馬妍妍

（國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作四川中心，四川 成都 610000）

納米孔DNA測序?qū)＠夹g(shù)綜述

馬妍妍

（國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作四川中心，四川 成都 610000）

基于CNABS和DWPI數(shù)據(jù)庫，通過檢索、統(tǒng)計和分析國內(nèi)外有關(guān)納米孔DNA測序的專利申請，對該領(lǐng)域申請量趨勢進(jìn)行統(tǒng)計，梳理了納米孔DNA測序領(lǐng)域的技術(shù)發(fā)展歷程，同時，對納米孔DNA測序領(lǐng)域的核心專利和重要申請人進(jìn)行分析，以期為國內(nèi)相關(guān)企業(yè)的發(fā)展提供參考。

納米孔；測序；核心專利；技術(shù)發(fā)展

引言

基因測序技術(shù)是對DNA進(jìn)行分析、檢測的技術(shù)，在產(chǎn)前篩查和診斷，以及多種疾病的診斷、預(yù)測、預(yù)防干預(yù)等方面具有重要意義。從測序技術(shù)的發(fā)展演變來看，基因測序技術(shù)主要經(jīng)歷了4代：基于1975年Sanger和Coulson發(fā)明的脫氧終止法的測序原理的第一代基因測序技術(shù)，到以新型的固態(tài)納米孔單分子測序?yàn)樘攸c(diǎn)的第四代基因測序，目前,第四代基因測序技術(shù)正處在研究熱潮。納米孔DNA測序技術(shù)借助電泳驅(qū)動單個分子逐個穿過納米孔來進(jìn)行測序。與傳統(tǒng)的基因測序技術(shù)相比，納米孔DNA測序技術(shù)具有低成本、高讀長、小型化、易集成等優(yōu)勢，近年來發(fā)展非常迅速。為了解掌握納米孔DNA測序技術(shù)的發(fā)展及產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀，從全球納米孔DNA測序技術(shù)的專利入手，研究分析納米孔DNA測序技術(shù)的專利申請趨勢、重要申請人、專利技術(shù)發(fā)展歷程等相關(guān)信息，以期為國內(nèi)相關(guān)企業(yè)提供參考。

1 納米孔DNA測序技術(shù)分支

基于CNABS、DWPI數(shù)據(jù)庫，通過分類號和關(guān)鍵詞檢索，人工去噪得到供分析的納米孔DNA測序技術(shù)專利數(shù)據(jù)樣本536篇文獻(xiàn)。通過瀏覽專利和相關(guān)非專利文獻(xiàn)，對納米孔DNA測序所涉及的技術(shù)分支進(jìn)行分解（詳見表1）。

2 全球申請量趨勢分析

對檢索到的納米孔DNA測序?qū)＠暾埌瓷暾埬攴莘謩e統(tǒng)計申請量。

數(shù)據(jù)顯示（見圖1），1996年，哈佛大學(xué)的Daniel Bran?ton、加州大學(xué)的David Deamer及其同事，在PNAS雜志上首次發(fā)表文章指出，可以用膜通道檢測多核苷酸序列，讓DNA堿基一個個穿過納米孔，同時快速鑒定每個堿基。1998年加州大學(xué)和哈佛大學(xué)作為申請人，首次申請了納米孔DNA測序相關(guān)專利。然而，為致力于解決遇到的大量生產(chǎn)同樣尺寸的納米孔、DNA鏈穿過納米孔時的速度等問題，納米孔測序技術(shù)在1998年-2001年間進(jìn)入了萌芽期。

2001年，哈佛大學(xué)的Daniel Branton和Golovchenko等首次報道了使用固態(tài)納米孔來檢測DNA，在SiN薄膜中使用具有反饋控制的離子束雕刻工具制備確定尺寸的納米孔。從2002年開始，國內(nèi)外各公司、研究機(jī)構(gòu)開始對納米孔測序技術(shù)產(chǎn)生關(guān)注，相關(guān)專利申請進(jìn)入了發(fā)展期，2007年-2014年間，納米孔測序技術(shù)的專利申請迅猛增長。

