張玉靈 邢文龍 尚菊菊 周琦 李享 劉紅旭

摘要 目的：探討益氣逐瘀法對擇期PCI圍手術(shù)期EPCs動員與歸巢影響。方法：采用隨機、雙盲、安慰劑、對照試驗方法，研究對象為首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院心血管科2016年7月至2016年11月成功接受PCI治療的證屬氣虛血瘀證非ST段抬高急性冠脈綜合征（NSTE-ACS）患者。64名符合納入標準的患者被隨機分為試驗組（n=33）和對照組（n=31），對照組予常規(guī)西藥治療+安慰劑，試驗組在常規(guī)西藥治療基礎上加服參元丹膠囊，分別采用流式細胞儀、ELISA法進行檢測2組擇期PCI前后3個時點（術(shù)前、術(shù)后24 h、術(shù)后1周）外周血EPCs計數(shù)及促血管內(nèi)皮生成因子VEGF水平，探索益氣逐瘀法對NSTE-ACS患者擇期PCI圍手術(shù)期EPCs動員與歸巢的影響。結(jié)果：2組受試者PCI術(shù)前外周血EPCs計數(shù)、VEGF水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.35、P=0.48），2組PCI術(shù)后外周血中EPCs計數(shù)及VEGF水平較術(shù)前均升高（P<0.05），但接受參元丹治療的患者外周血中VEGF水平高于對照組。2組PCI術(shù)后7 d和術(shù)后24 h比較，外周血EPCs計數(shù)及VEGF水平均變化不大（P>0.05）。結(jié)論：參元益氣活血膠囊（參元丹）干預NSTE-ACS患者PCI圍手術(shù)期可促進骨髓EPCs動員與歸巢，其機制可能與SYD增加循環(huán)中VEGF水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞 冠心?。粎⒃?；圍手術(shù)期心肌損傷；內(nèi)皮祖細胞

Abstract Objective：To observe the effect of Qi-enhancing and Stagnation-removing therapy on EPCs mobilization and homing in PCI perioperative period.Methods：A randomized，double blind，placebo controlled trial was conducted.A total of 64 NSTE-ACS patients who received PCI and belongs to Qi-deficiency and blood-stasis syndrome were concluded in this study.Patients were randomized into Shen Yuan Dan（SYD） group （n=33） and the control group （n=31）.The control group was given conventional western medicine treatment+placebo，on that basis，the treatment group was given SYD.Using flow cytometry instrument and ELISA method to detect EPCs count and VEGF levels of the two groups before and after elective PCI 3 points（preoperative and postoperative 24 hours，after 1 week）.Results：Before treatment，the EPCs count and VEGF level were of no statistically significant difference between the two group （P=0.35，P=0.48）.After treatment，the EPCs count in the peripheral blood and VEGF levels increased in both groups （P<0.05）.While SYD group had higher VEGF than the control group.After treatment 7 d and 24 h，EPCs count and the level of VEGF in the peripheral blood of the two groups had no significant difference（P>0.05）.Conclusion：Shen Yuan Dan in patients can promote bone marrow EPCs mobilization and homing in patients with NSTE-ACS PCI in perioperative period，it may be related to boosting VEGF levels.

Key Words Coronary heart disease； Shen Yuan Dan； Perioperative myocardial injury（PMI）； Endothelial progenitor cells

中圖分類號：R285.6；R242；R541文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.02.005

