陳鵬程，鄭璞

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

琥珀酸放線桿菌的固定化及利用纖維床反應(yīng)器生產(chǎn)丁二酸的研究

陳鵬程，鄭璞*

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

以甘蔗渣殘?jiān)?、聚丙烯微米纖維膜和棉纖維分別作為載體固定琥珀酸放線桿菌進(jìn)行丁二酸的發(fā)酵生產(chǎn)，通過優(yōu)化載體使用量獲得較高的丁二酸產(chǎn)量并進(jìn)行反復(fù)分批發(fā)酵，以研究載體重復(fù)使用性能。研究發(fā)現(xiàn)，聚丙烯微米纖維膜產(chǎn)丁二酸相對(duì)最優(yōu)，且相對(duì)使用量最少，而棉纖維材料重復(fù)使用穩(wěn)定性最優(yōu)。以棉纖維材料構(gòu)建轉(zhuǎn)動(dòng)式纖維床反應(yīng)器，研究不同pH調(diào)節(jié)劑對(duì)反應(yīng)器運(yùn)行效率的影響，發(fā)現(xiàn)以MgCO3作為pH調(diào)節(jié)劑時(shí)，丁二酸質(zhì)量濃度分別比以NH3·H2O-Na2CO3和KOH-K2CO3作為調(diào)節(jié)劑時(shí)提高32%與20%。在反應(yīng)器中采用反復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵的操作方式，平均每35 h一個(gè)批次，發(fā)酵運(yùn)行175 h，丁二酸平均質(zhì)量濃度為87.8 g/L，平均生產(chǎn)強(qiáng)度為2.51 g/(L·h)，平均轉(zhuǎn)化率為0.86 g/g。結(jié)果表明，構(gòu)建的纖維床反應(yīng)器有利于實(shí)現(xiàn)丁二酸的高濃度、高生產(chǎn)強(qiáng)度和高轉(zhuǎn)化率。

丁二酸；固定；發(fā)酵；反應(yīng)器

丁二酸是一種常見的天然有機(jī)酸，也是一種重要的C4平臺(tái)化合物，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、可降解塑料和化工行業(yè)。工業(yè)上通常通過丁烯二酸催化或者丁二腈水解還原制得丁二酸。2004年美國(guó)能源部將丁二酸列為最有希望實(shí)現(xiàn)生物法產(chǎn)業(yè)化的12種化合物之一[1]。生物基丁二酸的開發(fā)對(duì)于擺脫對(duì)化石資源的依賴，減少環(huán)境污染并減輕大氣溫室效應(yīng)有著重要意義。

自2000年后，通過發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸取得的進(jìn)展主要體現(xiàn)為：(1)以天然產(chǎn)丁二酸的琥珀酸放線桿菌Actinobacillussuccinogenes130Z[2]、NJ113[3]、CGMCC No.1593[4]和BasfiasucciniciproducensDSM 18541[5]為代表的厭氧發(fā)酵技術(shù)，產(chǎn)酸水平為40～108 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度0.9～1.3 g/(L·h)，糖酸轉(zhuǎn)化率0.50～0.87 g/g；(2)以E.coli工程菌NZN111、AFP111[6]、KJ122和KJ134[7]為代表的好氧-厭氧兩階段發(fā)酵技術(shù)，產(chǎn)酸55～99 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度0.9～1.1 g/(L·h)，產(chǎn)率0.90～1.10 g/g；(3)以E.coli工程菌HL27659k[8]、酵母工程菌Suc-297[9]為代表的好氧發(fā)酵技術(shù)，產(chǎn)酸43～58 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度0.2～1.1 g/(L·h)，產(chǎn)率0.20～0.60 g/g；(4)以CorynebacteriumglutamicumΔldhA-pCRA717為代表的生長(zhǎng)限制工藝，最高產(chǎn)酸146 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度3.17 g/(L·h)，產(chǎn)率0.92 g/g[10]。雖然利用Corynebacteriumglutamicum工程菌的產(chǎn)酸達(dá)到了高產(chǎn)酸濃度、高轉(zhuǎn)化率和高生產(chǎn)強(qiáng)度，但這種生長(zhǎng)限制工藝需要較高的細(xì)胞濃度(60%)，為達(dá)到高細(xì)胞濃度，往往先生長(zhǎng)培養(yǎng)，再通過離心分離或者膜分離方法收集細(xì)胞、重懸于反應(yīng)液，這樣的操作在實(shí)際生產(chǎn)中面臨著困難。

