王亞楠，李秀啟，客涵，叢旭日，師吉華

（山東省淡水漁業(yè)研究院，山東省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點實驗室，山東 濟南 250013）

基于線粒體COI基因序列的南四湖外來須鰻蝦虎魚的種類鑒定

王亞楠，李秀啟，客涵，叢旭日，師吉華

（山東省淡水漁業(yè)研究院，山東省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點實驗室，山東 濟南 250013）

在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，采用線粒體COI基因特異擴增測序及GenBank蝦虎魚亞科相近屬已有序列聯(lián)合配對分析的方法鑒定了南四湖須鰻蝦虎魚Taenioides cirratus的分類地位，探討了該魚的種群來源。對16尾須鰻蝦虎魚的線粒體COI基因進行測序，獲得了長度為633 bp的COI基因序列，從Genbank中獲得其他17種蝦虎魚的相應(yīng)序列。結(jié)果顯示：須鰻蝦虎魚COI基因部分序列密碼子的第一位點GC含量最高，平均A+T含量高于G+C含量。用MEGA軟件計算蝦虎魚的種間遺傳距離，用鄰接法和最大似然法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹結(jié)果表明，南四湖須鰻蝦虎魚與采自福建興化灣的須鰻蝦虎魚親緣關(guān)系最近，可歸為鰻蝦虎魚屬，但在遺傳變異上已超出種的分化水平。推測南四湖的須鰻蝦虎魚由長江和淮河水系調(diào)水進入的須鰻蝦虎魚個體擴散建群，可能受南水北調(diào)東線工程的調(diào)水遷移的影響。

須鰻蝦虎魚；COI基因；種類鑒定；南四湖

南四湖（34°26′～35°20′N，116°34′～117°21′E）屬淮河流域泗河水系，自北向南由南陽、獨山、昭陽和微山4個相連的湖區(qū)組成，屬河跡洼地淺水型湖泊，水域面積約1 266km2，擔(dān)負(fù)著蓄水、漁業(yè)、防洪、灌溉、排澇、航運等功能[1]。根據(jù)中國淡水魚類分布區(qū)劃[2],南四湖魚類區(qū)劃屬于江河平原區(qū)的河海亞區(qū)，魚類區(qū)系組成以我國特有的江河平原復(fù)合體魚類為主。受黃河泛濫改道、京杭大運河航運以及南水北調(diào)東線工程的影響，黃河、淮河、長江和錢塘江水系相互貫通，使得區(qū)域間的物種遷移更為頻繁。

須鰻蝦虎魚Taenioides cirratus隸屬于蝦虎魚亞目Gobioidei蝦虎魚科Gobiidae，近盲蝦虎魚亞科Amblyopinae鰻蝦虎魚屬Taenioides Lacepède，為暖水性近岸底層小型魚類，棲息于河口半咸淡水水域，也進入江河下游水體，攝食小型魚類、幼蝦、橈足類及其他底棲無脊椎動物等，少數(shù)為經(jīng)濟魚類，大部分為大型魚類餌料，在水生種質(zhì)資源中具有重要地位[3]。我國內(nèi)陸水體太湖、洪澤湖等淡水中有其分布，但渤海區(qū)沒有分布[4-6]。近年，長江中下游地區(qū)一些湖泊如江蘇的高郵湖、淀山湖和安徽巢湖均有須鰻蝦虎魚的報道，種群數(shù)量有增加的趨勢。2011年以來，在山東南四湖的下級湖地籠漁獲物中也時常出現(xiàn)，但南四湖僅記錄吻蝦虎魚屬Rhinogobius leadvolli一種[7]，20世紀(jì)80年代的漁業(yè)資源調(diào)查也未采集到須鰻蝦虎魚。因此，識別進入南四湖并形成種群的蝦虎魚屬種地位和擴散途徑、分布范圍及資源狀況，分析蝦虎魚對湖區(qū)其他水生生物和漁業(yè)資源的影響等基礎(chǔ)性研究急待開展。

