賀文斌，趙景壯，盧彤巖，尹家勝，徐黎明

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

傳染性胰壞死病毒的生物學(xué)研究進(jìn)展

賀文斌1,2，趙景壯1，盧彤巖1，尹家勝1，徐黎明1

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

傳染性胰壞死病（infectious pancreatic necrosis，IPN）是一種危害多種水產(chǎn)動物的急性傳染性疫病，能造成鮭鱒稚魚大量死亡，造成世界范圍內(nèi)鮭鱒養(yǎng)殖業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失。IPN的病原為雙鏈RNA病毒科（Birnaviridae）水生雙鏈RNA病毒屬（Aquabirnavirus）的傳染性胰臟壞死病毒（infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）。本文概述了該病原的基因組結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特征、診斷技術(shù)及免疫防治等研究進(jìn)展，以期為IPN的防治提供參考。

傳染性胰壞死病毒（IPNV）；水生雙鏈RNA病毒；基因型；血清型；鮭鱒

傳染性胰壞死病毒（Infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）主要感染鮭鱒稚魚，一般在春季暴發(fā)，水溫10℃時(shí)最易感染[1]。由于毒株、宿主和環(huán)境因素的不同，IPNV可造成虹鱒Oncorhynchus mykiss 10%～90%的死亡率[2,3]。病魚常具有食欲減退、體色發(fā)黑、眼球突出、腹部腫脹、肛門紅腫等癥狀，解剖后可見胰腺壞死、腎臟腫大、腸內(nèi)有粘液狀滲出物、腹水等癥狀。晚期病魚的肝臟和鰓上皮組織嚴(yán)重出血，肝臟和胰臟細(xì)胞核固縮，出現(xiàn)空泡變性，胰腺中有炎癥細(xì)胞浸潤的脂肪組織發(fā)生彌散性壞死。感染IPNV幸存的魚可不再發(fā)病，但是終生攜毒，依然能傳染病毒。IPNV可通過攜帶病毒的水體、網(wǎng)具、容器、染病魚的排泄物和精液進(jìn)行水平傳播，也可由親代通過受精卵（無癥狀的攜病毒魚卵或懷卵魚被病毒感染）對子代進(jìn)行垂直傳播。

1 IPNV基因組結(jié)構(gòu)

IPNV病毒顆粒呈20面體，無囊膜，有92個(gè)殼粒，直徑67nm[4]。衣殼內(nèi)有由2個(gè)片段組成的雙股RNA基因，片段A編碼一個(gè)多聚蛋白，包括VP2、VP3、VP4，并通過間隔的ORF編碼一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白VP5；片段B編碼一個(gè)依賴于RNA的RNA聚合酶（VP1）[5]。VP2蛋白是IPNV的主要外衣殼蛋白，含有病毒的主要抗原決定簇，并含有病毒特異性中和抗原表位[6]，經(jīng)常用于病毒的診斷、血清型分類及疫苗設(shè)計(jì)。

2 IPNV生物學(xué)特征

2.1 基因型分型

用MegAlign軟件分析基因型，以VP2基因片段為目標(biāo)基因，同GenBank收錄的其他國家IPNV分離株及部分水生雙RNA病毒進(jìn)行VP2核苷酸序列同源性分析。Blake等[7]證明，IPNV病毒基于VP2氨基酸序列可分為6個(gè)基因組genogroups（1-6）。一些研究者認(rèn)為，海洋雙RNA病毒應(yīng)該形成一個(gè)新的基因組genogroup7[8,9]，Ji等[10]對一株分離于虹鱒的中國IPNV毒株ChRtm213采用鄰位相鄰法構(gòu)建了IPNV的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）。該進(jìn)化樹清晰地將目前水生雙RNA病毒分為7個(gè)基因組。

