張平 馬瀟 王曉琳 李冬華 宋平順

摘要：目的 建立測(cè)定當(dāng)歸中按不同比例摻入獨(dú)活的HPLC分析方法及特征指紋圖譜，為HPLC特征指紋圖譜法甄別當(dāng)歸藥材摻偽樣品提供依據(jù)。方法 采用Agilent TC-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），以乙腈（A）-0.05%磷酸（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～20 min，95%～75%B；20～60 min，75%～65%B；60～80 min，65%～5%B），流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫30 ℃。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》對(duì)當(dāng)歸、獨(dú)活及摻偽樣品的HPLC圖譜進(jìn)行比較分析。結(jié)果 當(dāng)歸和獨(dú)活色譜圖中各色譜峰分離良好，HPLC指紋圖譜中有11個(gè)峰可作為區(qū)別點(diǎn)，其中7號(hào)峰為阿魏酸，32號(hào)峰為蛇床子素，34號(hào)峰為二氫歐芹醇當(dāng)歸酸酯。結(jié)論 本方法快速、簡(jiǎn)單易行，能夠全面反映當(dāng)歸藥材品質(zhì)，可以明確判斷當(dāng)歸中是否混入獨(dú)活。

關(guān)鍵詞：當(dāng)歸；獨(dú)活；高效液相色譜法；指紋圖譜；摻偽

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.018

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）11-0083-04

Abstract： Objective To establish HPLC analysis methods and fingerprint of different proportions of Angelicae Pubescentis Radix in Angelicae Sinensis Radix； To use HPLC fingerprint method to identify the adulteration of Angelicae Pubescentis Radix in Angelicae Sinensis Radix. Methods Agilent TC-C18 column （5 μm， 4.6 mm × 250 mm） was adopted. Acetonitrile （A） - 0.05% phosphoric acid （B） was the mobile phase， and the gradient elution （0–20 min， 95%–75%B； 20–60 min， 75%–65%B； 60–80 min， 65%–5%B） was used； The flowrate was 1 mL/min； Detection wavelength was 254 nm； Column temperature was 30 ℃. The HPLC spectra of Angelicae Sinensis Radix， Angelicae Pubescentis Radix and adulterated samples were compared and analyzed by using TCM chromatogram fingerprint similarity evaluation system. Results Angelicae Sinensis Radix and Angelicae Pubescentis Radix showed good chromatographic peaks in chromatogram separation. 11 peaks in HPLC fingerprint could be used as the mark， including 7th peak for ferulic acid， 32th peak for osthole， and 34th peak for columbianadin. Conclusion This method is rapid， simple and feasible， can fully reflect the quality of Angelicae Sinensis Radix and clearly identify whether Angelicae Pubescentis Radix is adulterated in Angelicae Sinensis Radix.

Keywords： Angelicae Sinensis Radix； Angelicae Pubescentis Radix； HPLC； fingerprint； adulteration

獨(dú)活為傘形科植物重齒毛當(dāng)歸Angelica pubescens Maxim.F.biserrata Shan et Yuan的干燥根，具有祛風(fēng)除濕、通痹止痛功效[1]。當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤(rùn)腸通便功效[1]。獨(dú)活主要含有蛇床子素、二氫歐山芹素、二氫歐山芹醇、歐前胡素、異歐前胡素等成分，當(dāng)歸主要含揮發(fā)油（藁本內(nèi)酯）、有機(jī)酸（阿魏酸、亞油酸、硬脂酸）、多糖和黃酮等[2-5]。

當(dāng)歸和獨(dú)活藥材來(lái)源相近、外觀性狀差異不大[6]，藥材商品流通和臨床用藥時(shí)極易混淆。甄別藥材市場(chǎng)上摻偽現(xiàn)象，傳統(tǒng)的性狀鑒別存在很大困難，中藥指紋圖譜技術(shù)則以其特征性和完整性而具有明顯優(yōu)勢(shì)[7]，因此，建立當(dāng)歸和獨(dú)活藥材指紋圖譜對(duì)甄別藥材真?zhèn)尉哂兄匾饬x[8-10]。本研究通過(guò)HPLC-DAD建立當(dāng)歸、獨(dú)活及當(dāng)歸中按不同比例摻入獨(dú)活的指紋圖譜，從而對(duì)當(dāng)歸與獨(dú)活進(jìn)行鑒別，在藥品檢驗(yàn)及臨床應(yīng)用中對(duì)摻假樣品進(jìn)行甄別，保證用藥安全。