蝦虎魚種類繁多，個體較小，生活環(huán)境多樣，物種多樣性較高，一直是傳統(tǒng)形態(tài)分類比較困難的類群，其種類命名及系統(tǒng)分類關(guān)系爭議較大。近年來，物種分類已廣泛采用基因序列輔助，分子數(shù)據(jù)與傳統(tǒng)形態(tài)分類的結(jié)合較好地解決了近緣物種難以界定的問題[8]。線粒體DNA的COI基因（細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ）靠近5′端的一段序列長度適宜，富含系統(tǒng)發(fā)育信號，操作快速簡便，具有較高的物種鑒定可靠性[9,10]，已被廣泛應(yīng)用于魚類鑒定、分類和系統(tǒng)演化等研究。于亞男等[11]擴增了采自長江口的7種蝦虎魚19個個體的線粒體COI基因，證實了COI基因作為蝦虎魚科魚類分類條形碼的有效性。

鑒定南四湖須鰻蝦虎魚是客觀評價南水北調(diào)東線工程生態(tài)影響的現(xiàn)實問題。在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，本研究采用線粒體COI基因?qū)φ瘴r虎魚亞科相近屬，鑒定南四湖須鰻蝦虎魚的分類地位，探討南四湖須鰻蝦虎魚的種群來源。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

實驗用須鰻蝦虎魚采自南四湖。根據(jù)體形、顏色、透明度、頭形（吻形、眼）、尾形、腹鰭是否愈合及有無吸盤等形態(tài)特征，參照《中國動物志》，硬骨魚綱，鱸形目（五），蝦虎魚亞目進行初步分類、標(biāo)號、拍照。

隨機取 16尾，體長 6.9～19.5cm，體質(zhì)量3.2～18.1g，取背部肌肉，于95%酒精中-20℃保存。取樣后的樣品魚采用95%酒精固定或用10%甲醛固定后保存。

1.2 基因組DNA的提取

表1 用于序列比對和系統(tǒng)樹構(gòu)建的魚類COI基因信息Tab.1 Fish COI gene information for sequence alignment and phylogenetic tree construction

將肌肉樣本從酒精中取出，用蒸餾水沖洗干凈，剪碎并徹底晾干，采用上海生工柱式動物基因組DNA抽提試劑盒提取基因組DNA。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并定量。

1.3 引物設(shè)計和PCR擴增

用于擴增須鰻蝦虎魚COI基因片段的通用引物由上海生工生物有限公司合成，分別為：Fish F，5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′；FishR，5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3。PCR 反應(yīng)體系（50μL）為：10×Buffer（含 Mg2+）5μL，dNTP（2.5 mmol/L）4μL，正、反向引物（10 mol/L）各 1μL，Taq DNA 聚合酶（TaKaRa，5U/L）0.25μL，模板 DNA 2μL，補充 ddH2O至 50μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5min；94℃ 變 性 30 s，55℃ 退 火 30s，72℃ 延 伸1min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格產(chǎn)物由上海生工生物有限公司測序。

1.4 基因序列的下載

從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載蝦虎魚科17種魚的COI序列。同屬須鰻蝦虎魚相關(guān)序列僅檢索到一條[12]。選取鱸形目蝦虎魚亞目塘鱧科烏塘鱧Bostrychus sinensis及鱸亞目石首魚科黃姑魚Nibea albiflora兩種魚類的序列作為外類群，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。本文所用的序列信息見表1。

1.5 序列分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后由上海生工生物技術(shù)有限公司測序。用DNASTAR、ClustalX軟件對序列進行排序并輔以手工校正，采用Mega4.1軟件計算序列堿基組成及種間遺傳距離，分別用鄰位連接法（Neighbor-Joining，NJ）和最大似然法（Maximum Likelihood method，ML）構(gòu)建進化樹。NJ法構(gòu)建進化樹Bootstrap置信值重復(fù)抽樣1000次，ML法Bootstrap分析重復(fù)抽樣100次，分析蝦虎魚種間親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

