鄒曉月，熊御云，張龍鋒，王 蓓，徐 靜

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇鎮(zhèn)江 212001)

論著·臨床研究

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血濾泡輔助性T淋巴細胞百分率的變化及意義*

鄒曉月，熊御云△，張龍鋒，王 蓓，徐 靜

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇鎮(zhèn)江 212001)

目的探討濾泡輔助性T淋巴細胞(Tfh)百分率在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者外周血中的變化及意義。方法選取該院2016年9-11月收治的RA患者，分為RA活動組與RA穩(wěn)定組，各35例。另選取同期行健康體檢者35例作為健康對照組。用流式細胞術(shù)檢測受試者外周血CD4+CXCR5+ICOS+Tfh細胞的百分率，分析RA患者外周血Tfh細胞百分率與28個關(guān)節(jié)疾病活動度評分(DAS28)、抗環(huán)瓜氨酸肽(CCP)抗體及類風(fēng)濕因子(RF)水平的相關(guān)性。結(jié)果RA活動組外周血Tfh細胞百分率[(0.84±0.16)%]明顯高于RA穩(wěn)定組[(0.64±0.15)%]及健康對照組[(0.56±0.14)%]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；且RA穩(wěn)定組亦高于健康對照組(P<0.05)。RA患者外周血Tfh細胞百分率與DAS28及抗CCP抗體水平均呈明顯正相關(guān)(r=0.355、0.324，P<0.01)，與RF水平無明顯相關(guān)性(r=0.205，P>0.05)。結(jié)論外周血中Tfh細胞百分率的增加可能與RA的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

濾泡輔助性T淋巴細胞；關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕；流式細胞術(shù)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以對稱性外周多關(guān)節(jié)病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的慢性自身免疫病，自身抗體引發(fā)慢性炎癥是RA的重要特征[1]。目前認為患者體內(nèi)淋巴細胞的高度活化及T、B淋巴細胞之間相互作用導(dǎo)致致病性自身抗體的產(chǎn)生是RA發(fā)病的重要因素[2]。B淋巴細胞產(chǎn)生抗體需要T淋巴細胞的輔助，近年有學(xué)者認為輔助B淋巴細胞產(chǎn)生抗體的最主要T淋巴細胞亞群是濾泡輔助性T細胞( T follicular helper cells，Tfh)[3]。Tfh細胞分布異?；驍?shù)量增多或功能亢進均可導(dǎo)致自身抗體的產(chǎn)生，引發(fā)自身免疫病[4]。鑒于CD4+CXCR5+ICOS+為Tfh細胞為較合適的表面標志[5]，本研究用流式細胞術(shù)檢測了RA患者外周血CD4+CXCR5+ICOS+Tfh細胞百分率，分析外周血Tfh細胞百分率與28個關(guān)節(jié)疾病活動度評分(DAS28)、抗環(huán)瓜氨酸肽(CCP)抗體及類風(fēng)濕因子(RF)水平之間的相關(guān)性，初步探討Tfh細胞分布、數(shù)量的變化與RA之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 70例RA患者為本院2016年9-11月的門診及住院患者，RA診斷符合美國風(fēng)濕病學(xué)會/歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟(ACR/EULAR)2010年修訂的最新分類標準[6]。按照DAS28將患者分為RA活動組(DAS28大于或等于2.6分)與RA穩(wěn)定組(DAS28小于2.6分)。RA活動組患者35例，男2例、女33例，年齡20～61歲，平均(42±13)歲；RA穩(wěn)定組患者35例，男3例、女32例，年齡21～63歲，平均(43±12)歲；所有患者無其他自身免疫病。另選取35例性別與年齡相匹配的于本院做健康體檢者為健康對照組，排除所有自身免疫病。

1.2主要儀器與試劑 異硫氰酸(FITC)標記的鼠抗人CXC型趨化因子受體5(CXCR5)抗體、多甲藻葉綠素蛋白(PerCP)標記的鼠抗人CD4抗體、藻紅蛋白(PE)標記的鼠抗人誘導(dǎo)性協(xié)同刺激分子(ICOS)抗體及相應(yīng)的同型對照IgG1-PE(美國BD公司)，淋巴細胞分離液(天津灝洋生物制品科技有限公司)，抗CCP抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(上?？菩律锛夹g(shù)股份有限公司)，RF免疫比濁法檢測試劑盒(美國Beckman Coulter公司)。FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)；DRAGON MK3酶標儀(芬蘭Denley公司)；IMMAGE 800型特種蛋白分析儀(美國Beckman Coulter公司)。