生物法發(fā)酵產(chǎn)丁二酸屬于常規(guī)的微生物厭氧發(fā)酵過程，傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝有分批、補(bǔ)料分批、半連續(xù)以及連續(xù)發(fā)酵等，新型的發(fā)酵工藝則是將傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝與固定化技術(shù)或生物反應(yīng)器結(jié)合以增加細(xì)胞濃度、除去產(chǎn)物積累，從而達(dá)到提高總產(chǎn)物濃度或生產(chǎn)效率的目的。本課題組前期通過基因組改組手段，獲得高產(chǎn)菌株AcitnobacillussuccinogenesF3-ZK(CCTCCNO：M2012036)[11]，其最高產(chǎn)酸達(dá)到95.6 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率0.71 g/g。然而利用琥珀酸放線桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的過程中，細(xì)胞濃度低及生長(zhǎng)速度緩慢是主要限制因素。本工作針對(duì)該問題，提出采用固定化的方式將琥珀酸放線桿菌與載體結(jié)合，以期實(shí)現(xiàn)菌體從體系中的快速分離與重新使用，進(jìn)而給連續(xù)生產(chǎn)帶來便利。在固定化載體方面，分別使用甘蔗殘?jiān)⒕郾┪⒚桌w維膜以及棉纖維作為載體，通過優(yōu)化載體使用量并研究載體的重復(fù)使用穩(wěn)定性，進(jìn)而構(gòu)建琥珀酸放線桿菌固定化的轉(zhuǎn)動(dòng)式纖維床反應(yīng)器，以期提高丁二酸生產(chǎn)效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和原材料

琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)CCTCC M2012036，由本實(shí)驗(yàn)室自主篩選誘變得到，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)[11]；甘蔗渣殘?jiān)杀緦?shí)驗(yàn)室自制[12]；聚丙烯微米纖維膜由浙江省紡織測(cè)試研究院提供；棉纖維購(gòu)買于孚日集團(tuán)股份有限公司(山東，中國(guó))。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基配制方法見文獻(xiàn)[13]。

發(fā)酵培養(yǎng)基制方法見文獻(xiàn)[13]，其中初始葡萄糖質(zhì)量濃度為50 g/L。

MgCO3粉末在170℃條件下滅菌2 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 游離細(xì)胞搖瓶發(fā)酵方法

25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中以體積分?jǐn)?shù)2.5%的接種量接入琥珀酸放線桿菌，加入1 g滅過菌的MgCO3，在厭氧培養(yǎng)箱中38℃靜置培養(yǎng)48 h。

1.2.2 固定化細(xì)胞搖瓶發(fā)酵方法

將載體放入25 mL種子培養(yǎng)基中，以體積分?jǐn)?shù)2.5%的接種量接入琥珀酸放線桿菌，放在厭氧培養(yǎng)箱中38℃下靜置培養(yǎng)12 h后，取出載體，投入裝有25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，同時(shí)加入1 g滅過菌的MgCO3，在厭氧培養(yǎng)箱中38 ℃靜置培養(yǎng)48 h。反復(fù)分批發(fā)酵時(shí)，將載體從發(fā)酵液中取出投入新鮮培養(yǎng)基。

