分離獲得的菌株純培養(yǎng)物接種在含5%綿陽(yáng)鮮血LB瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)18～20 h，觀察溶血狀況。

胞外蛋白酶的檢測(cè)：將分離獲得的菌株純培養(yǎng)物點(diǎn)種在含1%脫脂奶粉LB瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)18～20 h，觀察是否形成透明圈。

1.5 生物膜檢測(cè)

將獲得的菌株接種到裝有2 mL LB培養(yǎng)基的試管中，37 ℃培養(yǎng)48 h后，將試管中的培養(yǎng)液倒凈，加入3 mL的1%結(jié)晶紫溶液，室溫下孵育5 min，將結(jié)晶紫溶液倒凈，用PBS沖洗試管3～5 min，將試管倒置在濾紙上去除試管中多余的水分，把試管放在37 ℃烘箱中烘干，觀察記錄[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌分離鑒定

從不同類(lèi)型的畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)糞便、施用過(guò)畜禽糞便作為肥料的土壤以及水體樣品中共分離出金黃色葡萄球菌20株，在LB平板上形成典型的濕潤(rùn)且呈黃色的菌落。

2.2 金黃色葡萄球菌耐藥性檢測(cè)結(jié)果endprint

分離得到的20株金黃色葡萄球菌對(duì)10種常用抗菌藥物具有不同程度的耐藥性，對(duì)青霉素、氨芐西林、復(fù)方新諾明耐藥性較高，對(duì)氟苯尼考、頭孢唑啉、丁胺卡那敏感性較高（表1）。

2.3 毒力因子的檢測(cè)結(jié)果

在5%綿羊血平板上，20株金黃色葡萄球菌環(huán)境分離菌株生長(zhǎng)良好，菌落較大，呈圓形、光滑凸起的金黃色菌落，有15株分離菌株的菌落周?chē)赏耆苎耐该魅Γ▓D1）。在脫脂奶粉平板上有18株菌株能形成溶蛋白圈（圖2），說(shuō)明這些菌株都能夠產(chǎn)生溶血素和胞外蛋白酶。

2.4 生物膜檢測(cè)結(jié)果

在沒(méi)有外界因素誘導(dǎo)的條件下，20株環(huán)境分離菌株中共有17株在試管上能形成肉眼可見(jiàn)的生物膜， 有的在試管上形成很厚的生物膜，經(jīng)結(jié)晶紫染色后試管液面部分和底部都留有結(jié)晶紫，生物膜形成能力弱的菌株僅在底部可以看到有結(jié)晶紫存在，而不能形成生物膜的菌株試管壁上幾乎沒(méi)有結(jié)晶紫存在（圖3）。

3 討論

隨著畜禽養(yǎng)殖集約化的發(fā)展，抗生素作為禽畜疾病預(yù)防及藥物治療、促生長(zhǎng)飼料添加劑等被廣泛應(yīng)用，而抗生素的濫用，導(dǎo)致耐藥菌不斷出現(xiàn)。畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)廢棄物如果不經(jīng)過(guò)無(wú)害化處理直接排放到自然界，其中的抗生素將可能對(duì)土壤和水體造成嚴(yán)重的污染，表現(xiàn)為破壞土壤和水體中的菌群結(jié)構(gòu)、打破微生態(tài)平衡并誘導(dǎo)耐藥菌產(chǎn)生，威脅人類(lèi)健康安全。近年來(lái)， 由畜禽糞便污染引起的人畜共患病傳播與感染，已引起人們對(duì)畜禽糞便病原微生物污染的重視。