測量南四湖須鰻蝦虎魚78尾，全長6.9～19.5mm，體質(zhì)量0.85～18.6g。鑒別特征：體延長，側(cè)扁，呈鰻形，背緣、腹緣幾乎平直，近尾端漸細(xì)小。頭圓形，略平扁，吻寬而圓鈍，口裂幾乎垂直，具許多外露的大犬齒，下頷具須。眼睛退化隱于皮下，圓凸，眼間隔稍寬。魚體裸露無鱗，體呈紅色帶藍(lán)灰色，腹部淺色。左、右腹鰭愈合成一淺白色圓形吸盤。背鰭1個，鰭棘與鰭條連續(xù)，起點位于體的前半部，鰭棘6根，鰭條30～48根，鰭棘與鰭條均埋于皮膜中，后端具一缺刻，與尾鰭不連，臀鰭和背鰭鰭條相對，同形，基部長，起點在背鰭第一或第二鰭條的下方，埋于皮膜中，后端有一缺刻，不與尾鰭相連。胸鰭短而圓，約為頭長的1/3，尾鰭黑色、尖形。體呈紅色帶藍(lán)灰色，腹部淺色（圖1）。鑒定為鰻蝦虎魚屬須鰻蝦虎魚。

圖1 南四湖須鰻蝦虎魚Fig.1 Taenioides cirratus in Nansi Lake

2.2 線粒體COI基因片段序列分析

PCR擴增得到16個須鰻蝦虎魚擴增條帶，經(jīng)測序比對得到633bp基因片段，具有作為條形碼的長度條件[13]。16條序列僅檢測到1種單倍型，未發(fā)現(xiàn)堿基插入和缺失。A、T、G、C四種堿基平均含量分別為：23.4%、28.7%、20.1%和27.8%，其中A+T平均含量（52.1%）略高于G+C平均含量（47.9%）。

表2 南四湖須鰻蝦虎魚COI基因部分序列中各堿基平均分布頻率（%）Tab.2 Average nucleotide frequencies（%）of COI partial sequences in Taenioides cirratus（Nansi Lake）

如表2所示，在密碼子位點中4種堿基平均含量差別較大，G含量偏低，尤其在第三密碼子位點上。第一密碼子位點G+C含量（57.9%）顯著高于第二（43.1%）和第三密碼子位點（42.6%）。

2.3 遺傳距離

運用Kimura-2-parameter模型計算種間遺傳距離（表3），種間遺傳距離平均為0.212。南四湖須鰻蝦虎魚與須鰻蝦虎魚（KJ944420）遺傳距離最小為0.116，與同屬鱺形鰻蝦虎魚遺傳距離為0.117，須鰻蝦虎魚（KJ944420）與鱺形鰻蝦虎魚（KX254501）遺傳距離為0.015，所研究魚類中同為刺蝦虎魚屬的斑尾刺蝦虎魚（KU944920）與刺蝦虎魚（HQ536247）遺傳距離最小為0.007。

2.4 分子系統(tǒng)進化樹

以COI基因部分序列為標(biāo)記，對所選20種魚的COI基因序列構(gòu)建NJ及ML系統(tǒng)進化樹（圖2、圖3）。兩種方法構(gòu)建的進化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致，具有較高的節(jié)點支持率。須鰻蝦虎魚與鱺形鰻蝦虎魚聚在同一分支內(nèi)，再與南四湖須鰻蝦虎魚聚于一支。

3 討論

3.1 形態(tài)分類學(xué)特征

國外學(xué)者根據(jù)解剖特征、Cyt b分子標(biāo)記等將鰻蝦虎魚類歸為蝦虎魚科的一個亞科[14,15]。國內(nèi)學(xué)者從體形、背鰭、臀鰭、尾鰭的連結(jié)程度及眼睛退化程度等將鰻蝦虎魚類定為科級[16]。伍漢霖等[5]記述了中國產(chǎn)蝦虎魚類的9科5亞科106屬307種（含1新種），對中國蝦虎魚類的分類編撰中，將鰻蝦虎魚類歸為近盲蝦虎魚亞科。主要識別特征為：（1）左右腹鰭愈合為一吸盤；（2）體呈鰻形，無側(cè)線，眼睛高度退化，體呈紅色；（3）背鰭、臀鰭與尾鰭相連。鰻蝦虎魚屬的主要檢索依據(jù)為：下頜縫合部后方無犬齒；胸鰭具鰭條20以下，較小，短于腹鰭；口裂幾乎垂直。鰻蝦虎魚屬中國有2種：鱺形鰻蝦虎魚和須鰻蝦虎魚。二者的主要分類區(qū)別在于：背鰭和臀鰭后端有無缺刻，是否與尾鰭相連，頭長大于或小于腹鰭基部后緣至肛門的距離。南四湖須鰻蝦虎魚背鰭和臀鰭后端各有一缺刻，不與尾鰭相連，頭長明顯小于腹鰭基部后緣至肛門的距離，符合須鰻蝦虎魚的形態(tài)特征。

