李迎秋，張國(guó)民，朱義剛，劉 洋，肖海林，黎嘯風(fēng)，夏 珊，周 晉，趙愛(ài)明,何清湖

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

血府逐瘀湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化家兔主動(dòng)脈組織單核細(xì)胞趨化因子-1表達(dá)的影響

李迎秋，張國(guó)民*，朱義剛，劉 洋，肖海林，黎嘯風(fēng)，夏 珊，周 晉，趙愛(ài)明,何清湖*

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

目的觀察血府逐瘀湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化家兔主動(dòng)脈組織單核細(xì)胞趨化因子-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)表達(dá)的影響，并探討血府逐瘀湯抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制。方法將24只清潔級(jí)日本雄性大耳家兔，隨機(jī)分為3組，每組8只：空白組給予普通飼料；模型組先給予高膽固醇高脂飼料100 g/d后給予普通飼料；血府逐瘀湯組在模型組喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上，灌胃給予血府逐瘀湯，每天1次。喂養(yǎng)8周后，采血測(cè)定家兔血脂全套(TG、TC、LDL)；應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察兔主動(dòng)脈切片的病理改變，測(cè)定其主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊灰度及斑塊面積；利用免疫組織化學(xué)方法測(cè)定主動(dòng)脈MCP-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果主動(dòng)脈圖像分析血府逐瘀湯組家兔胸主動(dòng)脈斑塊灰度及斑塊面積分別低于模型組(P＜0.01)；與空白組及血府逐瘀湯組相比，模型組家兔血清TC，TG，LDL均明顯升高(P＜0.05)。血府逐瘀湯組家兔血清TC，LDL的水平卻明顯高于空白組(P＜0.01)。模型組家兔動(dòng)脈粥樣硬化家兔主動(dòng)脈MCP-1蛋白表達(dá)平均灰度值明顯高于血府逐瘀湯組和空白組(P＜0.01)。結(jié)論血府逐瘀湯可以降低動(dòng)脈粥樣硬化家兔主動(dòng)脈的MCP-1蛋白表達(dá)水平；血府逐瘀湯抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制可能與其降低MCP-1蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

血府逐瘀湯；單核細(xì)胞趨化因子-l；動(dòng)脈粥樣硬化；兔

隨著經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)人們生活方式的改變，我國(guó)動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）發(fā)病率逐年增高，是人類(lèi)心腦血管疾病的首位病因[1]。大量研究表明[2-4]：血府逐瘀湯具有抗AS的功效，但具體機(jī)制尚不完全清楚。在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，單核細(xì)胞趨化因子-l(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)起重要作用[5]。血府逐瘀湯是否通過(guò)影響MCP-1的表達(dá)從而發(fā)揮抗AS的功效，尚未見(jiàn)相關(guān)的報(bào)道。本研究通過(guò)觀察血府逐瘀湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化家兔主動(dòng)脈組織MCP-1表達(dá)的影響，探討血府逐瘀湯抗動(dòng)脈粥樣硬化的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

24只清潔級(jí)雄性日本大耳家兔，體質(zhì)量(2.0±0.1)kg，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心采購(gòu)，長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào) （SCXK(湘)2009-0012）。實(shí)驗(yàn)環(huán)境設(shè)施合格證號(hào) （SYXK(湘)2009-0001），分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物及試劑

根據(jù)文獻(xiàn)[2]制備實(shí)驗(yàn)用血府逐瘀湯，并去渣，濃縮至藥液生藥含量1 000 g/L滅菌后4℃冷藏保存?zhèn)溆?。膽固醇?gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司(批號(hào) 14023)。