介入治療（PCI）已成為冠心病的最重要治療手段，圍手術(shù)期心肌損傷（PMI）是PCI常見并發(fā)癥，是影響PCI患者預后的一個重要危險因素。PMI的發(fā)生機制主要與手術(shù)操作（如球囊擴張和支架植入等）對血管內(nèi)皮破壞所導致的微循環(huán)損傷相關(guān)[1]。內(nèi)皮祖細胞（Endothelial Progenitor Cells，EPCs）是一類能夠遷移、增殖，并分化為血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，當組織缺血缺氧時，促血管生成因子、應激、缺血缺氧等內(nèi)外因素刺激下，可促使骨髓EPCs動員至外周循環(huán)，并參與人胚胎血管生成、出生后血管新生及內(nèi)皮損傷后的修復過程[2-5]。以“益氣逐瘀法”研制的參元丹（SYD）具有血管保護作用，如抗氧化應激、減輕炎性反應、上調(diào)一氧化氮合酶（NOS）等內(nèi)源性心肌保護作用，及促進內(nèi)皮祖細胞增殖、粘附作用。而氧化應激、炎性反應、NOS與內(nèi)皮祖細胞（EPCs）動員、歸巢密切相關(guān)，本研究通過對NSTE-ACS患者PCI前后不同時點外周血EPCs計數(shù)及促血管生成細胞因子VEGF水平進行實時動態(tài)監(jiān)測，探索益氣逐瘀方SYD干預PCI圍手術(shù)期對EPCs動員與歸巢的影響及作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2016年7月至2016年11月于首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院成功行PCI治療且中醫(yī)證屬氣虛血瘀證的非ST段抬高急性冠脈綜合征（NSTE-ACS）患者。最終納入64名受試患者，試驗組33例，對照組31例，其中對照組男18例，女13例，年齡49～86歲，平均年齡（68.81±9.68）歲；試驗組男20例，女13例，年齡35～86歲，平均年齡（67.91±11.09）歲，以上患者均根據(jù)自身基礎疾病，如規(guī)范服藥積極控制血壓、血糖、血脂等情況。2組患者在年齡、性別、危險因素、既往疾病等方面差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性。見表1。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫(yī)診斷標準 參照歐洲心臟病學會2012年NSTE-ACS/NSTEMI的診斷和治療指南[6]和美國心臟病學會（ACC）和美國心臟協(xié)會（AHA）2014年NSTE-ACS患者管理指南制定[7]。PCI操作依據(jù)主要參考中華醫(yī)學會心血管病學分會介入心臟病學組2012年頒布的《中國經(jīng)皮冠狀動脈介入治療指南》[8]。

1.2.2 中醫(yī)診斷標準 參照《中華人民共和國國家標準—中醫(yī)臨床診療術(shù)語證候部分》[9]和《中藥新藥臨床研究指導原則》（2002年版）制訂[10]，選擇氣虛血瘀證作為觀察證型。

1.3 納入標準 1）年齡在18～86歲；2）符合NSTE-ACS診斷標準（不穩(wěn)定性心絞痛（Unstable Angina Pectoris，UAP）和非ST段抬高心肌梗死（non-ST Elevated Myocardial Infarction，NSTEMI）診斷標準；3）同意擇期冠狀動脈造影，并接受包括球囊擴張及置入支架在內(nèi)的PCI治療；4）符合中醫(yī)胸痹心痛病氣虛血瘀證候診斷標準；5）入院前2月未規(guī)律服用任何含中藥成分的制劑；6）受試者或法定代理人自愿簽署知情同意書。

1.4 排除標準 1）急性ST段抬高型心肌梗死或穩(wěn)定性心絞痛；2）高危的非ST段抬高ACS（包括UAP和NSTEMI）患者，需要行急診PCI；3）需要行冠狀動脈旁路移植術(shù)的患者；4）嚴重心功能不全（左室射血分數(shù)<30%）；5）合并其他能引起CK-MB、TnT水平升高的疾病，如心肌炎、心力衰竭、心肌病等；6）惡性腫瘤或血液性疾??；7）肝功能異常（ALT或AST高于正常值上限2倍）、腎功能異常（Cr>3 mg/dL）；8）對試驗藥物過敏者；9）術(shù)前1月已經(jīng)使用益氣逐瘀法中藥制劑或臨床研究過程中要求服用其他中藥者。

1.5 剔除標準 1）納入后發(fā)現(xiàn)不符合NSTE-ACS診斷標準而被誤納入者；2）未按規(guī)定用藥，無法判斷療效，或資料不全等影響療效或安全性判斷者；3）觀察中自行服用其他中成藥或中藥湯劑者。

1.6 中止試驗標準 1）服藥后，周身出現(xiàn)皮疹，考慮為藥物過敏者；2）服藥后，出現(xiàn)確定因試驗用藥引起的臨床不適表現(xiàn)：如嚴重的惡心、嘔吐，皮下瘀斑、黑便等情況者；3）服藥后，出現(xiàn)嚴重肝腎功能不全者（Cr>3 mg/dL或265.2 μmol/L；ALT、AST>正常高限2倍）；4）服藥后，出現(xiàn)其他不可預知的緊急病情變化者。