2.2 血清分型

水生雙RNA病毒含有10個(gè)血清型，包括A組血清型 A1 （West Buxton，WB）、A2（Spajarup，Sp）、A3（Abild，Ab）、A4（Hecht，He）、A5（Tellina，Te）、A6（Canada1，C1）、A7（Canada2，C2）、A8（Canada3，C3）和 A9 （Jasper，Ja），B 組 血 清 型 B1（Tellinavirus，TV-1）。根據(jù)IPNV的多聚蛋白氨基酸序列，可將IPNV分為 6個(gè)基因簇（Genogroup 1-6），其中Genogroup1對應(yīng)血清型為A3，Genogroup 2為A5和A6，Genogroup3 為 A2，Genogroup 4 為 A7 和 A8，Genogroup5 為 A1 和 A9，Genogroup6 為 A4[11，12]，見表1。血清型A1主要出現(xiàn)在美國，血清型A6-A9主要出現(xiàn)在加拿大，血清型A2-A5和B1多出現(xiàn)在歐洲和亞洲[13]。中國早期IPNV分離株血清型均為A2（Sp），病毒滴度高，具有很高的致死性[14]。劉淼等[15]于2013年從云南某虹鱒養(yǎng)殖場的發(fā)病魚分離出一株IPNV（命名為ChRtm213）。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，該ChRtm213分離株屬于Genogroup5基因型，與A1（Ja）血清型的美國的VR299、西班牙的2310株的VP2具有較高相似度。上述研究結(jié)果說明，目前中國至少有兩種血清型的IPNV毒株。

圖1 基于ChRtm213與其他水生雙RNA病毒A片段基因組序列同源性分析構(gòu)建的進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic relationship of ChRtm213 and other reference aquabirnaviruses strains based on complete genome of segment A using the neighborjoining method

3 IPNV診斷技術(shù)

3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（Reverse transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）根據(jù)特定病毒的核苷酸序列設(shè)計(jì)特異性引物，然后擴(kuò)增核酸以檢測病毒[16]。吳斌等[17]針對IPNVA片段VP5基因和VP3基因分別設(shè)計(jì)了兩對特異性引物，建立了成熟的IPNV RT-PCR檢測法。熒光定量RT-PCR檢測法是一種對PCR反應(yīng)中的循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實(shí)時(shí)檢測和對起始模板進(jìn)行定性定量分析的高靈敏檢測方法。徐曄等[18]建立了Taqman探針熒光定量RT-PCR檢測IPNV的方法，引物和探針只與IPNV的核酸特異性結(jié)合，與鯉春病毒血癥病毒（Spring viraemia ofcarp virus，SVCV）、病毒性出血性敗血癥病毒（Viral hemorrhagic septicemia virus，VHSV）、傳染性造血器官壞死病毒（Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV）、草魚草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）和流行性造血器官壞死病毒（Epizootic haematopoietic necrosis virus，EHNV）均無交叉反應(yīng)。

3.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）

LAMP是一種新型體外等溫?cái)U(kuò)增特異核酸片段的技術(shù)[19]。與常規(guī)PCR相比，不需要對模板進(jìn)行熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察過程。不用專門的儀器設(shè)備就可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，具有簡單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。在LAMP的基礎(chǔ)上可使用逆轉(zhuǎn)錄LAMP（RT-LAMP）對特異RNA分子進(jìn)行等溫快速擴(kuò)增。Soliman[20]將RT-LAMP引入到病毒檢測中，并向反應(yīng)產(chǎn)物中添加SYBR Green I熒光染料，建立了IPNV的RT-LAMP可視化檢測方法。

表1 水生雙RNA病毒的生物學(xué)分類Tab.1 Biological classification of aquabirnaviruses

3.3 酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

以上方法靈敏度高，但需要檢測儀器，存在變異性，用于檢測臨床樣本的穩(wěn)定性較低。相比較，單克隆抗體具有均質(zhì)性好和易于標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。王健楠等[21]擴(kuò)增了IPNV-ZYX分離株結(jié)構(gòu)蛋白VP2的抗原表位區(qū)基因（616 bp），命名為IPNV VP2 COE，VP2 COE蛋白可作為IPNV的診斷抗原，為間接免疫熒光檢測IPNV方法的建立提供了更加現(xiàn)實(shí)的理論依據(jù)。連科訊等[22]利用純化的IPNVVP2 COE重組蛋白作為免疫原免疫小鼠，將小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤SP2/0細(xì)胞融合，采用間接ELISA篩選雜交瘤細(xì)胞，制備的特異性單抗可應(yīng)用于間接免疫熒光法檢測IPNV。