1 儀器與試藥

Waters e2998高效液相色譜儀（2998 DAD檢測(cè)器，Empower3工作站），美國(guó)Waters公司；ME-204型分析天平，梅特勒公司；XMTD-4000恒溫水浴鍋，北京永光明儀器有限公司。

蛇床子素對(duì)照品（批號(hào)110822-201308）、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對(duì)照品（批號(hào)111583-200402）、阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)110773-201313）、歐前胡素對(duì)照品（批號(hào)110826-201616），中國(guó)食品藥品檢定研究院；當(dāng)歸、獨(dú)活樣品各5批，均由本課題組在甘肅、四川、湖北等地采集或購(gòu)買，經(jīng)甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院宋平順主任藥師鑒定，分別為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根、傘形科植物重齒毛當(dāng)歸Angelica pubesce Maxim.f.biserrata Shan et Yuan的干燥根。乙腈為色譜純（天津市康科德科技有限公司），水為自制純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 摻偽樣品的制備

取當(dāng)歸、獨(dú)活樣品，粉碎，置自封袋中備用。取當(dāng)歸樣品粉末10 g，共5份，分別置燒杯中，放入分析天平稱量，分別精密加入0.5、1、2、3、4 g獨(dú)活樣品粉末，混勻，制成分別含5%、10%、20%、30%、40%獨(dú)活的摻偽當(dāng)歸樣品，備用。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液

精密稱取樣品1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入20 mL甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液

精密稱取蛇床子素、歐前胡素、阿魏酸、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含蛇床子素、歐前胡素、阿魏酸、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯80 μg的混合溶液，即得。

2.3 色譜條件

采用Agilent TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.05%磷酸（B）[4-5，11-12]，梯度洗脫（見(jiàn)表2），流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 系統(tǒng)適用性及專屬性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液、供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果表明各色譜峰分離度較好，峰形對(duì)稱，專屬性強(qiáng)。

2.4.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取當(dāng)歸供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，以7號(hào)峰阿魏酸為內(nèi)參比峰，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.1%～0.5%，相對(duì)峰面積RSD為1.5%～3.0%。精密吸取獨(dú)活供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，以32號(hào)峰蛇床子素為內(nèi)參比峰，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.3%～1.0%，相對(duì)峰面積RSD為2.0%～3.5%，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜測(cè)定要求。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取當(dāng)歸供試品溶液，于制備后0、4、8、16、24 h進(jìn)樣分析，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.2%～1.5%，相對(duì)峰面積RSD為1.1%～2.8%。取獨(dú)活供試品溶液，于制備后0、4、8、16、24 h進(jìn)樣分析，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.5%～2.0%，相對(duì)峰面積RSD為1.6%～3.2%。表明供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取當(dāng)歸樣品5份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，分別進(jìn)樣并記錄。測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.1%～0.4%，相對(duì)峰面積的RSD為0.7%～2.8%。符合指紋圖譜要求。

2.5 指紋圖譜分析

2.5.1 指紋圖譜的建立與主要色譜峰的確認(rèn)

按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別對(duì)當(dāng)歸及獨(dú)活供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》軟件，分別對(duì)當(dāng)歸和獨(dú)活進(jìn)行色譜峰匹配，生成指紋圖譜（見(jiàn)圖1、圖2），并計(jì)算各批次樣品指紋圖譜與各自生成的對(duì)照?qǐng)D譜的相似度，結(jié)果當(dāng)歸和獨(dú)活的指紋圖譜相似度均在0.9以上。

在同樣色譜條件下測(cè)定蛇床子素、歐前胡素、阿魏酸、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對(duì)照品，并與當(dāng)歸、獨(dú)活樣品指紋圖譜中相應(yīng)色譜峰進(jìn)行比較，結(jié)果表明，當(dāng)歸指紋圖譜中7號(hào)峰的保留時(shí)間及紫外光譜與阿魏酸吻合，7號(hào)特征峰為阿魏酸。獨(dú)活指紋圖譜中32、34號(hào)峰的保留時(shí)間及紫外光譜與蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯吻合，32、34號(hào)特征峰分別為蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯。對(duì)照品圖譜見(jiàn)圖3。