圖2 NJ法構(gòu)建的蝦虎科魚類分子系統(tǒng)樹Fig.2 NJ tree according to partial sequences of COI gene of Gobiidae

3.2 COI基因序列特點

本研究中，基因片段的堿基組成中G含量最低，這與其他魚類mtDNACOI基因同源序列的堿基特點相一致[17-19]。南四湖須鰻蝦虎魚COI基因序列AT含量（52.1%）明顯高于GC含量（47.9%）。金逍逍等[20]分析了26種蝦虎魚線粒體全基因組，發(fā)現(xiàn)不同區(qū)段中A+T的含量均超過50%，堿基G低含量偏倚；澳大利亞學(xué)者分析了207種魚類的COI基因序列，其中143種硬骨魚類的GC平均含量為47.1%，61種軟骨魚類GC平均含量為42.2%[21]，表明AT含量高可能是魚類mtDNA COI基因堿基組成的普遍現(xiàn)象。本研究中，第一密碼子位點G+C含量（57.9%）顯著高于第二和第三密碼子位點（43.1%，42.6%），核苷酸堿基構(gòu)成的偏倚是線粒體蛋白質(zhì)編碼基因的顯著特征[22]。該結(jié)果與多數(shù)蝦虎魚研究結(jié)果一致，但有研究分析長江口七種蝦虎魚類的基因序列特點，發(fā)現(xiàn)第三位堿基GC含量最高[11]。分析蝦虎魚科魚類的COI基因的堿基特點，可擴大樣本作進一步研究。

圖3 ML法構(gòu)建的蝦虎科魚類分子系統(tǒng)樹Fig.3 ML tree according to partial sequences of COI gene of Gobiidae

表3 個體間遺傳距離Tab.3 Genetic distance in species

3.3 COI基因用于南四湖須鰻蝦虎魚物種鑒定的可行性

COI基因序列鑒別物種有效性的關(guān)鍵是種間遺傳距離大于種內(nèi)遺傳距離，且距離差異約10倍[23,24]。本研究結(jié)果表明，COI基因可用于蝦虎魚的分類鑒定。Hebert等[9]分析了11個動物門13 320個物種，結(jié)果表明物種內(nèi)遺傳距離臨界值為0.020，多數(shù)種內(nèi)遺傳距離小于0.010。南四湖須鰻蝦虎魚與取自福建興化灣的須鰻蝦虎魚之間遺傳距離最小為0.116，說明取自南四湖的須鰻蝦虎魚與取自福建興化灣的須鰻蝦虎魚在遺傳變異上已超出種的分化水平。須鰻蝦虎魚與鱺形鰻蝦虎魚遺傳距離為0.015，推斷二者遺傳變異尚未達到種的分化水平。依據(jù)本實驗結(jié)果，取自福建興化灣的須鰻蝦虎魚可能為鱺形鰻蝦虎魚的不同地理種群，其分類地位有待作進一步確認(rèn)?；贑OI基因部分序列構(gòu)建的NJ與ML進化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本保持一致，推斷須鰻蝦虎魚與鱺形鰻蝦虎魚聚為一支后與南四湖的須鰻蝦虎魚聚為一支，且節(jié)點支持率很高，支持劃為一個屬，即同為鰻蝦虎魚屬。