1.2.3 纖維床反應(yīng)器發(fā)酵產(chǎn)丁二酸

發(fā)酵罐上纖維床反應(yīng)器吸附琥珀酸放線桿菌是將培養(yǎng)好的種子以體積分?jǐn)?shù)2.5%的接種量添加到裝有2 L種子培養(yǎng)基的反應(yīng)器中，在38 ℃下培養(yǎng)6 h，當(dāng)pH降低至6.2時(shí)，用蠕動(dòng)泵將種子液排出，補(bǔ)加新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基1.6 L，38 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速120 r/min，每隔3～4 h取樣測(cè)葡萄糖質(zhì)量濃度，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度低于5 g/L時(shí)，發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵過程中控制pH為6.5。當(dāng)使用NH3·H2O-Na2CO3以及KOH-K2CO3作為調(diào)節(jié)劑時(shí)，當(dāng)發(fā)酵液pH下降至6.5以下，通過蠕動(dòng)泵自動(dòng)流加NH3·H2O-Na2CO3以及KOH-K2CO3水溶液；使用MgCO3作為調(diào)節(jié)劑的時(shí)候，當(dāng)發(fā)酵液pH下降至6.5以下，手動(dòng)從進(jìn)料口加入MgCO3固體粉末。纖維床反應(yīng)器反復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵是當(dāng)發(fā)酵液中殘?zhí)琴|(zhì)量濃度降低至10 g/L時(shí)，一次性加入高質(zhì)量濃度的葡萄糖，使得發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度達(dá)到55 g/L左右，待殘?zhí)琴|(zhì)量濃度再一次降低到5 g/L以下時(shí)，將發(fā)酵液排出，添加新鮮培養(yǎng)基重復(fù)上述補(bǔ)料分批發(fā)酵，反復(fù)操作4批次。

1.2.4 分析方法

發(fā)酵液中生物量采用比濁法[14]，糖、有機(jī)酸的測(cè)定采用高效液相色譜法[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同載體對(duì)琥珀酸放線桿菌的固定化及產(chǎn)酸穩(wěn)定性

2.1.1 甘蔗渣殘?jiān)鳛楣潭ɑd體

甘蔗渣是甘蔗提煉甘蔗汁后留下的纖維性物質(zhì)，主要組分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。甘蔗渣經(jīng)堿預(yù)處理聯(lián)合纖維素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶和果膠酶復(fù)合處理后的殘?jiān)鼮楦收嵩鼩堅(jiān)?。從圖1(a)可以看出，經(jīng)過預(yù)處理以及酶解之后的甘蔗渣殘?jiān)臻g結(jié)構(gòu)松散，為菌體提供了附著空間。因此嘗試使用甘蔗渣殘?jiān)鳛檩d體吸附琥珀酸放線桿菌，以減少種子的培養(yǎng)操作進(jìn)而縮短發(fā)酵周期。

圖1 載體(a)甘蔗渣殘?jiān)?b)聚丙烯微米纖維膜和 (c)棉纖維掃描電鏡圖Fig.1 SEM images of supports (a) sugarcane bagasse residue,(b) polypropylene microfiber membrane and (c) cotton cloth

對(duì)甘蔗渣殘?jiān)诎l(fā)酵過程中的用量進(jìn)行優(yōu)化，初糖質(zhì)量濃度為50 g/L，結(jié)果見表1。從表1可以看出，隨著甘蔗渣殘?jiān)砑恿康脑黾?，丁二酸的質(zhì)量濃度、發(fā)酵液中的生物量開始呈上升趨勢(shì)；當(dāng)甘蔗渣殘?jiān)奶砑恿繛?0 g/L時(shí)，丁二酸質(zhì)量濃度達(dá)到了40.0±3.25 g/L，丁二酸對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.81±0.06 g/g的最高值。當(dāng)甘蔗渣殘?jiān)奶砑恿坑?0 g/L增加到20 g/L時(shí)，丁二酸的產(chǎn)量下降，可能是過高的甘蔗渣殘?jiān)砑恿坑绊懥税l(fā)酵液的傳質(zhì)。對(duì)生物量進(jìn)行生物學(xué)統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性檢驗(yàn)，所得p>0.05，說明平均數(shù)之間差異不顯著。

表1 不同甘蔗渣殘?jiān)砑恿繉?duì)丁二酸生產(chǎn)的影響Table 1 The effect of sugarcane bagasse residue usage on the production of succinic acid

進(jìn)一步，將甘蔗渣殘?jiān)糜诜磸?fù)分批發(fā)酵，3個(gè)批次的丁二酸產(chǎn)量分別為40.2、40.0和39.8 g/L。然而，由于甘蔗渣殘?jiān)w粒小，因此從發(fā)酵體系中分離回收不方便，為了便于載體的回收利用，接下來將使用連續(xù)的纖維材料作為固定化載體。