2014年之后的專利申請量急劇下降，其原因可能有兩個，其一是由于基因測序相關(guān)企業(yè)入行門檻低、市場比較混亂，存在巨大風(fēng)險，2014年國家食藥監(jiān)管總局、國家衛(wèi)計委聯(lián)合發(fā)出通知叫停了產(chǎn)前基因檢測在內(nèi)的基因測序，可能對申請量造成了一定的影響。其二是由于部分專利申請還未公開。

圖1 全球申請量趨勢

3 全球重要申請人分析

對各申請人的申請量進(jìn)行分析，將不同公司名稱（中英文）進(jìn)行人工整合后，以申請量為準(zhǔn)對申請人進(jìn)行排名，結(jié)果顯示如圖2。

全球納米孔DNA測序技術(shù)專利申請量排名前20的重要申請人中，國際商業(yè)機(jī)器公司（IBM）作為電子計算機(jī)行業(yè)的領(lǐng)頭羊申請量位居第一，2007年開始涉足納米孔DNA測序領(lǐng)域。而作為納米孔DNA測序技術(shù)的始創(chuàng)者，哈佛大學(xué)和加利福尼亞大學(xué)申請量位居第二和第五名。此外，前20名申請人中，深圳華大基因科技有限公司是國內(nèi)領(lǐng)先的基因測序企業(yè)，自1990年“人類基因組計劃”啟動至2003年，華大基因參與并完成了1%的人類基因組計劃，之后的10多年間，華大基因在利用基因檢測進(jìn)行產(chǎn)前檢測方面投入了很大的精力，其在納米孔DNA測序方面的專利申請也持續(xù)增長，在全球申請量排名第九。伊魯米那（Illumina）公司作為測序領(lǐng)域的巨頭，在基因測序產(chǎn)業(yè)鏈上利潤最大的上游設(shè)備端和耗材領(lǐng)域占有最重的市場份額，許多國內(nèi)基因測序企業(yè)從Illumina公司購買基因測序設(shè)備。牛津納米孔為英國的一家基因測序公司，早在2012年，牛津納米孔公司就發(fā)布了一款U盤大小的DNA測序器，將其命名為MinION，它可以直接通過USB連接到筆記本上，使用的技術(shù)便是納米孔DNA測序技術(shù)，一個MinION有500個納米孔，可并行測序，每個孔每秒30bp，該測序器在2016年8月被NASA宇航員帶上了太空，開啟了太空基因組測序的新篇章。

在申請量排名前20的申請人中，國外申請人占13個，超過半數(shù)，國內(nèi)申請人相對較少，這反映了與國外納米孔DNA測序技術(shù)相比，國內(nèi)還存在一定的差距。而排名前20的國內(nèi)申請人中，申請量位居第一的為上海交通大學(xué)，其專利申請主要涉及通過電磁或光學(xué)鑷手段捕獲DNA一端的磁珠來減慢DNA穿過納米孔的速度、借助外切酶進(jìn)行測序以及制備固態(tài)納米孔方面的研究。東南大學(xué)、浙江大學(xué)、北京大學(xué)、清華大學(xué)在納米孔DNA測序領(lǐng)域研究也位居國內(nèi)申請人排名前七，近年來，北京大學(xué)與哈佛大學(xué)在DNA在固態(tài)納米孔中的減速方法方面有多項(xiàng)合作，這種國內(nèi)外高校的合作模式也推進(jìn)了我國納米孔DNA測序技術(shù)的發(fā)展。

表1 納米孔DNA測序技術(shù)分支

圖2 全球申請人申請量排名

4 重要申請人專利技術(shù)發(fā)展及核心專利

哈佛大學(xué)和加利福尼亞大學(xué)（即加州大學(xué)）是最早提出納米孔DNA測序這一技術(shù)的申請者，為納米孔DNA測序領(lǐng)域的始創(chuàng)者，且二者申請量分別位居第二和第五，他們的后續(xù)研究也是圍繞納米孔測序在開展，其研究技術(shù)發(fā)展歷程在一定程度上反映了納米孔DNA測序領(lǐng)域的發(fā)展方向。