2.5.2 當(dāng)歸、獨(dú)活及摻偽樣品指紋圖譜比較

同一色譜條件下的當(dāng)歸、獨(dú)活HPLC指紋圖譜見(jiàn)圖4、圖5，其中當(dāng)歸共有峰26個(gè)，獨(dú)活共有峰34個(gè)。通過(guò)對(duì)當(dāng)歸、獨(dú)活指紋圖譜峰進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)11個(gè)峰有較為明顯的不同。其中，當(dāng)歸在49～58 min時(shí)間段無(wú)峰，獨(dú)活有5個(gè)峰。變化最明顯的3處為49.7、54.8、65.4 min。

分別用蛇床子素、歐前胡素、阿魏酸、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對(duì)照品對(duì)指紋圖譜進(jìn)行指認(rèn)，最終蛇床子素、阿魏酸、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯3個(gè)成分得以確認(rèn)。指紋圖譜色譜峰中未能指認(rèn)出歐前胡素，可能由于歐前胡素在樣品中含量較低，未能檢出。

當(dāng)歸中加入不同比例獨(dú)活指紋圖譜見(jiàn)圖6?？梢钥闯?，49～58 min時(shí)間段的5個(gè)峰均按所加獨(dú)活的比例逐漸增大。同時(shí)，74.9 min蛇床子素峰、76.2 min二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯峰也按加入獨(dú)活的比例依次增大，這2個(gè)成分是獨(dú)活的特有成分?？梢?jiàn)，本方法可以很好地判斷當(dāng)歸中是否混入了獨(dú)活，且混入5%獨(dú)活藥材即可定性、定量判斷。

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)制備供試品溶液時(shí)溶劑和提取方法的選擇進(jìn)行了考察，分別選用甲醇、乙醇回流提取，甲醇、乙醇超聲提取。對(duì)比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用甲醇回流提取所得圖譜的色譜峰數(shù)較多、特征性強(qiáng)，故供試品溶液制備采用甲醇回流提取法。

本試驗(yàn)在190～400 nm波長(zhǎng)掃描，同時(shí)分別設(shè)置了254、280、320、330 nm波長(zhǎng)，通過(guò)對(duì)各成分紫外吸收?qǐng)D譜的分析，綜合考慮基線、色譜峰數(shù)目、峰形和信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度，最終確定254 nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

本試驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相的組成及洗脫方式進(jìn)行了優(yōu)化。分別用甲醇-水、甲醇-水（含乙酸）、甲醇-水（含磷酸）、乙腈-水、乙腈-水（含乙酸）及乙腈-水（含磷酸）等體系進(jìn)行洗脫，結(jié)果以乙腈-0.05%磷酸水溶液體系得到的色譜峰峰形較好且較穩(wěn)定。衡比例洗脫測(cè)定時(shí)色譜峰分離效果較差，梯度洗脫法能在80 min內(nèi)使大部分色譜峰得到基線分離。

與傳統(tǒng)的性狀鑒別或以藥材對(duì)照品作為指標(biāo)性成分鑒別的方法相比，指紋圖譜鑒別方法快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單易行，能夠全面反映藥材品質(zhì)。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)歸和獨(dú)活HPLC-DAD指紋圖譜色譜峰存在明顯差別，仿照市場(chǎng)上的摻偽情況，在當(dāng)歸粉末中加入不同比例獨(dú)活粉末，最終在指紋圖譜中發(fā)現(xiàn)有11個(gè)色譜峰面積隨加入比例的增加有較為明顯的變化。本試驗(yàn)建立了當(dāng)歸、獨(dú)活及當(dāng)歸中摻入不同比例獨(dú)活的指紋圖譜，方法快速、簡(jiǎn)便，采用該方法可對(duì)當(dāng)歸與獨(dú)活進(jìn)行鑒別，對(duì)摻假樣品進(jìn)行甄別。

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