曾 璟 ，王 平 ，孫吉康 ，楊嵐鵬 ，周 韜 ，榮 健

（中南林業(yè)科技大學(xué) a.生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院；b.環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院， 湖南 長沙 410004）

旱柳在Pb、Cd脅迫下實(shí)時熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選

曾 璟a，王 平b，孫吉康a，楊嵐鵬b，周 韜a，榮 健a

（中南林業(yè)科技大學(xué) a.生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院；b.環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院， 湖南 長沙 410004）

為篩選適用于Pb與Cd脅迫下旱柳實(shí)時熒光定量PCR的內(nèi)參基因，應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)分析UBQ1、TUB6、Actin、EF1α、18SRNA、GAPDH、TUA8和UBQ2這8個內(nèi)參基因在旱柳根部的表達(dá)情況。通過Norm finder、geNorm和Best Keeper3個軟件進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)在Pb與Cd脅迫下表達(dá)較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因均為EF1α、GAPDH和Actin，差別是在Pb脅迫下的旱柳根組織中最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因是EF1α，而在Cd脅迫下的旱柳根組織應(yīng)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。該研究結(jié)果可用于旱柳根組織在Pb、Cd脅迫下基因表達(dá)的進(jìn)一步研究。

鉛；鎘；實(shí)時熒光定量PCR；內(nèi)參基因

常用檢測基因表達(dá)水平的方法有4種，分別是實(shí)時定量PCR(quantitative real-time polymerase chain, qRT- PCR)、原位雜交(in situ hybridization,ISH)、Northern印 跡 (northern blot)和 DNA 微陣列(DNA microarray)[1]。qRT-PCR是最為常用的一種，其具有定量快速準(zhǔn)確、重復(fù)性好、高靈敏度和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)[2]，已被廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、生物科學(xué)、分子醫(yī)學(xué)以及診斷學(xué)等領(lǐng)域。qRT-PCR對所提取RNA的品質(zhì)、模板cDNA的濃度和質(zhì)量、引物的特異性、擴(kuò)增效率以及內(nèi)參基因的選擇等有著嚴(yán)格的要求[3]，因此篩選表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因是qRT-PCR至關(guān)重要的一部分。內(nèi)參基因也被稱作管家基因或看家基因，內(nèi)參基因的作用是為了消除在運(yùn)用qRT-PCR方法計算基因相對表達(dá)量時，由于RNA質(zhì)量、不同效率的酶促反應(yīng)以及其他因素引起的偏差[4]。目前在植物學(xué)研究中，常用穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因有18S核糖體RNA（18SrRNA）、微管蛋白基因（Tubulin）、多素泛聚酶基因（UBQ）、肌動蛋白基因（Actin）、甘油醛-3-磷酸-脫氫酶基因（GAPDH）以及延伸因子基因（EF1-α）等[5]。內(nèi)參基因的穩(wěn)定性在不同植物組織部位、生長環(huán)境等因素下都會產(chǎn)生不同程度的表達(dá)差異[6]，因此根據(jù)不同的材料，不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計選擇合適的內(nèi)參基因在qRT-PCR中就很有必要。

旱柳（Salix matsudanakoids）作為一種對多種重金屬有較強(qiáng)耐受性的木本能源植物，在修復(fù)土壤重金屬污染方面有著巨大的潛力[7-11]。針對旱柳的這一特性，Yang等[12]運(yùn)用分子生物學(xué)手段研究了Cd脅迫下旱柳根與葉的轉(zhuǎn)錄組和生理響應(yīng)機(jī)制，同時還發(fā)現(xiàn)旱柳轉(zhuǎn)錄組和生理對Cd脅迫的響應(yīng)表現(xiàn)出組織特異性。楊衛(wèi)東等[13]系統(tǒng)地研究了旱柳對Cd的積累、忍耐與解毒生理機(jī)制，以及Cd脅迫對旱柳幼苗的生長、低分子量巰基化合物含量、抗壞血酸－谷胱甘肽循環(huán)、谷胱甘肽代謝的影響。朱健等[14]研究旱柳對Pb的耐性和富集、轉(zhuǎn)運(yùn)特征，分析了旱柳根、莖、葉的生理生化、微觀結(jié)構(gòu)、官能團(tuán)組成、礦質(zhì)元素吸收對不同含量Pb脅迫的響應(yīng)。由于旱柳在重金屬脅迫下的內(nèi)參基因篩選尚無報導(dǎo)，為了研究Pb、Cd脅迫下旱柳根部主要的3種抗性酶的基因表達(dá)量，本文針對Pb、Cd脅迫下旱柳根部的內(nèi)參基因篩選進(jìn)行研究，為今后旱柳在Pb、Cd脅迫下的分子研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料和處理方法