4.1 測序的檢測方式

測序的檢測手段經(jīng)歷了從檢測離子流阻斷、到通過光學(xué)讀取、通過橫向電子隧穿、再到通過電容檢測的發(fā)展。由哈佛大學(xué)和加利福尼亞大學(xué)合作最早提交的專利（US6746594B2，1998年）是根據(jù)離子流阻斷原理進(jìn)行DNA的納米孔直接測序。隨后的一系列專利都是關(guān)于離子流檢測的納米孔直接測序的研究。2003年加利福尼亞大學(xué)申請的專利（US7444053B2）和2004年哈佛大學(xué)申請的專利（CN101103357B）中，均使用光學(xué)手段讀取的檢測方式對DNA進(jìn)行納米孔測序，通過讀取熒光信號推測DNA的序列。橫向電子隧穿的檢測方式在哈佛大學(xué)于2005年相繼提交的專利（CN102183630A和CN101203740A）中被使用，這兩篇專利文獻(xiàn)中均使用碳納米管在納米孔處產(chǎn)生橫向偏電壓，使得DNA在穿過納米孔時速度減慢。在之后的研究中，加利福尼亞大學(xué)2013年申請了專利（US2015337367A1），其中，將納米孔測序儀在半導(dǎo)體基板上制作，使得微縮的多納米孔檢測設(shè)備成為可能，另外測序儀中還集成設(shè)置了復(fù)合膜片鉗電容放大器-差分放大器網(wǎng)絡(luò)，提高了檢測信噪比，通過電容檢測的方式進(jìn)行DNA測序。

4.2 測序所使用的納米孔的發(fā)展

主要經(jīng)歷了從生物蛋白質(zhì)納米孔到固態(tài)納米孔的轉(zhuǎn)變。對于生物蛋白質(zhì)納米孔而言，以α-溶血素（英文簡稱α-HL）為例，α-HL蛋白是金黃色葡萄球菌分泌的分子量為232.4kDa的蛋白質(zhì)，以七聚體方式插入脂質(zhì)雙分子層中形成跨膜通道蛋白[4]，由2個主要部分組成：約2.5nm內(nèi)徑的帽子和約1.5nm內(nèi)徑的通道，后者穿過細(xì)胞膜，帽子寬約10nm，整個α-HL納米孔從帽子到通道長約10nm，當(dāng)KCl濃度為1mol/L時，α-HL納米孔通道大約可容納11個K+和11個Cl-[5]。哈佛大學(xué)和加利福尼亞大學(xué)早期的研究多集中在使用生物蛋白質(zhì)納米孔來檢測核酸。而最早使用的α-HL納米孔的通道有約5nm長，可同時容納約7個核苷酸，這就造成檢測的干擾，這種納米孔不能分辨通道中的7個核苷酸，其空間和時間分辨率較低。在這之后哈佛大學(xué)和加利福尼亞大學(xué)的申請也多集中于生物蛋白質(zhì)納米孔的測序技術(shù)，并相繼提交了使用MspA孔蛋白（WO2016053891A1）、噬菌體Phi29連接器（CN103392008A）等生物納米孔進(jìn)行測序的專利。

生物納米孔在測序方面進(jìn)展較早，但由于其自身在穩(wěn)定性、持久性等方面存在不足，難以滿足持續(xù)的大規(guī)模測序工作的需求。隨著微加工技術(shù)的不斷進(jìn)步，固態(tài)納米孔技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。固態(tài)納米孔測序原理與生物納米孔一樣，其是人造納米孔，但與生物納米孔相比，具有更優(yōu)良的性質(zhì)：一是尺寸可控；二是更好的機(jī)械強(qiáng)度、穩(wěn)定性；三是可重復(fù)使用，成本降低；四是可適應(yīng)復(fù)雜的檢測環(huán)境；五是易于與其他微型探測器和探針或分析電路集成具備單分子檢測能力的靈敏生物傳感器，其克服了生物納米孔的一系列缺點(diǎn)。1999年加利福尼亞大學(xué)提交的專利（US6617113B2）中在云母層上利用HF酸進(jìn)行濕法腐蝕得到固態(tài)納米孔，且使用這種固態(tài)納米孔區(qū)分單鏈、雙鏈核酸分子。2001年，Li等發(fā)表了關(guān)于聚焦離子束制備直徑為1.8nm納米孔的研究，之后，哈佛大學(xué)在2003年提交的專利（WO2005061373A1）中使用離子束刻蝕的方法制備納米孔用于納米孔DNA測序。2005年之后哈佛大學(xué)的納米孔DNA測序技術(shù)的專利申請多集中在使用固態(tài)納米孔進(jìn)行測序，2013年哈佛大學(xué)提交的專利申請（CN105408241A）中使用電子束刻蝕制備的固態(tài)納米孔進(jìn)行DNA測序研究。