線粒體COI序列的差異可作為物種分類的有力佐證，但不是唯一標(biāo)準(zhǔn)，物種分類既要考慮形態(tài)特征，還要參考生態(tài)習(xí)性、生殖隔離等因素[25]。于亞男等[11]研究了13種蝦虎魚的COI基因種間和種內(nèi)遺傳距離，證實了COI基因可有效作為蝦虎魚科魚類分類條形碼。趙亮等[26]認(rèn)為，可根據(jù)COI基因序列的差異區(qū)分彈涂魚和大彈涂魚。用COI基因序列標(biāo)記分析的雷州半島紅樹林海區(qū)5種蝦虎魚進化結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類研究一致，證明可用線粒體COI基因分析蝦虎魚類的系統(tǒng)進化[27]。宋超等[28]對比了線粒體16S rRNA和COI基因片段在長江口蝦虎魚科魚類種類鑒定和系統(tǒng)分類研究中的適用性，其中，16S rRNA和COI基因序列均具有較強的種間鑒別能力。蝦虎魚在COI基因中近緣關(guān)系相對較近，不能有效區(qū)分不同屬的蝦虎魚。蝦虎魚種類鑒定可采用mtDNA的其他部分序列，如16S rRNA、D-loop、ND或其他編碼區(qū)基因做進一步的研究分析以彌補COI序列的不足。

3.4 須鰻蝦虎魚在南水北調(diào)湖群間的種群擴散

須鰻蝦虎魚為穴居底層魚類，繁殖力較低，遷移擴散能力較弱。莊平等[4]和伍漢霖等[5]報道在江蘇京杭大運河上的洪澤湖存在須鰻蝦虎魚群體。2011年漁業(yè)調(diào)查在南四湖漁獲物中出現(xiàn)了須鰻蝦虎魚，目前已能在南四湖下級湖區(qū)自然繁殖。推測可能是2002年隨南四湖生態(tài)補水進入，經(jīng)過幾年的種群擴散并建立種群。

歷史上南四湖由南北大運河連接，北接?xùn)|平湖聯(lián)通黃河，南經(jīng)駱馬湖、洪澤湖可達長江，湖沼濕地水體間存在聯(lián)系和交流，是我國東部水系間南北物種交流的重要廊道[29]。近幾十年來，受氣候變化及人為干擾的影響，大運河廊道已處于癱瘓狀態(tài)，各水體間聯(lián)系減少，湖泊物種相對隔離。2002年12月，國家防汛抗旱總指揮部和水利部實施長江向南四湖應(yīng)急生態(tài)補水。2007年，南四湖曾經(jīng)絕跡多年的湖鱭Coilia ectenes、間下Hyporhamphus intermedius和大銀魚Protosalanx hyalocranius重新出現(xiàn)。李秀啟等[30]推測湖鱭為當(dāng)時隨洪澤湖、駱馬湖調(diào)水遷移進入并成功在南四湖擴散建群。利用京杭大運河向南四湖生態(tài)補水，及南水北調(diào)東線工程的調(diào)水，使相聯(lián)水系融會貫通，為生物類群提供了短期快速遷移的機會。

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Application of DNA Barcoding Gene COI for Identifing Taenioides cirratus in Nansi Lake

WANG Ya-nan,LI Xiu-qi,KE Han,CONG Xu-ri,SHI Ji-hua
（Freshwater Fisheries Research Institute of Shandong,Shandong Provincial Key Laboratory of Freshwater Genetic Breeding,Jinan 250013,China）

Mitochondrial COI gene sequence was a popular marker of DNA barcoding for species identification in the kingdom of animals.In this paper,mitochondrial COI genes were sequenced in sixteen specimens of Taenioides cirratus collected from the Nansi Lake and about 633 base pairs were collected.Sequences from homologous regions of seventeen other species of Gobioidei familiy were gathered from Genbank.The results showed that the maximal GC was observed in the first base of condon,with higher average content in A+T than that in G+C.The genetic distance between species and the structure feature of phylogeny tree indicated that Taenioides cirratus from Nansi Lake and Xinghua Bay are in the closest relationship.The appearance of Taenioides cirratus in the Nansi Lake may be affected by the east route of South-to-North water transfer project.

Taenioides cirratus;COI gene;species identification;Nansi Lake

S917

A

1005-3832（2017）06-0012-07

2017-07-04

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項經(jīng)費（201303050）；山東省2016年度農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新課題.

王亞楠，女.E-mail:wangyanan830513@163.com

李秀啟（1968～），男，副研究員，從事魚類生態(tài)學(xué)研究.E-mail:xiuqili@126.com