本實(shí)驗(yàn)使用的旱柳取自浙江旱柳養(yǎng)殖基地1年生幼苗。將長勢一致的旱柳枝條修剪為15 cm長，放入燒杯中進(jìn)行水培，水培基質(zhì)為1 L純水加入3滴濃縮培養(yǎng)液組成，水培14 d待扦插的旱柳根部生長至一定程度之后進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)（見表1）。實(shí)驗(yàn)設(shè)計2種重金屬離子脅迫處理，分別為Cd與Pb，每種重金屬脅迫設(shè)置4組梯度3組平行實(shí)驗(yàn)，然后將根部生長較好的旱柳水培苗以每十枝一組分別放入不同重金屬離子濃度梯度的燒杯中培養(yǎng)，培養(yǎng)14 d后取根系用液氮速凍后放入-80 ℃冰箱保存，供下一步分析。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計的樣品濃度梯度Table 1 Experimental design of the sample concentration gradient

1.2 RNA提取和cDNA合成

利 用TIAN GEN RNA prep Pure Plant Kit（Polysaccharides & Polyphenolics rich）RNA prep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取旱柳根部總RNA，并用DNase I (RNase free)消化去除DNA污染。用瓊脂糖電泳檢測總RNA提取質(zhì)量并拍照。然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript TM RTreagent Kit with g DNA Eraser將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將獲得的產(chǎn)物放入-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 內(nèi)參基因的篩選與引物設(shè)計

選擇8個常用的內(nèi)參基因作為候選基因，這8個基因分別是ACT(肌動蛋白基因)、TUA8(α微管蛋白基因)、TUB6(β微管蛋白基因)、GAPDH(甘油醛-3-磷酸-脫氫酶基因)、18SrRNA(18S 核糖體RNA基因)、EF1α（轉(zhuǎn)錄延伸因子）、UBQ2(泛素基因)、UBQ1(泛素基因)。通過同源基因序列比對之后，利用軟件primer5.0進(jìn)行引物設(shè)計。

1.4 內(nèi)參基因的普通PCR

反應(yīng)體系為 20 μL，其中包括 0.5 μL 10 μmol·L-1上游引物、0.5 μL 10 μmol·L-1下游引物，1 μL cDNA 模 板，10.5 μLPCRmix 和 7.5 μL dd H2O。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性15 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。最后用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.5 內(nèi)參基因qRT-PCR擴(kuò)增程序

采用CFX96 Real-Time PCR Detection System進(jìn)行各內(nèi)參基因的qRT-PCR分析。反應(yīng)體系10 μL，包括SYBR Green Fast q PCR Master Mix (BBI)5 μL、0.2 μLROX Reference Dye Ⅱ (10 μmol/L)、1 μL 10 μmol·L-1上游引物、1 μL 10 μmol·L-1下游引物、2 μL cDNA 2 μL 和 0.8 μL dd H2O。每個樣品重復(fù)3次，并設(shè)置不加模板的陰性對照。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，57 ℃退火34 s。采集溶解曲線熒光信號。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用相對定量法分析。

1.6 內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率與線性考察

隨機(jī)選取Pb脅迫下的旱柳的第一鏈cDNA樣品，用dd H2O依次稀釋5個梯度，稀釋梯度為起始模板濃度的1、1/2、1/4、1/8和1/16。每個反應(yīng)設(shè)3個技術(shù)重復(fù)，按1.5的反應(yīng)體系和程序進(jìn)行分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)共用3種軟件geNorm、Bestkeeper和Norm Finder，分析8個常用的內(nèi)參基因在不同濃度的Pb與Cd脅迫下的表達(dá)穩(wěn)定性。

