段琳琳 隋華 朱蕾 張莉 譚紅勝

摘要 目的：探討云南藤黃提取物抑制裸鼠大腸癌植性實體瘤的作用機制。方法：建立裸鼠人結(jié)腸癌皮下移植瘤模型，隨機分為：模型對照組、陽性對照組（5-氟脲嘧啶）、云南藤黃提取物低、中、高劑量組。連續(xù)治療28 d，于末次給藥后12 h，剝?nèi)∧[瘤，稱重，計算抑瘤率；并檢測腫瘤細胞凋亡情況；免疫組化法檢測腫瘤組織中cyclinE1，c-Met和hnRNPK的表達。結(jié)果：云南藤黃提取物低、中、高劑量對腫瘤的抑瘤率分別為12.5%、20.83%和29.17%，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。腫瘤細胞凋亡率增加，并且隨著云南藤黃提取物濃度的增加而增加，具有劑量依賴性（P<0.05）。云南藤黃提取物能明顯降低腫瘤組織中cyclinE1，c-Met和hnRNPK的表達，具有劑量依賴性（P<0.01）。結(jié)論：云南藤黃具有較好的體內(nèi)抗腫瘤作用，可能是通過降低cyclinE1，c-Met和hnRNPK的表達，抑制腫瘤細胞在體內(nèi)增殖。

關(guān)鍵詞 云南藤黃；大腸癌；裸鼠；凋亡；cyclinE1；c-Met；hnRNPK

Abstract Objective：To observe the mechanism of garcinia yunnanensis extract on subcutaneously implanted tumor of human colorectal carcinoma in nude mouse.Methods：A nude mouse model of subcutaneously implanted tumor of human colorectal carcinoma was established，and experimental nude mice were randomly divided into 5 groups：model group，positive control group （5-Fluorouracil），and high/middle/low doses of garcinia yunnanensis group.After 28 days of treatment，the tumor was cut to weigh and anti-tumor rate was calculated，and the apoptosis ratio of tumor cells was analyzed.CyclinE1，c-Met，hnRNPK expression level were analyzed by immuno-histochemical method.Results：The experimental results showed that，the anti-tumor rates in low/middle/high doses of garcinia yunnanensis group were 12.5%，20.83% and 29.17%，which were significantly different from the normal control group （P<0.01）.The apoptosis rate of tumor cells was increased with the increasing of extract concentration of garcinia yunnanensis，which showed a dose-dependent manner （P<0.05）.Garcinia yunnanensis could significantly reduce the expression of cyclinE1，c-Met and hnRNPK with a dose-dependent manner （P<0.01）.Conclusion：Garcinia yunnanensis has an obvious anti-tumor effect in vivo，and it may inhibit the proliferation of tumor cells in vivo by reducing the expression of cyclinE1，c-Met and hnRNPK.

Key Words Garcinia yunnanensis； Colorectal cancer； Nude mice； Apoptosis； CyclinE1； C-Met； HnRNPK

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.02.035

大腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率逐年上升[1-2]。目前，大腸癌的治療多以手術(shù)治療為主，但大多數(shù)患者發(fā)病時已屬晚期，治療及預后不佳。中醫(yī)藥在防治大腸癌的復發(fā)轉(zhuǎn)移及改善患者生存質(zhì)量方面具有較好的治療優(yōu)勢[3-4]，但臨床治療效果個體差異較大，作用機制和作用靶點仍有待進一步明確。我們前期研究表明云南藤黃及其提取的單體成分具有對大腸癌抗凋亡作用[5]，但是云南藤黃抗大腸癌的作用機制仍不明確。因此，我們建立裸鼠人結(jié)腸癌皮下移植瘤耐藥模型，采用云南藤黃提取物進行治療，觀察其對裸鼠人結(jié)腸癌的治療效果，旨在探討云南藤黃提取物體內(nèi)抑制大腸癌的作用機制，為其在臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株