金黃色葡萄球菌在自然界廣泛分布，是人畜皮膚、呼吸道、消化道黏膜上的常見(jiàn)菌群。當(dāng)機(jī)體黏膜和皮膚破損或者抵抗力降低時(shí)，可通過(guò)損傷的皮膚、黏膜、呼吸道及消化道感染導(dǎo)致發(fā)病。金黃色葡萄球菌是畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中最為常見(jiàn)的一種化膿性病原菌之一，能夠引起畜禽多種疾病。以斷奶后的仔豬易多發(fā)葡萄球菌病，主要表現(xiàn)為滲出性皮炎。牛常表現(xiàn)為壞疽性乳房炎和傳染性乳房炎。禽在臨床上表現(xiàn)癥狀很多，幼雛和中雛多呈敗血癥、浮腫性皮炎，成年雞則多表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)滑囊炎、腱鞘炎、腳球瘤等，還可見(jiàn)到化膿性骨髓炎、膿性眼炎、心內(nèi)膜炎等。金黃色葡萄球菌的致病性跟其能否產(chǎn)生毒力因子有關(guān)，這些毒力因子能協(xié)助金黃色葡萄球菌侵襲組織細(xì)胞、逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的清除、產(chǎn)生耐藥性等，其主要的毒力因子是胞外毒素和酶以及產(chǎn)生生物膜[4]。金黃色葡萄球菌侵入與產(chǎn)生的胞外蛋白酶有關(guān)，而進(jìn)入機(jī)體后產(chǎn)生另外一些毒力因子進(jìn)一步破壞宿主的組織器官，特別是α溶血素， 能夠引起組織損傷，破壞宿主的免疫系統(tǒng)[5]，本研究發(fā)現(xiàn)，從養(yǎng)殖場(chǎng)糞便及周邊環(huán)境中分離的菌株大部分能產(chǎn)生蛋白酶和溶血素，說(shuō)明這些菌株具有一定的致病性。對(duì)分離菌株進(jìn)行生物膜形成能力的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，這些菌株在一定程度上能形成生物膜。生物膜一旦形成便可保護(hù)細(xì)菌不受傳統(tǒng)抗菌藥物的作用，導(dǎo)致長(zhǎng)期的抗生素治療無(wú)效。生物膜還可以保護(hù)細(xì)菌逃離體內(nèi)的免疫反應(yīng)，在惡劣的環(huán)境中持續(xù)存活下來(lái)[6]。

本研究通過(guò)對(duì)江蘇和云南不同養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境中金黃色葡萄球菌的調(diào)查，從養(yǎng)殖場(chǎng)的糞便以及周邊的土壤和水體中都能夠分離到金黃色葡萄球菌，通過(guò)對(duì)分離菌株進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，結(jié)果顯示，大部分環(huán)境分離菌株對(duì)10種養(yǎng)殖場(chǎng)常用藥物都具有一定程度的耐藥。孫燕萍[7]對(duì)來(lái)源于畜禽生肉和養(yǎng)殖環(huán)境表面的25株金黃色葡萄球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，顯示對(duì)10種抗生素都有不同程度的耐藥性，對(duì)苯唑西林紅霉素、慶大霉素、克林霉素耐藥率大于50%，對(duì)復(fù)方磺胺敏感。本研究中10株環(huán)境分離株對(duì)青霉素、氨芐西林、復(fù)方新諾明耐藥性較高，對(duì)氟苯尼考、頭孢唑啉、丁胺卡那敏感性較高，該結(jié)果可為養(yǎng)殖場(chǎng)的畜禽疾病防治提供指導(dǎo)，為進(jìn)一步提高畜禽健康，保護(hù)人類(lèi)安全。

畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)周?chē)h(huán)境源性微生物在很長(zhǎng)時(shí)間被人們忽視，隨著社會(huì)大眾對(duì)環(huán)境安全認(rèn)識(shí)的不斷提高，環(huán)境源病原菌的危害越來(lái)越受到重視。本試驗(yàn)結(jié)果表明，養(yǎng)殖場(chǎng)周邊環(huán)境中的金黃色葡萄球菌的耐藥性以及致病性都很高，其對(duì)人和動(dòng)物的潛在危害不可小覷。需要加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生管理并積極開(kāi)展細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)，合理規(guī)范使用抗菌藥物。

參考文獻(xiàn)：

[1] DAHMS C，H？譈BNER N O，WILKE F，et al. Mini-review：Epidemiology and zoonotic potential of multiresistant bacteria and Clostridium difficile in livestock and food[J].GMS Hyg Infect Control，2014（3）：21.

[2] 王江橋，羅 君，蔡 珠，等.金黃色葡萄球菌感染的特征及其耐藥性[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，14（4）：990-992

[3] 賀建忠，陳宏偉，王貴強(qiáng)，等.金黃色葡萄球菌生物被膜形成與生物被膜相關(guān)基因的調(diào)查研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（4）：55-59.

[4] CHEUNG A L，PROJAN S J，GRESHAM H. The genomic aspect of virulence，sepsis，and resistance to killing mechanisms in Staphylococcus ausaur[J].Curr Infect Dis ReP，2002（4）：400-410.

[5] RICHA J，MICHELLE C，JUDY M，et al .Specific roles of alpha-toxin and beta-toxin during Staphylococcus aureus cornea l infection[J].Infect Immun，1997，65（5）：1571-1578.

[6] 黃忠強(qiáng)，韋雪菱.生物膜陽(yáng)性致病菌對(duì)常用消毒劑耐受性研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2011，21（16）：3420-3422.

[7] 孫燕萍.對(duì)畜禽生肉及養(yǎng)殖環(huán)境表面分離的金黃色葡萄球菌的藥敏分析[J].中國(guó)藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)，2015（3）：178-179.endprint