程麗佳，謝欣蓉，楊 明，劉 鳳，練心潔，蔣福榮

(1.成都大學(xué) 醫(yī)學(xué)院(護(hù)理學(xué)院)，四川 成都 610106；2.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106)

靈芝提取物對(duì)提高小鼠機(jī)體免疫力作用研究

程麗佳1，謝欣蓉1，楊 明1，劉 鳳2，練心潔2，蔣福榮1

(1.成都大學(xué) 醫(yī)學(xué)院(護(hù)理學(xué)院)，四川 成都 610106；2.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106)

為研究靈芝提取物多糖和生物堿對(duì)小鼠機(jī)體免疫功能的影響，將36只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組(n=12)，A組為多糖組，B組為組生物堿組，C組為空白對(duì)照組分別連續(xù)灌胃15 d(中期)和30 d(終期).灌胃結(jié)束后進(jìn)行小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力和外周血interferon-γ(IFN-γ)水平的測(cè)定.實(shí)驗(yàn)顯示，靈芝提取物多糖和生物堿均能明顯增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力和T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，同時(shí)可提高小鼠外周血中IFN-γ的表達(dá)水平.結(jié)果表明，靈芝多糖和生物堿能有效提高小鼠免疫功能.

靈芝提取物；免疫力；多糖；生物堿

0 引 言

靈芝是我國(guó)名貴的中藥材，具有增強(qiáng)免疫力、保護(hù)肝臟、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等功效[1-2].研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖、靈芝三萜、靈芝生物堿等是靈芝的主要活性成分[3].目前，關(guān)于靈芝粉，靈芝孢子油等對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)的研究較多[4-5]，但對(duì)于其具體的免疫調(diào)節(jié)有效成分的研究卻少有報(bào)道.對(duì)此，本研究通過提取靈芝有效成分——靈芝多糖和靈芝生物堿，分析其對(duì)提高機(jī)體免疫力的作用，擬為靈芝提取物的臨床治療和食用保健開發(fā)提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)所用材料包括：36只清潔級(jí)雌性Balb/c小鼠(18～22 g)，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，靈芝，購(gòu)自四川新荷花中藥飲片股份有限公司；植物血凝素(PHA、MTT)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，IFN-γELISA試劑盒，購(gòu)自上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司.

1.2 靈芝多糖與靈芝生物堿的提取

靈芝打粉后用70 %乙醇浸泡過夜，取靈芝菌粉適量，放入圓底燒瓶，加入適量蒸餾水，按一定條件(料液比、溫度、時(shí)間、粒度)進(jìn)行超聲波提取2次，過濾，濾液合并，乙醇沉淀，制得靈芝粗多糖樣品[6].靈芝生物堿樣品則是通過鹽酸浸泡后，收集析出液，沉淀后得到.

1.3 小鼠灌胃臟器/體質(zhì)量比值測(cè)定

實(shí)驗(yàn)前，對(duì)每只小鼠稱重做好記錄，然后將36只小鼠隨機(jī)分為3組，A組為靈芝多糖組，B組為靈芝生物堿組，C組為空白對(duì)照組.分別用靈芝多糖、靈芝生物堿及生理鹽水連續(xù)灌胃15 d和30 d.灌胃結(jié)束后，取小鼠胸腺及脾臟進(jìn)行稱重并做好記錄.

1.4 T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

研究證實(shí)，ConA能誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖[7-8].實(shí)驗(yàn)中，取小鼠脾臟，用刮梳法取淋巴細(xì)胞，將細(xì)胞懸液吸入離心管中，離心沉淀細(xì)胞，制作細(xì)胞懸液，濃度調(diào)至1×106/mL.然后，將細(xì)胞懸液加入到96孔培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)結(jié)束前4～6 h，于培養(yǎng)板各孔內(nèi)加入MTT液，37 ℃培養(yǎng)4～6 h后，1 000 r/min離心10 min，棄上清，各孔內(nèi)加入鹽酸—異丙醇，溶解，30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)光密度值(OD).