人腸癌SW620細胞購自上海細胞研究所。

1.1.2 動物

Babl/c/nu代小鼠30只，雄性，體質(zhì)量（18±2）g，SPF級，購自中科院動物實驗中心，合格證編號：SCHK（新）2010-0005。實驗前在實驗室常規(guī)飼養(yǎng)1周。

1.1.3 藥物 云南藤黃（Garcinia yunnanensis）采集于中國云南省，由中國科學院西雙版納熱帶植物園王洪教授鑒定，樣品保存在上海中醫(yī)藥大學創(chuàng)新中藥實驗室。云南藤黃的果皮經(jīng)剝離粉碎成粗粉，取100 g果皮粗粉，用500 mL 95%乙醇于室溫浸泡24 h后，90 ℃加熱回流3次，第2次與第3次均為500 mL，每次1 h。合并3次濾液，濃縮至浸膏。實驗前定量稱取，紫外線照射滅菌，無菌蒸餾水溶解，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 試劑 5-氟脲嘧啶（5-FU）為上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號：20070802），抗體，四甲基偶氮唑鹽MTT購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

人腸癌SW620細胞于含10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)液（含青霉素、鏈霉素各100（U/mL）中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 模型制備與分組

取對數(shù)生長的人腸癌SW620細胞，以5×106/只數(shù)量接種于小鼠腋下。7～10 d后形成腫瘤，生長旺盛期的瘤組織剪切成1 mm3左右，在無菌條件下，接種于小鼠右側(cè)腋窩皮下，如此傳3代后，大批接種裸鼠腋下，待瘤體生長約100 mm3隨機分為5組。

1.2.3 給藥方法 每組6只，分別為模型組，陽性對照（5-FU）組，云南藤黃提取物低、中、高劑量聯(lián)合5-FU組。云南藤黃提取物低2.56 mg/（kg·d）、中5.12 mg/（kg·d）、高10.24 mg/（kg·d）劑量組分別每只灌胃，5-FU組尾靜脈注射0.5 mg/（kg·d）的5-FU，模型組每天注射等量的生理鹽水，連續(xù)給藥28 d后，每組中隨機取6只荷瘤裸鼠以頸椎脫臼法處死，剝離腫瘤組織，稱重，測量腫瘤長、寬及質(zhì)量。計算抑瘤率：抑瘤率（%）=（對照組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量）/對照組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.2.4 檢測指標與方法 免疫細胞化學法檢測Ki-67蛋白的表達水平在LNCaP。

組織采用中性福爾馬林4 ℃過夜固定，進行常規(guī)的石蠟包埋并切片。表面抗原修復后孵育一抗hnRNPK，cyclinE1和c-Met（1∶500）并在4 ℃過夜；室溫放置10 min，孵育二抗30 min后，與HRP生物標志鏈反應；蘇木素染色5～20 min，蒸餾水沖洗2 min，鹽酸乙醇分化15 s后蒸餾水沖洗泛藍5 min；脫水后以中性樹脂封片，晾干，置于顯微鏡下拍照觀察。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù)。各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩獨立樣本均數(shù)比較，采用Independent-Samples T Test，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q檢驗（Student-Newman-Keuls法），求出組間差異。以P<0.05為有統(tǒng)計學意義，P<0.01為有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 云南藤黃提取物對大腸癌HCT-116細胞裸鼠移植瘤生長情況的影響

給藥前用游標卡尺測量給藥前各組小鼠腫瘤體積大小，各組之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。給藥1周各組瘤體差別不明顯，進食飲水如常，隨給藥時間延長，各組瘤體大小逐漸出現(xiàn)差距，在用藥24 d開始，各組瘤體體積差異有統(tǒng)計學意義。其中，陽性對照組和云南藤黃提取物高劑量組的瘤體體積相比，有明顯的縮小，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。但是云南藤黃提取物各劑量組對腫瘤的抑制作用不如陽性對照組。提示云南藤黃提取物可以抑制裸鼠腸癌皮下移植瘤的生長，且呈劑量依賴性。