2.1.2 聚丙烯微米纖維膜作為固定化載體

聚丙烯微米纖維膜(圖1(b))具有纖維細(xì)、比表面積大、孔隙小而孔隙率大的特性。本實(shí)驗(yàn)中使用的聚丙烯微米纖維膜主要性能參數(shù)為：膜外徑約3.24±0.57 μm、微孔孔徑約0.1～0.2 μm、孔隙率約40%～50%。在發(fā)酵液中初始葡萄糖質(zhì)量濃度為35 g/L時(shí)，研究載體的表面積與發(fā)酵液體積比對(duì)琥珀酸放線桿菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酸的影響，結(jié)果如表2所示。當(dāng)載體表面積與發(fā)酵液體積比為1.0∶1和1.5∶1 (cm2∶cm3)時(shí)，丁二酸的轉(zhuǎn)化率高達(dá)0.87±0.05 g/g和0.88±0.04 g/g?？紤]到經(jīng)濟(jì)效益，確定載體用量為載體表面積/發(fā)酵液體積比為1.0∶1 (cm2∶cm3)。對(duì)生物量進(jìn)行生物學(xué)統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，所得p<0.05，說明平均數(shù)之間差異顯著。

表2 聚丙烯微米纖維膜用量對(duì)丁二酸生產(chǎn)的影響Table 2 Effect of polyproplene microfiber membrane usage on the production of succinic acid

在這一載體用量下，進(jìn)行丁二酸的反復(fù)分批發(fā)酵。每一次發(fā)酵結(jié)束后，取出載體，置于無(wú)菌水中清洗并重新投入新鮮發(fā)酵液中，連續(xù)進(jìn)行6批次發(fā)酵，結(jié)果如表3所示。在前5個(gè)批次的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，體系內(nèi)的琥珀酸放線桿菌具有較強(qiáng)活力，丁二酸的平均轉(zhuǎn)化率為0.85±0.07 g/g。到了第6次發(fā)酵，菌體對(duì)葡萄糖的消耗和丁二酸生成能力開始下降。

表3 聚丙烯微米纖維膜吸附琥珀酸放線桿菌反復(fù)分批發(fā)酵產(chǎn)丁二酸Table 3 Repeated batch fermentation of Actinobacillus succinogenes-immobilized polypropylene microfiber membrane

2.1.3 棉纖維作為固定化載體

棉纖維材料具有大量的空隙(圖1(c))，通過物理吸附的方式，能夠?qū)⒓?xì)胞吸附在棉纖維表面以及內(nèi)部空隙之間。初糖質(zhì)量濃度為50 g/L時(shí)考察了棉纖維材料用量對(duì)琥珀酸放線桿菌發(fā)酵丁二酸的影響。結(jié)果(表4)表明，當(dāng)纖維載體表面積與裝液量之比為2.0∶1時(shí)，產(chǎn)丁二酸質(zhì)量濃度最高，為37.4±2.97 g/L；繼續(xù)增加比例可能使得棉纖維載體相對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基體積過大，阻礙了傳質(zhì)的進(jìn)行，丁二酸的質(zhì)量濃度降低至34.2±3.00 g/L。綜上所述，載體表面積與發(fā)酵液體積之比選擇2.0∶1最合適。對(duì)生物量進(jìn)行生物學(xué)統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，所得p<0.05，說明平均數(shù)之間差異顯著。

表4 棉纖維用量對(duì)丁二酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響Table 4 Effect of cotton cloth usage on the production of succinic acid

進(jìn)一步考察棉纖維吸附琥珀酸放線桿菌反復(fù)利用情況，搖瓶反復(fù)分批發(fā)酵進(jìn)行了10批次，結(jié)果(表5)表明，丁二酸的產(chǎn)量在10批次內(nèi)沒有明顯的變化，平均產(chǎn)酸36.5±3.50 g/L，平均轉(zhuǎn)化0.85±0.06 g/g。

表5 棉纖維吸附琥珀酸放線桿菌搖瓶反復(fù)分批發(fā)酵產(chǎn)丁二酸Table 5 Repeated batch fermentation of Acitnobacillus succinogenes-immobilized cotton cloth