1.7 研究方法 本研究采用前瞻性、隨機、雙盲、安慰劑、對照的臨床試驗方法，采用隨機數(shù)字表及隨機數(shù)余數(shù)分組法產(chǎn)生隨機數(shù)字將納入患者隨機分為試驗組（參元丹組）和對照組（安慰劑組），并進行分配隱藏，其中盲底由本試驗設計指導老師、首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院藥房工作負責人及其國家藥品臨床研究基地負責人保存。并設有相應的應急信封。符合納入標準并且簽署本研究知情同意的患者，由臨床主管醫(yī)師按照入組時間的先后順序向研究員領(lǐng)取編號（由小到大）及相應編號的試驗藥物。并制作1份發(fā)放藥物記錄表，記錄每個受試對象的姓名及其獲取的藥物編號。由護士負責藥物發(fā)放并看服，每次服藥后均記錄備案，以備試驗過程中和結(jié)束時核查可能出現(xiàn)問題的環(huán)節(jié)。

1.8 治療方法 對照組（31例）：常規(guī)西藥治療+安慰劑；常規(guī)西藥治療指拜阿司匹林100 mg，1次/d，氯吡格雷75 mg/d（術(shù)前12 h累計服用總量>300 mg），單硝酸異山梨酯片20 mg，2次/d，阿托伐他汀鈣片（商品名：立普妥）20 mg/次，每晚1次。在常規(guī)西藥治療的基礎上，從介入治療前3 d開始，與西藥間隔0.5 h后溫開水送服安慰劑（北京中醫(yī)醫(yī)院制劑室制成膠囊，每粒含炒面粉0.4 g，其外觀包裝、形狀、顏色與SYD制劑完全一致）4粒/次，3次/d，連續(xù)服用至術(shù)后第7天。試驗組（33例）：在與對照組常規(guī)西藥治療方案相同的基礎上，從介入治療前3 d開始，與西藥間隔0.5 h后溫開水送服參元丹膠囊（北京中醫(yī)醫(yī)院制劑室制成提供膠囊制劑，規(guī)格：60 mg/粒，藥物組成為黃芪、黨參、玄參、丹參、地龍、土鱉蟲、水蛭、延胡索，北京市藥監(jiān)局批準文號99京衛(wèi)字[056]第F203號）。4粒/次，3次/d，連續(xù)服用至術(shù)后第7天。

1.9 觀察指標 1）檢測NSTE-ACS患者擇期PCI前后3個時點（術(shù)前、術(shù)后24 h、術(shù)后1周）外周血EPCs，即測量CD45陰性或低表達，CD34陽性，VEGFR2陽性（CD451ow/-/CD34+/VEGFR2+）的細胞數(shù)目，采用流式細胞儀檢測外周血單個核細胞中這種細胞的比例。2）用ELISA法檢測NSTE-ACS患者擇期PCI前后3個時點（術(shù)前、術(shù)后24 h、術(shù)后1周）血清學促血管內(nèi)皮生成因子VEGF水平。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用統(tǒng)計學軟件SPSS 15.0（PN：32119001，SN：5045602）進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示。2組呈正態(tài)分布且方差齊性的連續(xù)性變量組間比較采用t檢驗。多組呈正態(tài)分布且方差齊性的連續(xù)性變量組間比較采用完全隨機化設計方差分析（One-way ANOVA），多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。非正態(tài)分布連續(xù)性變量組間比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗，當理論頻數(shù)<5，采用Fisher確切概率檢驗。VEGF水平與EPC數(shù)目變化的相關(guān)性由Pearson或Spearman相關(guān)分析檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 EPCs水平 2組PCI術(shù)前外周血早期EPCs水平間不存在具有統(tǒng)計學意義（P=0.35）。受試者接受PCI術(shù)后，試驗組術(shù)后24 h、術(shù)后7 d外周血早期EPCs水平均較術(shù)前升高（P=0.000、P=0.000），對照組受試者PCI術(shù)后24 h外周血EPCs水平較術(shù)前升高（P=0.04）；除對照組術(shù)后7 d（P=0.085），其余受試者PCI術(shù)后外周血中EPCs水平較術(shù)前均升高（P<0.05），但接受參元丹治療的患者外周血中EPCs水平高于對照組。2組PCI術(shù)后7 d較術(shù)后24 h外周血EPCs水平變化不大（P=0.818、P=0.542）。見表2。

2.2 VEGF水平 2組PCI術(shù)前外周血中VEGF的水平間不具有統(tǒng)計學意義（P=0.48）。試驗組受試者接受PCI術(shù)后24 h、術(shù)后7 d外周血中VEGF的水平較術(shù)前升高（P=0.000、P=0.000）；對照組受試者PCI術(shù)后24 h、術(shù)后7 d外周血中VEGF的水平較術(shù)前升高（P=0.01、P=0.004）；2組受試者PCI術(shù)后外周血中VEGF水平較術(shù)前均升高（P<0.05），但接受參元丹治療的患者外周血中VEGF水平高于對照組。2組PCI術(shù)后7 d較術(shù)后24 h外周血VEGF水平變化不大（P=0.517、P=0.68）。見表3。