1.3 主要儀器

日立全自動(dòng)生化分析儀（日立，7170S型），Optimas彩色數(shù)字圖象分析儀（英國(guó)）。

1.4 動(dòng)物分組

將24只清潔級(jí)日本雄性大耳家兔（SCXK(湘)2009-0012），隨機(jī)分為3組，每組8只：空白組給予普通飼料；模型組每日每只動(dòng)物喂飼高膽固醇高脂飼料100 g，待其全部吃完后再喂飼普通飼料；血府逐瘀湯組予以高膽固醇高脂飲食造模同時(shí)，根據(jù)體質(zhì)量灌胃給血府逐瘀湯(含生藥7.10 g/kg·d），每天1次。所有家兔均每周測(cè)定體質(zhì)量1次，并根據(jù)體質(zhì)量的變化調(diào)整灌胃給血府逐瘀湯的劑量（血府逐瘀湯組）或蒸餾水（空白組和模型組），灌胃時(shí)間共8周。

1.5 血標(biāo)本及組織標(biāo)本的采取與處理

各組家兔喂養(yǎng)8周后，禁飲禁食12 h，利用注射器從右心房緩慢抽血10 mL，置于生化管中立即送湖南中醫(yī)藥大學(xué)檢驗(yàn)科檢測(cè)總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）。 隨后處死家兔，距主動(dòng)脈峽部0.5 cm處開(kāi)始向遠(yuǎn)心端取1 cm長(zhǎng)的胸主動(dòng)脈，置入10%福爾馬林液中備用。

1.5.1 TC，TG，LDL測(cè)定 所有血標(biāo)本均采用盲法在湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬一醫(yī)院檢驗(yàn)科全自動(dòng)生化儀（日立，7170S 型）上測(cè)定 TC，TG，LDL。

1.5.2 家兔主動(dòng)脈斑塊面積及斑塊灰度的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)提供的方法[2]，主動(dòng)脈標(biāo)本，依次經(jīng)過(guò)脫水，透明，石蠟包埋，冷凍，常規(guī)切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，制成組織切片。采用光學(xué)顯微鏡察其病理改變，隨后每個(gè)切片隨機(jī)取3個(gè)視野，利用Optimas顯微圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)家兔主動(dòng)脈斑塊灰度以及斑塊面積。

1.5.3 主動(dòng)脈MCP-1蛋白表達(dá)的測(cè)定 上述主動(dòng)脈組織切片完成后，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)和免疫組織化學(xué)方法操作。細(xì)胞膜、胞漿呈棕黃色顆粒黃染，提示MCP-1陽(yáng)性，無(wú)黃染者提示為MCP-1陰性。每個(gè)主動(dòng)脈標(biāo)本隨機(jī)選取4張切片，每張切片再隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野檢測(cè)MCP-1蛋白表達(dá)的灰度值，取平均灰度值進(jìn)行比較，平均灰度值越高，說(shuō)明MCP-1陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng)，反之則MCP-1陽(yáng)性表達(dá)越弱。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組家兔主動(dòng)脈粥樣硬化的病理形態(tài)學(xué)改變

肉眼觀察：空白組家兔主動(dòng)脈內(nèi)膜正常，無(wú)明顯病理改變；模型組家兔主動(dòng)脈內(nèi)膜散在分布大量的向內(nèi)隆起的淡黃色斑塊，形狀不規(guī)則，甚至沿管腔呈環(huán)狀分布；血府逐瘀湯組家兔主動(dòng)脈內(nèi)膜有少量淡黃色斑塊形成，隆起不明顯，淡黃色斑塊呈間斷分布，很少連成片。光鏡檢查：空白組主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑平整，內(nèi)皮膜下未見(jiàn)脂質(zhì)沉積；模型組主動(dòng)脈內(nèi)有大量斑塊形成，斑塊內(nèi)有大量的泡沫細(xì)胞和增生的平滑肌細(xì)胞聚集；血府逐瘀湯組主動(dòng)脈可見(jiàn)少許斑塊內(nèi)，斑塊內(nèi)間散在的泡沫細(xì)胞，但無(wú)增生的平滑肌細(xì)胞 (見(jiàn)圖1)。主動(dòng)脈圖像分析血府逐瘀湯組家兔胸主動(dòng)脈斑塊灰度（157.29±8.95）及斑塊面積[（2.13±0.57） mm2]分別低于模型組[（187.56±6.71）mm2和（4.93±0.58）mm2，P＜0.01]。 見(jiàn)表 1。