單克隆抗體法檢測IPNV病毒為更深入研究奠定了基礎(chǔ)。張琳琳等[23]利用鼠抗IPNV VP2單抗及兔抗IPNV VP2建立了雙抗體夾心ELISA檢測法。試驗(yàn)中獲得抗體較純，克服了同屬抗體之間的交叉反應(yīng)及同株抗體捕獲抗原能力弱的缺點(diǎn)，提高了檢測的特異性，減少了假陽性結(jié)果。該方法適合于基層現(xiàn)場檢驗(yàn)需要，已應(yīng)用于動物疫病的臨床診斷。

3.4 免疫熒光法（immunological fluorescence as－say test，IFAT）

用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法，也叫免疫熒光法。Xu等[24]采用抗原抗體共表達(dá)的顯示技術(shù)，配合使用流式細(xì)胞儀檢測熒光信號，便捷而準(zhǔn)確地獲得IPNV ChRtm213的單鏈抗體（single-chain antibodyfragment，scFv）。實(shí)驗(yàn)證明，該scFv可以特異性識別IPNV ChRtm213，能作為診斷試劑檢測IPNVChRtm213。

3.5 核酸探針與基因芯片

核酸探針是繼免疫學(xué)診斷技術(shù)之后發(fā)展起來的新技術(shù)。有用32P標(biāo)記的寡核苷酸DNA探針[25]、多核苷酸cDNA探針[26]和用生物素標(biāo)記的寡核苷酸DNA探針[27]等快速檢測IPNV的研究。基因芯片是一種生物芯片，將大量探針分子固定后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測探針分子的雜交信號強(qiáng)度來獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。王勝強(qiáng)等[28]建立的基因芯片檢測技術(shù)能夠在一個(gè)微陣列中與7種病毒10個(gè)基因的標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)雜交，可以同步檢測包括IPNV在內(nèi)的7種重要的養(yǎng)殖魚類病毒，具有通量高、特異性強(qiáng)的優(yōu)勢。

4 IPNV免疫防治

4.1 免疫原理

疫苗是有效防治IPNV的重要措施。IPNV病毒疫苗多基于VP2和VP3等結(jié)構(gòu)蛋白的基因，VP2蛋白攜帶決定病毒毒力和適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)的因子[29]。以往的研究證實(shí)，VP2蛋白的217～221氨基酸殘基與病毒毒力相關(guān)[30]。表達(dá)的VP2蛋白可在宿主細(xì)胞中自我組裝亞病毒顆粒，對虹鱒注射純的VP2亞病毒顆?；蛭故澈兄亟M蛋白的載體菌，都可以引起魚的特異性免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生抗體，降低IPNV侵染的病毒載量和患病率[31]。VP3也是IPNV重要的功能蛋白。Moon等[32]分別將VP3基因和VP2基因在大腸桿菌中表達(dá)純化后免疫虹鱒。ELISA和中和試驗(yàn)檢測免疫后虹鱒血清的抗體效價(jià)，發(fā)現(xiàn)VP3蛋白也具有很好的免疫原性。趙麗麗等[33]構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET30b-VP3在大腸桿菌BL21中表達(dá)，通過Western-blotting以及ELISA檢測表明，表達(dá)的融合蛋白與天然VP3蛋白一樣具有免疫原性和反應(yīng)原性。劉巍巍等[34]對IPNV VP3基因的分段表達(dá)及其抗原表位區(qū)域分析進(jìn)一步精確定位VP3蛋白抗原表位奠定了基礎(chǔ)。開發(fā)基于IPNV結(jié)構(gòu)蛋白的多聯(lián)亞單位疫苗是防控IPNV的重要方向[35]。

4.2 免疫方法

理想的疫苗應(yīng)在早期接種以產(chǎn)生持久的保護(hù)，對幼齡魚進(jìn)行口服或浸泡免疫更適用于早期接種。而免疫效果與免疫方法和免疫劑量均有關(guān)系[36]。不同抗原運(yùn)載系統(tǒng)疫苗的作用功效也不同[37]。de las Heras等[38]與Natalia A等[39]將IPNV的VP2疫苗包被在海藻酸鹽顆粒中，口服免疫虹鱒后保護(hù)率分別達(dá)80%和78%～85.9%。Miguel Reyes等[40]將 DNA疫苗添加到飼料中口服免疫大西洋鮭Salmon salar，免疫組與非免疫組的體重和長度相近，表明該疫苗沒有影響腸道功能和干擾營養(yǎng)吸收。Arun K Dhar等[41]將人類癌基因的抗原表位c-myc克隆后在酵母中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IPNV rVP2的SVP能耐受插入外來抗原基，不影響其蛋白質(zhì)或插入的外來抗原表位的抗原表達(dá)，這為開發(fā)IPNVrVP2SVP多價(jià)疫苗奠定了基礎(chǔ)。還有用鮭氣單胞菌Aeromonas salmonicida[42]和乳酸菌Lactobacillus等表達(dá)的疫苗免疫大西洋鮭。劉敏等[43]將IPNV的VP2、VP3基因插入到乳酸菌表達(dá)載體中，構(gòu)建重組干酪乳桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)后口服免疫虹鱒幼魚，誘導(dǎo)虹鱒局部粘膜免疫和全身免疫反應(yīng)，免疫后病毒載量顯著減少。