2.3 VEGF水平與EPC數(shù)目變化的相關(guān)性分析 以試驗組受試者在PCI術(shù)前、PCI術(shù)后24 h外周血EPCs和外周血中VEGF水平為例，數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗后，選擇Spearson相關(guān)分析，檢驗結(jié)果r=0.18，P=0.332>0.05，差異不具有統(tǒng)計學意義，即本試驗指標檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學檢驗后提示，尚不能否認二者不存在相關(guān)關(guān)系。

3 討論

冠心病患者當冠狀動脈缺血后，反應性的側(cè)支血管形成在很大程度上決定了心肌缺血的嚴重程度和預后。內(nèi)皮功能障礙的本質(zhì)是內(nèi)皮損傷和修復之間的動態(tài)平衡遭到破壞。有研究認為缺血組織新血管形成是通過血管生成實現(xiàn)的，即由存在于血管壁的內(nèi)皮細胞增殖、遷移，以發(fā)芽的方式使血管得以延伸[11-12]。但隨著骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞（EPCs）的發(fā)現(xiàn)[2-3]，許多研究顯示，缺血組織內(nèi)皮損傷后的修復過程除了原位血管及原先存在的鄰近成熟內(nèi)皮細胞的參與外，在一些生理應激及病理狀態(tài)下，骨髓可動員EPCs進入血循環(huán)，定向分化為成熟內(nèi)皮細胞在參與其中[13]。有研究報道，組織缺血通過活化VEGF信號通路誘導骨髓EPCs動員。VEGF結(jié)合到細胞表面受體VEGFR2后誘導受體酷氨酸殘基憐酸化，后者激活PI-3K/Akt信號通路[14]，EPCs得以向外周血遷移，因此EPCs在保持血管內(nèi)皮的完整性以及內(nèi)皮的損傷修復中都起到一定作用。EPCs數(shù)量和功能與心血管疾病及其危險因素密切相關(guān)，外周血EPCs水平能夠預測冠心病患者發(fā)生心血管事件的風險性[15-16]。

傳統(tǒng)中醫(yī)理論認為：“人之所有者，血與氣耳。”氣血互根互用，維持生命活動的進行。臨床常用“補益氣血”“行氣活血”“逐瘀通脈”等相關(guān)的方藥可能有促進血管生成作用[17-18]，但其機制尚不明確。大量臨床及基礎研究表明SYD可以通過降低缺血再灌注大鼠血漿LDH、CK-MB的水平，抗脂質(zhì)過氧化損傷，減少I/R后梗死面積的擴大變化發(fā)揮心臟多靶點保護作用，且SYD能夠改善氧化應激損傷、降低炎性反應、上調(diào)NOS表達，提高缺氧/復氧誘導的心肌細胞活性，通過激活PI3K/Akt通路發(fā)揮抗心肌細胞凋亡，上述研究基礎為SYD調(diào)控EPCs動員、歸巢干預擇期PCI圍手術(shù)期心肌損傷提供了理論依據(jù)[19-22]。本研究結(jié)果顯示，擇期PCI術(shù)后參元丹干預的試驗組EPCs水平、VEGF水平高于對照組；PCI術(shù)后2組外周血EPCs水平、VEGF水平較術(shù)前均升高，但試驗組EPCs水平、VEGF水平高于對照組水平。研究結(jié)果分析過程發(fā)現(xiàn)試驗組外周血EPCs動員增加時，伴有循環(huán)中VEGF水平升高趨勢，這和EPCs水平升高可能存在相關(guān)性。PCI術(shù)后對照組患者外周血中早期EPCs水平的變化，可能是PCI手術(shù)本身引起的骨髓EPCs動員，但也有可能是常規(guī)治療方案干預的促EPCs動員作用。綜合以上研究結(jié)果提示SYD干預NSTE-ACS患者PCI圍手術(shù)期可促進骨髓EPCs動員與歸巢，其機制可能與SYD增加循環(huán)中VEGF水平有關(guān)，并且還可能與激活骨髓中PI-3K/Akt信號通路有關(guān)，這也可能是改善NSTE-ACS患者PCI圍手術(shù)期心肌損傷的機制之一。因入選患者數(shù)量及臨床試驗科研條件受限，上述結(jié)論存在一定局限性，且具體機制有待更多臨床及基礎實驗研究。

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