圖1 各組家兔主動(dòng)脈粥樣硬化的病理形態(tài)學(xué)改變(HE，×400)

表1 血府逐瘀湯對(duì)家兔主動(dòng)脈斑塊灰度及斑塊面積的影響（±s）

表1 血府逐瘀湯對(duì)家兔主動(dòng)脈斑塊灰度及斑塊面積的影響（±s）

注:與模型組比較,*P＜0.01。

分組空白組模型組血府逐瘀湯組n 8 8 8斑塊灰度-187.56±6.71 157.29±8.95*斑塊面積/mm2-4.93±0.58 2.13±0.57*MCP-1 112.46±6.16 165.38±8.15 131.67±9.13

2.2 血府逐瘀湯對(duì)家兔血清TC，TG，LDL的影響

與空白組及血府逐瘀湯組相比，模型組家兔血清 TC，TG，LDL均明顯升高 (P＜0.05)。 與空白組相比，血府逐瘀湯組家兔血清TG無(wú)顯著性差異，但是血府逐瘀湯組家兔血清TC，LDL的水平卻明顯高于空白組(P＜0.01)。 見(jiàn)表 2。

表2 血府逐瘀湯對(duì)家兔血清TC，TG，LDL的影響（±s，n=8，mmol·L-1）

表2 血府逐瘀湯對(duì)家兔血清TC，TG，LDL的影響（±s，n=8，mmol·L-1）

注:與空白組比較，＃P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較,*P＜0.01。

分組空白組模型組血府逐瘀湯組TC 1.73±0.41 27.36±6.95##16.43±5.73##*TG 1.09±0.31 2.39±0.61##1.41±0.27*LDL 1.12±0.27 19.37±9.54##8.98±2.67＃*

2.3 血府逐瘀湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化家兔主動(dòng)脈MCP-1蛋白表達(dá)的影響

MCP-1蛋白表達(dá)陽(yáng)性表現(xiàn)呈棕黃色顆粒，位于胞膜及胞漿內(nèi)。各實(shí)驗(yàn)組MCP-1的陽(yáng)性表達(dá)主要見(jiàn)于新生內(nèi)膜，中膜也有表達(dá)(見(jiàn)圖2)。用病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)定空白組平均灰度值為（112.46±6.16），模型組平均灰度值為（165.38±8.15），血府逐瘀湯組平均灰度值為（131.67±9.13）?？瞻捉M及血府逐瘀湯組平均灰度值明顯低于模型組(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

圖2 各組家兔主動(dòng)脈動(dòng)脈MCP-1蛋白表達(dá)情況(免疫組化，×400)

3 討論

已經(jīng)證實(shí)，MCP-1在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和破裂中起著重要的作用[6]。表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的MCP-1與表達(dá)于單核細(xì)胞表面的主要受體是趨化因子受體 2（chemokine receptor， CCR-2）結(jié)合后，通過(guò)細(xì)胞膜上G蛋白藕聯(lián)的磷酸肌醇等信號(hào)通路特異性趨化激活單核細(xì)胞，并趨化其遷移入血管內(nèi)皮下，在巨噬細(xì)胞集落刺激因子的作用下分化為巨噬細(xì)胞，大量攝取氧化型極低密度脂蛋白，膽固醇在巨噬細(xì)胞內(nèi)聚集，最終使巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞[7]。同時(shí)，MCP-1/CCR-2可以上調(diào)粥樣斑塊里的內(nèi)皮細(xì)胞Bax及下調(diào)Bcl-2表達(dá)，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致血管張力、脂質(zhì)代謝及凝血機(jī)制的改變，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化板斑塊的形成[8-9]。還有研究證實(shí)，MCP-1可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase，MMP-9），降解細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣斑塊不穩(wěn)定甚至破裂[10]。臨床上也有大量的研究證實(shí)，動(dòng)脈粥樣斑塊塊內(nèi)MCP-1的水平明顯高于空白組組織，不穩(wěn)定斑塊內(nèi)MCP-1的表達(dá)水平較穩(wěn)定斑塊增多，急性冠脈綜合癥患者血清的MCP-1水平高于穩(wěn)定型心絞痛患者和健康人群[11]。而且，MCP-1水平對(duì)ACS患者的近期預(yù)后和遠(yuǎn)期預(yù)后均有獨(dú)立的預(yù)測(cè)價(jià)值[12]?？傊琈CP-1與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，MCP-1可能成為治療動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)新靶點(diǎn)[13]。