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，甘蔗渣殘?jiān)⒕郾┪⒚桌w維膜和棉纖維材料均可以作為載體吸附琥珀酸放線桿菌，其中在搖瓶水平，當(dāng)載體使用量都在最優(yōu)條件時(shí)，聚丙烯微米纖維膜產(chǎn)丁二酸相對(duì)最優(yōu)。從載體材料使用量來看，在25 mL的搖瓶發(fā)酵液體系中，3種載體的使用量分別是0.25 g甘蔗渣殘?jiān)?.17 g聚丙烯微米纖維膜和1.76 g棉纖維，聚丙烯微米纖維膜使用量最少。從載體的來源來看，甘蔗渣是常見的農(nóng)業(yè)廢棄物，聚丙烯微米纖維膜和棉纖維目前均已工業(yè)化生產(chǎn)且棉纖維的成本更低廉。從載體的分離來看，當(dāng)使用甘蔗渣殘?jiān)鳛檩d體時(shí)，由于其呈粉末裝分散在發(fā)酵液里，給載體的分離帶來一定操作困難，棉纖維和聚丙烯微米纖維膜均易于從發(fā)酵體系中分離。從重復(fù)使用穩(wěn)定性來看，棉纖維材料使用穩(wěn)定性相對(duì)最優(yōu)?？紤]到反應(yīng)器放大發(fā)酵時(shí)，載體的穩(wěn)定性和強(qiáng)度至關(guān)重要，后續(xù)以棉纖維材料為例研究纖維床反應(yīng)器。

2.2 纖維床反應(yīng)器的構(gòu)建及其對(duì)丁二酸的生產(chǎn)

2.2.1 纖維床反應(yīng)器的構(gòu)型

在棉纖維載體表面積與發(fā)酵液體積比為 2.0∶1 (cm2∶cm3)的基礎(chǔ)上，將棉纖維載體平鋪于鐵絲網(wǎng)上并固定在3 L發(fā)酵罐(Biotech-3BG，上海市寶興生物設(shè)備有限公司)的攪拌軸上，構(gòu)建了轉(zhuǎn)動(dòng)式纖維床反應(yīng)器(圖2)。棉纖維材料吸附琥珀酸放線桿菌主要是依靠靜電力，將細(xì)胞吸附在棉纖維載體表面，隨著發(fā)酵培養(yǎng)基的更換以及跟隨攪拌轉(zhuǎn)軸的同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)，衰老的細(xì)胞從棉纖維材料上脫落下來，同時(shí)強(qiáng)壯的新細(xì)胞附著在棉纖維載體上；另一方面，由于吸附作用并不穩(wěn)定，細(xì)胞在攪拌作用下從棉纖維載體上脫落，同時(shí)又隨著徑向的作用重新吸附到棉纖維載體上，這樣更加有利于細(xì)胞對(duì)底物的利用。

圖2 內(nèi)置式轉(zhuǎn)動(dòng)纖維床反應(yīng)器實(shí)物圖Fig.2 Image of rotary fibrous-bed bioreactor

2.2.2 不同pH調(diào)節(jié)劑對(duì)反應(yīng)器運(yùn)行效率的影響

丁二酸發(fā)酵過程中隨著產(chǎn)酸的積累，pH會(huì)逐漸降低，當(dāng)pH低于5.0時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)酸均停止；根據(jù)電子守恒理論計(jì)算方程可得：1 mol葡萄糖在0.86 mol CO2參與下，理論生成1.71 mol丁二酸[16]。這說明發(fā)酵過程中pH調(diào)節(jié)劑不僅需要調(diào)節(jié)pH，還需要提供CO2。因此，本實(shí)驗(yàn)在纖維床反應(yīng)器的基礎(chǔ)上研究不同pH調(diào)節(jié)劑對(duì)反應(yīng)器產(chǎn)酸的影響。在這里選擇的pH調(diào)節(jié)劑包括NH3·H2O-Na2CO3、KOH-K2CO3以及MgCO3。

利用上述pH調(diào)節(jié)劑將pH恒控制為6.5，對(duì)丁二酸生產(chǎn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6所示。發(fā)現(xiàn)以MgCO3作為pH調(diào)節(jié)劑時(shí)，丁二酸濃度分別比其他二者提高了32%與20%。這可能是因?yàn)镸gCO3是弱堿，Mg2+容易取代H+與丁二酸分子螯合形成絡(luò)合物，減輕了未解離形式的丁二酸對(duì)細(xì)胞的抑制；此外有報(bào)道稱K+、Na+與細(xì)胞膜的運(yùn)輸有關(guān)，因此可能會(huì)影響菌體對(duì)葡萄糖的利用。