1.5 巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)前1天，向小鼠腹腔注射1 mL臺(tái)盼藍(lán)染液.實(shí)驗(yàn)前30 min，向小鼠腹腔內(nèi)注射1 mL 0.5%的雞紅細(xì)胞，輕揉腹部使其分散.30 min后，用頸椎脫臼法處死小鼠，剖開腹腔，用1 mL注射器吸取腹腔液，每次滴一滴腹腔液制作血涂片，并進(jìn)行瑞氏—吉姆薩染色，最后在顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照.

1.6 ELISA測(cè)定小鼠血液IFN-γ水平

取小鼠眼球靜脈血，3 000 r/min離心10 min收集血清.使用ELISA試劑盒，按說明書測(cè)定血清中的IFN-γ水平，結(jié)束后15 min內(nèi)用酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)450 nm處)測(cè)定光密度值(OD).

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，比較采用t檢驗(yàn)；P<0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝提取物對(duì)小鼠臟器/體質(zhì)量的影響

小鼠經(jīng)靈芝多糖與靈芝生物堿灌胃后，其胸腺、脾臟所占體質(zhì)量比值變化情況如圖1所示.

A.空白對(duì)照組;B.生物堿組;C.多糖組

圖1小鼠經(jīng)靈芝多糖、生物堿灌胃后，小鼠的胸腺、脾臟所占體質(zhì)量比值變化情況(*P<0.05)

由圖1可知，靈芝多糖組在中期(15 d)、終期(30 d)對(duì)小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響與空白對(duì)照組比較，差異有顯著性(P<0.05)，而靈芝生物堿組僅在終期對(duì)小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)有顯著性影響(P<0.05).

2.2 靈芝提取物對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

小鼠經(jīng)靈芝多糖與靈芝生物堿灌胃后，其細(xì)胞變化情況如圖2所示，對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的影響見表1.

A：小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞瑞氏—吉姆薩染色圖；B：小鼠巨噬細(xì)胞吞噬率；C：小鼠巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)

圖2小鼠經(jīng)靈芝多糖、生物堿灌胃后與對(duì)照組在15 d和30 d的細(xì)胞變化情況(*P<0.05)

組 別劑量/(mg/kg)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率/%中期(15d)終期(30d)靈芝多糖組140.208100.01±8.52*133.36±9.45*生物堿組140.4880.32±5.2387.33±6.23*空白對(duì)照組140.5675.35±7.3676.23±6.39

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05.

由圖2、表1可知，靈芝多糖對(duì)中期(15 d)、終期(30 d)灌胃小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率與對(duì)照組比較，均有提高，差異性顯著(P<0.05)；而靈芝生物堿僅在30 d時(shí)可顯著提高小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(P<0.05)，15 d時(shí)差異不顯著(P>0.05)；靈芝多糖組對(duì)中期(15 d)、終期(30 d)灌胃小鼠吞噬率與吞噬指數(shù)與空白對(duì)照組比較，差異性顯著(P<0.05)；而靈芝生物堿組巨噬細(xì)胞吞噬率與吞噬指數(shù)與空白對(duì)照組比較，僅終期有差異性顯著(P<0.05).實(shí)驗(yàn)證明，靈芝多糖對(duì)提高小鼠免疫力作用較為顯著.

2.3 血液IFN-γ水平的表達(dá)

經(jīng)靈芝多糖與靈芝生物堿作用后小鼠血液中IFN-γ水平表達(dá)與對(duì)照組相比在15 d與30 d的變化如圖3所示.

圖3小鼠血液中IFN-γ水平的表達(dá)(*P<0.05)

由圖3可知，靈芝多糖組和靈芝生物堿組對(duì)中期(15 d)、終期(30 d)灌胃小鼠血液中IFN-γ水平表達(dá)與空白對(duì)照組比較，差異性顯著(P<0.05).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靈芝多糖和靈芝生物堿都能提高小鼠血液中IFN-γ水平的表達(dá)，但多糖效果優(yōu)于生物堿.