程序根據(jù)8個常用內(nèi)參基因在不同濃度的Pb與Cd脅迫下對8個內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析，篩選合適的內(nèi)參基因。根據(jù)公式Q=EΔCt利用Excel 2010對各個擴(kuò)增樣品的Ct值計算8個內(nèi)參基因的相對表達(dá)量。其中E為基因擴(kuò)增效率，ΔCt=Ct(min)?Ct(樣品 )，Ct(min)為所有樣品中最低的Ct值，Ct(樣品)為每個樣品的Ct值[15]。

2 結(jié)果分析

2.1 RNA樣品品質(zhì)的檢測

各總RNA樣品在濃度適宜的情況下OD值在A260/A280以及A260/A230均為1.8左右，均可滿足轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)的要求，各總RNA樣品均呈現(xiàn)28 S和18 S共2條清晰的條帶（見圖1），并且28 S條帶亮度較為明亮大約為18 S條帶的2倍，說明RNA完整性良好，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求[16]。

圖1 旱柳根組織部位總RNA的電泳結(jié)果Fig. 1 Electrophoresis results of total RNA extracted from roots of Salix matsudana

2.2 內(nèi)參基因的普通PCR擴(kuò)增

經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示，各內(nèi)參基因的普通PCR結(jié)果均可見預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物，在100～250 bp之間存在較亮的特異條帶，且條帶單一，沒有引物二聚體及非特異性條帶，表明引物設(shè)計成功，可用于后續(xù)qRT-PCR分析（見圖2）。

2.3 內(nèi)參基因的線性分析

圖2 8種內(nèi)參基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 PCR products of eight reference genes

將cDNA模板以2倍梯度稀釋，對8個內(nèi)參基因作標(biāo)準(zhǔn)曲線分析，結(jié)果為線性關(guān)系很好，各內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為R2≥0.990。并且，擴(kuò)增效率E均在100%以上（見表2），各3組技術(shù)重復(fù)的樣品間的重復(fù)性良好，熔解曲線均只產(chǎn)生單一的熔解峰，不存在引物二聚體等非特異擴(kuò)增。表明各內(nèi)參基因的線和性擴(kuò)增效率均符合要求。

2.4 內(nèi)參基因Ct值分析

通過qRT-PCR分析可以得到8個內(nèi)參基因在Pb和Cd不同濃度脅迫下旱柳根部的Ct值。由基因表達(dá)量與Ct值呈反比，可得知在Pb與Cd脅迫下表達(dá)量最高的都是18SRNA。并且可以觀察到不同濃度的Cd脅迫對內(nèi)參基因表達(dá)量的影響更加明顯（見圖3）。

2.5 內(nèi)參基因的篩選

2.5.1 geNorm 分析

geNorm V3.5是根據(jù)平均表達(dá)穩(wěn)定指數(shù)M判斷內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，M值越大則表示內(nèi)參基因越不穩(wěn)定，反之則越穩(wěn)定[17]。M=1.5為判定上線，只有M＜1.5才認(rèn)為內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定。geNorm分析結(jié)果表明，8個內(nèi)參基因的M值均＜1.5，說明這8個內(nèi)參基因都比較穩(wěn)定，而在Pb脅迫條件下EF1α與GAPDH的M值最小，說明在此條件下這兩個內(nèi)參基因表達(dá)最為穩(wěn)定，8個內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序?yàn)镋F1α＝GAPDH＞18SRNA＞Actin＞UBQ2＞TUB6＞TUA8＞UBQ1；在Cd脅迫條件下Actin與GAPDH的M值最小，說明在此條件下這兩個基因表達(dá)最為穩(wěn)定8個內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序?yàn)镚APDH＝Actin＞EF1α＞TUB6＞UBQ2＞TUA8＞UBQ1＞18SRNA（見圖4）。

2.5.2 BestKeeper 分析

BestKeeper分析標(biāo)準(zhǔn)變異系數(shù)和變異相關(guān)系數(shù)來判斷其表達(dá)穩(wěn)定性，運(yùn)用Ct值計算標(biāo)準(zhǔn)偏差SD來進(jìn)行分析內(nèi)，SD值越小，基因的穩(wěn)定性越好。若SD＞1，則認(rèn)為該基因不穩(wěn)定[18]。有結(jié)果分析可以的到在Pb脅迫下表達(dá)最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)閁BQ2其次是GAPDH，8個內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序?yàn)閁BQ2＞GAPDH＞TUB6＞EF1α＞18SRNA＞Actin＞UBQ1＞TUA8；在Cd脅迫下表達(dá)最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)門UB6其次是18SRNA，8個內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序?yàn)門UB6＞18SRNA＞Actin＞EF1α＞GAPDH＞UBQ2＞TUA8＞UBQ1（見表3與表4）。