2.2 云南藤黃提取物對大腸癌裸鼠皮下移植瘤抑制率的影響

依表1可見，云南藤黃提取物各個劑量組和5-FU組的皮下移植瘤質(zhì)量均低于模型對照組（P<0.05），5-FU組的抑瘤率最高，云南藤黃提取物劑量組隨云南藤黃取物劑量的升高，抑瘤率逐漸升高，呈劑量依賴性。

2.3 云南藤黃提取物對大腸癌裸鼠移植瘤組織中細胞凋亡的影響

TUNEL檢測顯示：與模型組相比，陽性對照組中腸癌組織細胞凋亡率最高（P<0.01）；云南藤黃提取物劑量組腫瘤組織中腸癌組織細胞凋亡率明顯高于模型組（P<0.05）。見圖2、圖3。圖2結(jié)果顯示，云南藤黃提取物治療的裸鼠，其腫瘤內(nèi)凋亡的細胞明顯增加（P<0.01）；云南藤黃提取物低、中、高劑量組與陽性對照組（5-FU）相比凋亡細胞均明顯減少，且具有劑量依賴性，云南藤黃提取物低劑量組與高劑量組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.4 云南藤黃提取物對裸鼠移植瘤組織細胞內(nèi)cyclinE1，c-Met和hnRNPK的影響

治療后，模型對照組腫瘤組織中cyclinE1，c-Met和hnRNPK的表達陽性率均高于治療組（P<0.05），陽性對照組中hnRNPK，cyclinE1和c-Met的表達與模型對照組無統(tǒng)計學意義，提示5-FU對大腸癌SW620裸鼠皮下移植瘤的抑制作用可能與hnRNPK，cyclinE1和c-Met無關(guān)。但是與對照組相比，云南藤黃提取物各劑量組的hnRNPK，cyclinE1和c-Met的表達明顯低于模型對照組，且成劑量依賴性（P<0.05），提示云南藤黃提取物能夠降低大腸癌SW620裸鼠皮下移植瘤組織內(nèi)cyclinE1，c-Met和hnRNPK的表達。結(jié)果見圖4、表2、表3、表4。

3 討論

目前，在多種腫瘤中均可發(fā)現(xiàn)細胞周期素E（CyclinE）的基因擴增和蛋白表達失調(diào)，CyclinE的異常表達可促進腫瘤的發(fā)展，該基因已經(jīng)被證實是一種癌基因[6]。有報道稱，CyclinE的過度表達與大腸癌的惡性程度和預后密切相關(guān)[7]；抑制CyclinE的表達可以通過抑制細胞周期在G1-S期限制點的轉(zhuǎn)化，阻滯細胞周期，控制腫瘤發(fā)生發(fā)展[8]。

原癌基因c-Met屬于具有酪氨酸激酶活性的生長因子受體類，編碼肝細胞生長因子（Hepatocyte Growth Factor，HGF）受體，它參與細胞信息傳導、細胞骨架重排的調(diào)控，是細胞增殖、分化和運動的重要因素[9，10]。目前研究表明，c-Met基因在大腸癌組織中的表達明顯高于大腸腺瘤組織和正常大腸黏膜組織，且與腫瘤的浸潤深度、Dukes分期、淋巴轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示c-Met的過度表達在大腸腺瘤發(fā)展至大腸腺癌的過程中可能發(fā)揮一定作用[11]。