2.2.3 纖維床反應(yīng)器的運(yùn)行穩(wěn)定性

在3 L發(fā)酵罐的纖維床反應(yīng)器中，反復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵5批次，發(fā)酵運(yùn)行175 h，發(fā)酵曲線如圖3所示。平均每35 h一個(gè)批次，丁二酸平均質(zhì)量濃度為87.8 g/L，平均生產(chǎn)強(qiáng)度為2.51 g/(L·h)，平均轉(zhuǎn)化率為0.86 g/g，在這5個(gè)批次中，剩余葡萄糖濃度均為5 g/L以下。其中第3批次時(shí)，獲得的丁二酸質(zhì)量濃度最大，為98.7 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為2.77 g/(L·h)，轉(zhuǎn)化率為0.89 g/g。發(fā)酵第5個(gè)批次后，產(chǎn)酸下降，說明纖維床反應(yīng)器采用補(bǔ)料分批發(fā)酵的操作方式的操作周期為5批次(175 h)左右，后續(xù)希望對(duì)反應(yīng)器的材料和內(nèi)部結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)進(jìn)行深入研究，從而進(jìn)一步延長(zhǎng)操作周期。

表6 不同pH調(diào)節(jié)劑對(duì)丁二酸生產(chǎn)的影響Table 6 Effect of pH regulator on the production of succinic acid

■丁二酸;▲葡萄糖;◇生物量圖3 纖維床反應(yīng)器反復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵圖Fig.3 Repeated fed-batch fermentation behavior of fibrous-bed bioreactor

3 結(jié)論

本文系統(tǒng)地研究了吸附琥珀酸放線桿菌的載體材料及其發(fā)酵產(chǎn)丁二酸性能，并構(gòu)建轉(zhuǎn)動(dòng)式纖維床反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)丁二酸的高效生產(chǎn)。研究表明，棉纖維、聚丙烯微米纖維膜和甘蔗渣殘?jiān)梢晕界晁岱啪€桿菌，其中采用棉纖維作為載體，反復(fù)分批發(fā)酵運(yùn)轉(zhuǎn)10批次，結(jié)果平均產(chǎn)酸為36.5±3.50 g/L，平均轉(zhuǎn)化率為0.85±0.06 g/g。進(jìn)而利用棉纖維構(gòu)建轉(zhuǎn)動(dòng)式纖維床反應(yīng)器，采用補(bǔ)料分批發(fā)酵的操作方式，可實(shí)現(xiàn)同時(shí)高產(chǎn)酸、高生產(chǎn)強(qiáng)度以及高轉(zhuǎn)化率，運(yùn)行周期約為175 h，有較好的穩(wěn)定性。

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ImmobilizationofActinobacillussuccinogenesandtheproductionofsuccinicacidusingfibrous-bedbioreactor

CHEN Peng-cheng,ZHENG Pu*

(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology， Ministry of Education， School of Biotechnology， Jiangnan University， Wuxi 214122， China)

In this paper,sugarcane bagasse residue,polypropylene microfiber membrane and cotton cloth were adopted as supports to immobilizeActinobacillussuccinogenesfor the fermentative production of succinic acid.The usage of supports was optimized to improve the yield of succinic acid and repeated batch fermentation was conducted to study the reusable stability of supports.Polypropylene microfiber membrane was preferred in the production of succinic acid while cotton cloth was preferred in the reusable stability test.As a result,cotton cloth was used in the construction of a fibrous-bed bioreactor.In the study of the effect of pH regulator on bioreactor efficiency,there were 32% and 20% increase in succinic acid concentration when using MgCO3as the pH regulator compared with that using NH3·H2O-Na2CO3and KOH-K2CO3.Repeated fed-batch fermentation was operated in the bioreactor with the average batch time of 35 h and the total operation time of 175 h.Results showed that the average concentration,productivity and yield of succinic acid were 87.8 g/L,2.51 g/(L·h) and 0.86 g/g,respectively.Results showed that the fibrous-bed bioreactor reported in this paper should be helpful for high concentration,high productivity and high yield of succinic acid.

succinic acid; immobilization; fermentation; bioreactor

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.015305

博士，講師(鄭璞教授為通訊作者，E-mail：zhengpu@jiangnan.edu.cn)。

國(guó)家自然科學(xué)基金(21604032)；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題(2015BAD15B04)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(JUSRP116031)；江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(KLIB-KF201501)

2017-07-25，改回日期：2017-08-03