表2 qRT-PCR檢測中所用的8個看家基因的引物序列及在Pb、Cd脅迫下的PCR擴(kuò)增效率Table 2 Primer sequences and PCR efficiency of eight reference gene under stress of Pb and Cd for q RT-PCR analysis

圖3 在Pb、Cd脅迫下8個內(nèi)參基因旱柳根組織中的表達(dá)情況（左圖為Pb脅迫，右圖為Cd脅迫）Fig. 3 Expression levels of eight reference genes in roots under Pb and Cd stress of Salix matsudana

圖4 Pb、Cd脅迫下8個看家基因的表達(dá)穩(wěn)定性的geNorm分析（左圖為Pb脅迫，右圖為Cd脅迫）Fig. 4 Expression stability of eight reference genes analyzed under Pb and Cd stress by geNorm

表3 用Best Keeper軟件分析Pb脅迫下內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性Table 3 Expression stability of reference genes analyzed under stress of Pb by Best Keeper

表4 用Best Keeper軟件分析Cd脅迫下內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性Table 4 Expression stability of reference genes analyzed under stress of Cd by Best Keeper

2.5.3 Norm Finder 分析

Norm Finder程序是運(yùn)用Excel進(jìn)行計算方差，根據(jù)方差分析得到M值，根據(jù)M值評價內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，M值越大則表示內(nèi)參基因越不穩(wěn)定，反之則越穩(wěn)定[19]。經(jīng)過計算的出8個內(nèi)參基因不同脅迫條件下的M值，Pb脅迫下EF1α的M值最小，穩(wěn)定性最佳，其次是Actin穩(wěn)定性為第二，8個內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序?yàn)镋F1α＞Actin＞GAPDH＞18SRNA＞TUB6＞UBQ2＞TUA8＞UBQ1；Cd脅迫下GAPDH穩(wěn)定性最佳，其次是EF1α，8個內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序?yàn)镚APDH＞EF1α＞TUB6＞Actin＞UBQ2＞TUA8＞UBQ1＞18SRNA（見圖5）。

圖5 Pb、Cd脅迫下8個看家基因的表達(dá)穩(wěn)定性的 Norm Finder 分析（左圖為Pb脅迫，右圖為Cd脅迫）Fig. 5 Expression stability of eight reference genes analyzed under Pb and Cd stress by Norm Finder