hnRNPs是存在于細胞核中，由30多個蛋白質(zhì)小分子組成的一種RNA結(jié)合蛋白族[12]。在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、前體mRNA剪切、mRNA輸出和降解等方面起著重要的作用[13]。hnRNPK是該家族中的一員，與多種癌基因及生長因子有密切的關(guān)系[14]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：從中國藤黃屬植物怒江藤黃（Garcinia nujiangensis C.Y.Wu et Y.H.Li）中分離的化合物Nujiangexanthone A（NJXA）通過下調(diào)宮頸癌細胞HeLa中hnRNPK和CyclinE的表達，從而抑制腫瘤細胞的合成、死亡以及細胞周期的改變[15]。云南藤黃為其同屬植物，且已證實云南藤黃及其提取的單體成分具有對大腸癌抗凋亡作用[5]，其單體成分Oblongifolin C對c-Met蛋白激酶具有較好的抑制活性[16]，但對大腸癌體內(nèi)的研究目前尚未開展，因此本實驗旨在探索云南藤黃對大腸癌裸鼠實體瘤的抑制效果以及具體的作用機制。

云南藤黃（Garcinia yunnanensis Hu）為中國藤黃屬植物，又名小姑娘果，是我國特有種，分布于云南省西南部，生于海拔1 300～1 600 m丘陵、坡地的雜木林中。其果實成熟后味酸甜，當?shù)孛褡逑彩秤肹17]?，F(xiàn)代研究表明，云南藤黃所含化合物具有抗腫瘤和抗炎活性[18-19]。近年來，本課題組對云南藤黃進行了系統(tǒng)的抗腫瘤活性成分研究，提取并發(fā)現(xiàn)了多個具有顯著抗腫瘤活性的化合物。體外實驗表明，云南藤黃中的有效成分對多種腫瘤細胞具有抗癌活性，包括人肝癌細胞（HepG2細胞）、人結(jié)腸癌細胞株（HCT116細胞）、人乳腺癌細胞株（MCF-7）以及小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）[20-27]。本研究旨在建立大腸癌裸鼠皮下移植瘤動物模型的基礎上，探討云南藤黃對大腸癌的抑制效果及其作用機制。

本實驗結(jié)果顯示，模型對照組與治療組在裸鼠體重、生活質(zhì)量方面無明顯差異。治療前3周，模型對照組與云南藤黃各劑量組瘤體大小差異不明顯，無統(tǒng)計學意義。進入第4周后，隨給藥時間延長，各組瘤體大小逐漸出現(xiàn)差距，在用藥28 d時，云南藤黃各組呈現(xiàn)劑量依賴性的抑制腫瘤的生長（P<0.01）。該結(jié)果與課題組前期的體外實驗結(jié)果一致，說明云南藤黃能夠抑制人大腸癌腫瘤細胞的生長。TUNEL結(jié)果顯示，云南藤黃對裸鼠腫瘤細胞的凋亡也具有抑制作用，且成劑量依賴性。此外，本研究結(jié)果還顯示，大腸癌SW620裸鼠皮下移植瘤組織內(nèi)cyclinE1，c-Met和hnRNPK的表達較高，給予云南藤黃治療后，其表達明顯下降（P<0.01）。提示云南藤黃抑制大腸癌的生長可能與調(diào)節(jié)cyclinE1，c-Met和hnRNPK三者相關(guān)。說明云南藤黃可能是通過下降cyclinE1，c-Met和hnRNPK等蛋白的表達抑制大腸癌的生長。

綜上所述，本研究在前期證實云南藤黃及其有效成分具有抗腫瘤的基礎上，發(fā)現(xiàn)云南藤黃提取物可以抑制人腸癌皮下移植瘤的生長，增加腫瘤抑制率，誘導腫瘤細胞凋亡。并且，以劑量依賴的方式降低cyclinE1，c-Met和hnRNPK蛋白的表達。因此，明確云南藤黃在人腸癌中的作用及具體機制，將是我們今后需要深入研究的方向，鑒于其來源于植物，在當?shù)鼐哂锌墒秤谩⒉涣挤磻〉呐R床使用價值。后期研究云南藤黃抗腫瘤活性的靶向性將是我們進一步需要深入探討的課題。

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