在本研究中，與模型組相比，血府逐瘀湯組家兔主動(dòng)脈粥樣硬化病變程度較明顯減輕。而且，血府逐瘀湯組家兔主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊灰度和斑塊面積這兩個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化病變程度的客觀指標(biāo)也明顯低于模型組，說(shuō)明血府逐瘀湯具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，這與包括本課題組前期研究在內(nèi)的國(guó)內(nèi)外大量研究結(jié)果一致[2-3]。但是，目前尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)血府逐瘀湯通過(guò)影響MCP-1發(fā)揮其抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的研究報(bào)道。本文結(jié)果顯示，與模型組相比，血府逐瘀湯組家兔主動(dòng)脈MCP-1蛋白表達(dá)水平明顯降低，說(shuō)明血府逐瘀湯可能通過(guò)降低動(dòng)脈粥樣硬化家兔MCP-1蛋白表達(dá)水平，從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

血府逐瘀湯降低動(dòng)脈粥樣硬化家兔主動(dòng)脈的MCP-1蛋白表達(dá)的確切機(jī)制，目前未見(jiàn)相關(guān)的研究。有研究證實(shí)，高脂血癥損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，激活血管壁的炎性反應(yīng)，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1的表達(dá)[14]。而在本研究中血府逐瘀湯組家兔血清TC，LDL明顯低于模型組，故可以推測(cè)血府逐瘀湯可能是通過(guò)降低血清TC，LDL水平，減輕高脂血癥對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，從而降低主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1的表達(dá)，確切的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1]李 靚，謝 巍.我國(guó)動(dòng)脈粥樣硬化基礎(chǔ)研究近三年進(jìn)展[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2015，23(11):1182-1188.

[2]李迎秋，趙愛(ài)明，曾 輝，等.血府逐瘀湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化家兔血清非對(duì)稱(chēng)性二甲基精氨酸水平的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2009，34(12):1530-1534.

[3]陳 慧，張文將，唐 標(biāo)，等.血府逐瘀湯對(duì)動(dòng)脈血栓模型大鼠抗凝系統(tǒng)的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，36(3):29-32.

[4]耿兆輝，壽寶棟，劉 輝.血府逐瘀湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血脂及血管活性物質(zhì)的影響[J].河北大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2011，31(3):304-308.

[5]Ross R.Atherosclerosis-an inflammatory disease[J].N Engl J Med，1999，340(2):115-126.

[6]Geronimo FR， Barter PJ， Rye KA， et al.Plaque stabilizing effects of apolipoprotein A-IV[J].Atherosclerosis， 2016，251:39-46.

[7]Namiki M， Kawashima S， Yamashita T， et al.Local over-expression of monocyte chemoattractant protein-1 at vessel wall induces infiltration of macrophages and formation of atherosclerotic lesion:synergism with hypercholesterolemia[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2002，22(1):115-120.

[8]Lin J， Kakkar V， Lu X.Impact of MCP-1 in atherosclerosis[J].Curr Pharm Des， 2014，20(28):4580-4588.

[9]Zhang X， Liu X， Shang H， et al.Monocyte chemoattractant protein-1induces endothelial cell apoptosis in vitro through a p53-dependent mitochondrialpathway[J].Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)， 2011， 43(10):787-795.