A：設(shè)門于CD4+淋巴細胞；B：RA活動組；C：RA穩(wěn)定組；D：健康對照組

圖1流式細胞術(shù)檢測外周血CD4+CXCR5+ICOS+Tfh細胞

1.3方法

1.3.1外周血單個核細胞(PBMC)的分離 于清晨抽取受試者空腹靜脈血4.0 mL，以肝素抗凝。用淋巴細胞分離液分離出PBMC，再以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后，將細胞數(shù)調(diào)成1×108cells/mL備用。

1.3.2細胞染色 在流式專用試管中加入上述PBMC懸液200 μL、CD4-PerCP 10 μL、CXCR5-FITC 10 μL、ICOS-PE 10 μL后混勻(同時設(shè)同型對照管)，室溫避光靜置20 min，加入2 mL PBS洗滌1次后以300 μL PBS重懸細胞待測。

1.3.3流式細胞術(shù)檢測 用Cellquest軟件獲取并分析3×106個細胞數(shù)據(jù)。在CD4-SSC點圖上設(shè)門于CD4+淋巴細胞，測定其中CXCR5+ICOS+細胞的百分率。

1.3.4抗CCP抗體及RF檢測 抗CCP抗體檢測按試劑盒說明書進行，RF按試劑盒說明書及特種蛋白分析儀操作規(guī)程進行測定。

2 結(jié) 果

2.1RA患者外周血CD4+CXCR5+ICOS+Tfh細胞百分率 RA活動組外周血Tfh細胞百分率[(0.84±0.16)%]明顯高于RA穩(wěn)定組[(0.64±0.15)%]及健康對照組[(0.56±0.14)%]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；RA穩(wěn)定組亦高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、2。

圖2 RA患者外周血Tfh細胞的百分率

2.2RA患者外周血Tfh細胞百分率與DAS28、抗CCP抗體及RF水平的相關(guān)性 相關(guān)性分析顯示，RA患者外周血Tfh細胞百分率與DAS28呈明顯正相關(guān)(r=0.355，P<0.01)，與抗CCP抗體水平呈明顯正相關(guān)(r=0.324，P<0.01)，與RF水平之間無明顯相關(guān)性(r=0.205，P>0.05),見圖3。

A：外周血Tfh細胞百分率與DAS28相關(guān)性；B：外周血Tfh細胞百分率與抗CCP抗體水平相關(guān)性；C：外周血Tfh細胞百分率與RF水平相關(guān)性

圖3 A患者外周血Tfh細胞百分率與DAS28、抗CCP抗體及RF水平的相關(guān)性

3 討 論

自身抗體導(dǎo)致骨質(zhì)破壞是RA的重要特征，而自身抗體的產(chǎn)生與T、B淋巴細胞的高度活化及相互作用密切相關(guān)[2]。Tfh細胞是新近發(fā)現(xiàn)的輔助B淋巴細胞產(chǎn)生抗體的T淋巴細胞亞群，正常情況下該細胞存在于B淋巴濾泡中，當機體發(fā)生自身免疫時，會出現(xiàn)在淋巴組織之外[7]。

濾泡歸巢受體CXCR5+、ICOS+和CD40配體(CD40L)+是Tfh細胞重要的表面特征[5]。CXCR5是濾泡歸巢CXC型趨化因子配體13(CXCL13)的受體，CXCR5同時也表達于B淋巴細胞表面。存在于B淋巴濾泡中的濾泡樹突狀細胞產(chǎn)生CXCL13繼而趨化Tfh細胞與B淋巴細胞一起到B淋巴濾泡中，Tfh細胞與B淋巴細胞相互作用后增殖分化形成生發(fā)中心(GC)[8]。在GC中，B淋巴細胞上的誘導(dǎo)性協(xié)同刺激分子配體(ICOSL)和CD40分別與Tfh細胞上的ICOS和CD40L 結(jié)合，誘導(dǎo)Tfh細胞產(chǎn)生多種細胞因子。Tfh細胞主要的效應(yīng)因子是其分泌的白細胞介素-21(IL-21)，而B淋巴細胞上有IL-21受體，Tfh分泌的IL-21與該受體結(jié)合會引發(fā)B淋巴細胞增殖，誘導(dǎo)各種B淋巴細胞亞群(記憶B淋巴細胞、生發(fā)中心B淋巴細胞、過渡型B淋巴細胞、初始B淋巴細胞、新生B淋巴細胞)分化成免疫球蛋白形成細胞并分泌大量的抗體[9]，IL-21還可促使IgG與IgA之間的型別轉(zhuǎn)換[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)RA活動組外周血Tfh細胞百分率顯著高于RA穩(wěn)定組，RA穩(wěn)定組亦高于健康對照組，此結(jié)果提示RA患者體內(nèi)存在異位且增多的Tfh細胞，且該細胞數(shù)量隨疾病活動度的增強而增加。Liu等[9]發(fā)現(xiàn)，RA患者除外周血中出現(xiàn)Tfh細胞數(shù)量增多外，其血清中的IL-21水平也出現(xiàn)異常升高，且血清IL-21水平與DAS28、抗CCP抗體水平呈顯著正相關(guān)。本研究雖未檢測RA患者IL-21水平與疾病的相關(guān)性，但患者外周血Tfh細胞百分率與DAS28、抗CCP抗體水平的相關(guān)性可表明，RA患者外周血Tfh細胞數(shù)量的增多與病情活動度及RA特異性自身抗體有關(guān)。除RA中出現(xiàn)了Tfh細胞異常外，在自身免疫性甲狀腺疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等其他自身免疫病中，Tfh細胞數(shù)量變化的趨勢與本研究相似，且與疾病特異性自身抗體呈顯著正相關(guān)[11-12]。