4.3 納米孔DNA測序的技術(shù)難點(diǎn)

主要集中：在一是如何提高單堿基檢測靈敏度；二是如何減慢DNA穿孔速率這兩大方面。這兩方面又相輔相成，減慢DNA穿孔的速率則在檢測時間上有了保障，進(jìn)而便可提高單堿基的檢測靈敏度。哈佛大學(xué)2004年提交的專利申請（CN101103357B）借助雜交探針與靶核酸之間的相互作用來減緩納米孔穿線速度，其于2005年提交的兩項(xiàng)專利（CN102183630A和CN101203740A）均使用碳納米管與DNA分子的耦合作用減慢DNA穿過納米孔的速度。而后哈佛大學(xué)還圍繞增加檢測靈敏度進(jìn)行了研究，分別在2008年和2009年提交了兩項(xiàng)專利（WO2009/035647Al和CN102630304A），使用石墨烯納米孔進(jìn)行檢測，由于石墨烯膜很薄，其厚度小于DNA兩個堿基之間的間距，因此可提高單堿基檢測的靈敏度。此外，加利福尼亞大學(xué)于2011年申請的專利（CN104774757A）中使用兩個納米孔，并在兩個納米孔上施加不同的電壓，產(chǎn)生相反方向的作用力來減慢DNA穿過納米孔的速率，以期提高檢測準(zhǔn)確率。2012年申請的專利（CN102590314B和CN102621214B）中，哈佛大學(xué)又提出了新的手段，這兩篇專利文獻(xiàn)是與北京大學(xué)合作完成的，其中通過引入壓強(qiáng)外場作為電場的反向外場來減慢DNA穿孔的速率。

5 結(jié)語

基因測序領(lǐng)域自基于Sanger的脫氧終止法的第一代基因測序至今已經(jīng)歷了將近40年的發(fā)展歷程。而從專利發(fā)展的演進(jìn)來看，納米孔DNA測序技術(shù)始于1998哈佛大學(xué)和加利福尼亞大學(xué)共同提出的生物納米孔的離子流阻斷檢測，至今也經(jīng)歷了10余年的發(fā)展。縱觀納米孔DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷程，該技術(shù)領(lǐng)域主要圍繞納米孔的制備方法、納米孔尺寸的縮小、減緩DNA穿孔速度、提高檢測靈敏度這4方面進(jìn)行研究。通過技術(shù)綜述的梳理，便于了解上述4方面的重點(diǎn)專利技術(shù)，該領(lǐng)域的重點(diǎn)申請人，對國內(nèi)企業(yè)有一定的參考意義。

[1]王躍.基于納米孔和納米陣列的單分子DNA測序技術(shù)基礎(chǔ)研究，中國優(yōu)秀碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)科學(xué)輯[C].2015，(06)：A006-7.

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Review of Patents in Nanopore DNA Sequencing

Ma Yanyan
（Patent Examination Cooperation Sichuan Center of the Patent Office,SIPO,Chengdu Sichuan 610000）

Based on the databases of CNABS and DWPI,the domestic and foreign patents of nanopore DNA se?quencing are analyzed by examination and statistics method,including the growth trend of application amount and the technique progress in the field of nanopore DNA sequencing.Furthermore,the core patents and important ap?plicants of nanopore DNA sequencing are analyzed.This paper aims to provide references for the development of re?lated domestic enterprises.

nanopore;sequencing;core patents;technique progress

Q812

A

1003-5168(2017)11-0051-04

2017-9-20

馬妍妍（1988-），女，碩士，實(shí)習(xí)研究員，研究方向：發(fā)明專利實(shí)質(zhì)審查工作。