綜上所述，根據(jù)3種軟件geNorm、Bestkeeper和Norm Finder分析結(jié)果可知，在Pb和Cd脅迫下旱柳根部的8個內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性略有差異，Pb脅迫下表達(dá)最為穩(wěn)的內(nèi)參基因?yàn)镋F1α，而Cd脅迫下表達(dá)最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)镚APDH（見表5），因此EF1α與GAPDH可作為旱柳在Pb與Cd脅迫下基因研究的內(nèi)參基因。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)基于 Genorm、Bestkeeper和NormFinder軟件分別分析比較了在Pb與Cd脅迫下UBQ1、TUB6、Actin、EF1α、18SRNA、GAPDH、TUA8和UBQ2等8個內(nèi)參基因在旱柳根部的表達(dá)情況。這3個軟件由于算法不相同所以分析得出的結(jié)果也不相同，這種情況也經(jīng)常出現(xiàn)在其他的研究中[20-21]，綜合分析可以得出本研究中Pb與Cd脅迫下表達(dá)較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因均為EF1α、GAPDH和Actin，只是在這兩種重金屬離子脅迫下表達(dá)穩(wěn)定的程度不一致，而最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因都為UBQ1。EF1α是一種多功能蛋白，其參與多種重要的細(xì)胞學(xué)過程例如：癌基因轉(zhuǎn)化、病毒復(fù)制、細(xì)胞骨架組成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、翻譯控制及凋亡等[22]。在Jain等的研究過程中發(fā)現(xiàn)，在水稻Oryza sativa不同的組織和發(fā)育期表達(dá)比較穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)镋F1α[23]。當(dāng)楊樹組織處在干旱脅迫下，EF1α基因的表達(dá)也很穩(wěn)定[24]；GAPDH是糖酵解反應(yīng)中的一個不可缺少的酶類，在大部分組織中都高水平表達(dá)并且在同種組織或者細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)量一般恒定，在部分研究中，例如在毛果楊和煙草組織中GAPDH相對不穩(wěn)定不適合做為內(nèi)參基因[25-26]，但在甘蔗Saccharum of ficinarum的不同組織器官中表達(dá)最為穩(wěn)定的為GAPDH[27]，并且在本研究的Pb與Cd脅迫下其表現(xiàn)也非常穩(wěn)定。Actin基因編碼的肌動蛋白普遍存在于真核生物中，是一種重要的蛋白質(zhì)，參加多種重要的生理活動，幾乎在所有的真核細(xì)胞中具有較為穩(wěn)定的表達(dá)[28]。內(nèi)參基因應(yīng)該是不受環(huán)境、非生物及生物脅迫等影響且在生物體不同組織、不同細(xì)胞中均穩(wěn)定表達(dá)的一類基因，但是實(shí)際情況下內(nèi)參基因的穩(wěn)定性是相對的。所以應(yīng)該根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)對象，不同的實(shí)驗(yàn)環(huán)境來篩選出合適的內(nèi)參基因[29]。因此本實(shí)驗(yàn)篩選的2個相對穩(wěn)定的內(nèi)參基因，僅適用于在Pb與Cd脅迫下旱柳根部組織中基因表達(dá)水平的研究，其他組織或脅迫條件有待進(jìn)一步完善。

表5 在Pb、Cd脅迫下內(nèi)參基因穩(wěn)定性Table 5 Stability ranking of candidate reference genes under stress of Pb and Cd

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)Genorm、Bestkeeper和NormFinder軟件分析得出，內(nèi)參基因EF1α、GAPDH和Actin在Pb與Cd脅迫下表達(dá)均較為穩(wěn)定，在Pb脅迫下最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)镋F1α，而在Cd脅迫下應(yīng)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。本實(shí)驗(yàn)為后續(xù)進(jìn)行的Pb與Cd對旱柳根部組織中主要抗性酶的基因表達(dá)的影響提供基礎(chǔ)資料，同時也為其他重金屬脅迫下內(nèi)參基因的篩選提供參考。

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Selection of reference genes for quantitative real-time PCR inSalix matsudanaunder stress of Pb and Cd

ZENG Jinga, WANG Pingb, SUN Jikanga, YANG Lanpengb, ZHOU Taoa, RONG Jiana
(a. College of Life Science and Technology; b. College of Environmental Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

In order to screen the internal reference gene ofSalix matsudanaunder the stress of Pb and Cd, the quantitative analysis ofUBQ1,TUB6,Actin,EF1α,18SRNA,GAPDH,TUA8andUBQ2genes in the roots ofSalix matsudanawere studied by fluorescence quantitative reaction Expression. The results showed that the stability ofEF1α,GAPDHandActinwere better, but the degree of expression stability is not consistent under stress of Pb and Cd, through the combination of Normfinder, geNorm and Best Keeper.Therefore, the most stable reference geneEF1αshould be selected under Pb stress, And the most stable internal reference geneGAPDHshould be selected under Cd stress.The results of this study can be used for the further study ofSalix matsudanathe roots of gene expression under Pb and Cd stress.

lead; cadmium; quantitative real-time PCR; reference gene

S792.12；X53

A

1673-923X(2017)08-0086-07

10.14067/j.cnki.1673-923x.2017.08.015

2016-12-12

湖南省重點(diǎn)研發(fā)計劃項(xiàng)目“微生物-植物協(xié)同修復(fù)土壤重金屬污染及配套支撐技術(shù)”（2016SK2030）

曾 璟，碩士研究生

王 平，教授； E-mail：wangping@csuft.edu.cn

曾 璟，王 平，孫吉康,等. 旱柳在Pb、Cd脅迫下實(shí)時熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2017,37(8): 86-92.

[本文編校：文鳳鳴]