Skjesol等[44]發(fā)現(xiàn)，使用PKR激活促進(jìn)細(xì)胞的病毒復(fù)制，而使用PKR抑制劑可減少病毒復(fù)制。免疫基因的死亡率和表達(dá)水平與病毒復(fù)制率、病毒基因序列有關(guān)。病毒基因組的快速變化可顯著降低病毒的增殖可能表明了較高的易感性的保護(hù)機(jī)制，即疾病的爆發(fā)和死亡率取決于宿主防御和病毒基因組特性[45]。有些疫苗雖然能刺激機(jī)體免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體，但并不能產(chǎn)生有效的保護(hù)作用，而在試驗(yàn)階段具保護(hù)作用的免疫制劑在生產(chǎn)中并不能真正起保護(hù)作用，這就亟待開發(fā)疫苗免疫效果的評價(jià)體系。除了免疫防治，國內(nèi)外研究者也在尋找能夠抑制IPNV病毒的其他方法，如某些芳香衍生物對IPNV病毒復(fù)制具有抑制作用[46]；一些乳制品蛋白質(zhì)的早期酶解產(chǎn)物對IPNV具有一定的抗病毒活性[47]。Marroqui等[48]報(bào)道了霉酚酸（mycophenolic acid，MPA）能抑制次黃嘌呤核苷酸脫氫酶（Inosine 5′-monophosphate dehydrogenase，IMPDH） 而間接抑制細(xì)胞GMP的合成，使IPNV RNA的合成缺乏原料，抑制了IPNV的復(fù)制。

5 展望

IPN造成虹鱒高死亡率，嚴(yán)重威脅鮭鱒養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，開發(fā)有效的疫苗是最有效的預(yù)防方法，需繼續(xù)對IPNV的感染機(jī)理、魚類免疫反應(yīng)[49-51]等開展更加深入的研究。更加豐富的研究方法對IPN的防治技術(shù)也有重大意義，如用基因工程技術(shù)將抗原蛋白與受體結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及信號肽融合，使抗原能夠精確定位到效應(yīng)細(xì)胞[52]，通過流式細(xì)胞術(shù)分析病毒感染后體內(nèi)白細(xì)胞的變化，掌握病毒在體內(nèi)的不同感染時(shí)期[53]，采取針對性地的治療措施。

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Progress on Biological Research of Infectious Pancreatic Necrosis Virus:a Review

HE Wen-bin1,ZHAO Jing-zhuang1,LU Tong-yan1,YIN Jia-sheng1,XU Li-ming1
（1.Heilongjiang River Fishery Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China;2.College of Fishery and Life Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China）

Infectious pancreatic necrosis （IPN）as an acute infectious disease of many aquatic animals,can cause high mortalities in worldwide salmon and trout fingerlings,whose pathogen,infectious pancreatic necrosis virus（IPNV）,belongs to the Aquabirnavirus within the family Birnaviridae.This review summarizes the genomic structure,biological characteristics,diagnostic techniques and immunological control of the pathogen,in order to provide reference for the prevention and treatment of IPN.

infectious pancreatic necrosis virus （IPNV）;Aquabirnavirus,aquatic double stranded RNA virus;genotype;serotype;salmon and trout

S941

A

1005-3832（2017）06-0001-06

2017-06-29

中央公益性事業(yè)單位基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（HSY201514）.

賀文斌（1992-），女，碩士研究生，從事魚類病毒學(xué)研究.E-mail:981073106@qq.com

徐黎明，女，博士，副研究員，從事魚類病毒學(xué)研究.E-mail:lmxu0917@163.com