[10]Tan C，Liu Y，Li W，et al.Associations of matrix metalloproteinase-9 and monocyte chemoattractant protein-1 concentrations with carotid atherosclerosis，based on measurements of plaque and intima-me dia thickness[J].Athero-sclerosis， 2014，232(1):199-203.

[11]AmasyaliB， Kose S， Kursaklioglu H， etal.Monocyte chemoattractant protein-1 in acute coronary syndromes:complex vicious inter action[J].Int J Cardiol， 2009，136(3):356-357.

[12]De Lemos JA，Morrow DA，Blazing MA，et al.Serial measurement of monocyte chemoattractant protein-1 after acute coronary syndromes:results from the A to Z trial[J].J Am Coll Cardiol， 2007，50(22):2117-2124.

[13]Ley K， Miller YI， Hedrick CC.Monocyte and macrophage dynam icsduring atherogenesis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2011，31(7):1506-1516.

[14]Wiesner P，Tafelmeier M，Chittka D，et al.MCP-1 binds to oxidized LDL and is carried by lipoprotein(a)in human plasma[J].J Lipid Res， 2013，54(7):1877-1883.

Effects of Xuefu Zhuyu Decoction on the Expression of Monocyte Chemoattractant Protein-1 in Aortic Tissue of Atherosclerosis Rabbits

LI Yingqiu,ZHANG Guomin*,ZHU Yigang,LIU Yang,XIAO Hailin,LI Xiaofeng,XIAN Shan,ZHOU Jin,ZHAO Aiming,HE Qinghu*
(Hunan University of Chinese Medine,Changsha,Hunan 410007,China)

ObjectiveTo observe the effect of Xuefu Zhuyu decoction on the expression of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)in aortic tissue of atherosclerosis rabbits.MethodsTwenty-four male rabbits were randomly divided into three groups,8 rats in each group.The control group was fed with normal diet,the model group was given with 100g/d high fatand cholesteroldietbeforefeedingnormaldiet;and Xuefu Zhuyu decoction group wasadministrated with Xuefu Zhuyu decoction,once daily.The concentrations of serum total cholesterol (TC)，total triglyceride(TG),low density lipoprotein(LDL)were measured after eight weeks for feed.The pathology changes of the pathological section,degree and atherosclerotic plaque mean gray value and plaque area were observed by optical microscope.The expression of MCP-1 in atherosclerosis rabbits was detected by immunochemistry.ResultsThe aortic atherosclerotic plaque mean gray value and plaque area of Xuefu Zhuyu decoction group were low er than those of the model group (P＜0.01).Compared with the blank group and Xuefu Zhuyu decoction group,the serum TC,TG and LDL of the model group increased obviously (P＜0.05).The level of TC and LDL in Xuefu Zhuyu decoction was significantly higher thabn those in blank group (P＜0.01).The average gray value of the expression of MCP-1 in the model group was significantly higher than those in the Xuefu Zhuyu decoction group and blank group (P＜0.01).ConclusionXuefu Zhuyu decoction could decrease the expression of MCP-1 in aortic tissue of atherosclerosis rabbits.Its mechanism may be related with the lower MCP-1.

Xuefu Zhuyu decoction;monocyte chemoattractant protein-1;atherosclerosis;rabbits

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.12.004

本文引用：李迎秋，張國(guó)民，朱義剛，劉 洋，肖海林，黎嘯風(fēng)，夏 珊，周 晉，趙愛(ài)明,何清湖.血府逐瘀湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化家兔主動(dòng)脈組織單核細(xì)胞趨化因子-1 表達(dá)的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（12）：1312-1315.

2017-01-10

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81373641);2012年度湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（2012181）；2013年度湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目（2013161）；2014年湖南省科學(xué)技術(shù)廳課題（2014SK3050）。

李迎秋，女，講師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合男科和老年病研究。

*何清湖，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail:hqh1111@tom.com；張國(guó)民，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail:834095773@qq.com。

（本文編輯 李 杰）