3 討 論

本研究分別給予小鼠每天140 mg/kg靈芝多糖和靈芝生物堿灌胃，分別持續(xù)灌胃15 d和30 d后，未見其對(duì)小鼠體質(zhì)量有不良影響.在小鼠臟器/體質(zhì)量比值、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)的測(cè)定中，靈芝多糖組與靈芝生物堿組分別與對(duì)照組相比，靈芝多糖組在中期與終期，其比值有顯著性差異(P<0.05)，靈芝生物堿組在中期無顯著性差異(P>0.05)，在終期有顯著性差異(P<0.05).而在小鼠血液IFN-γ水平測(cè)定中，靈芝多糖組與靈芝生物堿組分別與對(duì)照組相比，2組IFN-γ水平均有顯著性差異(P<0.05).

脾臟是動(dòng)物重要的免疫器官，脾臟質(zhì)量的增加相對(duì)表明機(jī)體免疫功能增強(qiáng)[9].在本實(shí)驗(yàn)中，靈芝多糖組在中期、終期對(duì)小鼠臟器/體質(zhì)量、吞噬能力和T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力均有提高.而對(duì)應(yīng)能力在靈芝生物堿組的中期無有效提高，在終期提高較為明顯.靈芝多糖組與靈芝生物堿組的灌胃小鼠外周血血清中IFN-γ含量與對(duì)照組比較均有提高，說明靈芝多糖與靈芝生物堿均能增加IFN-γ分泌量，并以此調(diào)節(jié)小鼠機(jī)體免疫功能.

小鼠免疫功能實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，靈芝提取物在等劑量時(shí)均對(duì)提高小鼠機(jī)體免疫力有一定作用，但靈芝提取物多糖對(duì)提高小鼠機(jī)體免疫力作用更為顯著和快速，而靈芝生物堿發(fā)揮作用時(shí)間較慢.

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，靈芝提取物多糖與生物堿對(duì)小鼠免疫功能有促進(jìn)作用.此表明，在臨床上對(duì)于免疫力較低人群可輔以靈芝多糖與靈芝生物堿所制藥物加以治療可以增強(qiáng)其機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能，對(duì)免疫功能一般的人群輔以靈芝提取物所制保健品可提高其機(jī)體的免疫力.

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StudyonEffectsofGanodermaLucidumExtractonImmunityofMiceOrganism

CHENGLijia1,XIEXinrong1,YANGMing1,LIUFeng2,LIANXinjie2,JIANGFurong1

(1.School of Medicine(School of Nursing), Chengdu University, Chengdu 610106, China；2.School of Pharmacy and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China)

The paper is going to study the effects of Ganoderma lucidum extract that are polysaccharide and alkaloid on the immune function of mice organism.The 36 female BALB/c mice are randomly divided into 3 groups(n=12):polysaccharide group(group A),alkaloid group(group B) and the control group(group C).All mice are under intragastric administration for 15 days(Medium-term) and 30 days(Final-term).At last,their macrophage phagocytosis ability,T lymphocyte transformation capacity and interferon-gamma (IFN-γ) levels are measured.The results show that both the polysaccharides and alkaloids can significantly enhance the phagocytosis of macrophage ability,T lymphocyte transformation capability and the expression of IFN-γ in peripheral blood.It's concluded that both the polysaccharide and alkaloid of Ganoderma lucidum can improve the immune function of mice.It's suggested that the immunocompromised people take the ganoderma lucidum products to improve their immunity.

Ganoderma lucidum extract;immunity;polysaccharide;alkaloid

R285.5

A

1004-5422(2017)04-0361-04

2017-09-30.

國(guó)家自然科學(xué)基金(51402027)、 藥食同源植物資源開發(fā)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(10Y201704)資助項(xiàng)目.

程麗佳(1989 — )，女，博士，副教授，從事生物材料骨誘導(dǎo)機(jī)制研究.