由于Th17細胞也分泌IL-21[13]，故血清IL-21水平與RA 的相關(guān)性并不能代表Tfh細胞與RA 的相關(guān)性。在后續(xù)工作中，筆者將用流式細胞儀無菌分選出Tfh細胞進行培養(yǎng)，用培養(yǎng)物上清液中的IL-21水平驗證Tfh細胞分泌IL-21的能力，并觀察IL-21與B淋巴細胞功能之間的關(guān)系。

綜上所述，RA患者機體內(nèi)的Tfh細胞可能出現(xiàn)了異位，異位的Tfh細胞可能發(fā)生擴增，而擴增的Tfh細胞可能引發(fā)B淋巴細胞的過度活化，從而導(dǎo)致B淋巴細胞分泌大量的致病性自身抗體，引起RA患者的免疫損傷。今后，除數(shù)量外，筆者將對RA患者Tfh細胞的功能進行研究，以進一步明確Tfh細胞在RA發(fā)病機制中的確切作用。

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ChangeandsignificanceofperipheralbloodfollicularhelperTlymphocytespercentageinpatientswithrheumatoidarthritis*

ZouXiaoyue，XiongYuyun△，ZhangLongfeng，WangBei，XuJing

(DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang,Jiangsu212001,China)

ObjectiveTo investigate the change and significance of follicular helper T cells (Tfh) percentage in the peripheral blood of the patients with rheumatoid arthritis (RA).MethodsThe RA patients treated in this hospital from September to November 2016 were selected and divided into the RA active group and RA stable group,35 cases in each group.Contemporaneous 35 individuals undergoing physical examination were selected as the healthy control group.The percentage of peripheral blood CD4+CXCR5+ICOS+Tfh cells was detected by flow cytometry.The correlations between the percentage of peripheral blood Tfh cells in RA patients with the RA disease activity score 28(DAS28),anti-CCP antibody and rheumatoid factor(RF) levels were analyzed.ResultsThe percentage of peripheral blood Tfh cells in the RA active group was (0.84±0.16)%,which was significantly higher than (0.64±0.15)% in the RA stable group and (0.56±0.14)% in the healthy control group,the difference was statistically significant (P<0.01);moreover the percentage of peripheral blood Tfh cells in the RA stable group was also higher than that in the healthy control group (P<0.05).The percentage of peripheral blood Tfh cells in RA patients had significantly positive correlation with DAS28 score and anti-CCP antibody level (r=0.355,0.324；P<0.01),and had no correlation with the RF level (r=0.205，P>0.05).ConclusionThe percentage increase of peripheral blood Tfh cells in the patients with RA might be related with the pathogenesis and development of RA.

follicular helper T lymphocytes；arthritis，rheumatoid；flow cytometry

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.35.007

國家自然科學(xué)基金青年基金項目(81301657)；江蘇省自然科學(xué)基金青年基金項目(BK20130476)；江蘇省檢驗醫(yī)學(xué)重點實驗室開放課題(JSKLM-2014-011)。

鄒曉月(1970-)，副主任技師，本科，主要從事醫(yī)學(xué)免疫學(xué)檢驗研究?！?/p>

， E-mail：191853184@qq.com。

R593.22

A

1671-8348(2017)35-4920-03

2017-07-15

2017-09-15)