趙 丹,劉玉芬,趙文閣,劉 鵬

(哈爾濱師范大學)

基于微衛(wèi)星標記的胎生蜥蜴母本與子代的遺傳多樣性研究*

趙 丹,劉玉芬,趙文閣,劉 鵬**

(哈爾濱師范大學)

采用微衛(wèi)星標記技術，對我國胎生蜥蜴(Zootoca vivipara)3個種群共18只母本和67只子代進行遺傳多樣性分析.結果表明，11對微衛(wèi)星引物在額爾古納、庫都爾和布爾津種群檢測到的等位基因數(shù)分別為70、64和68個，YW16和YW18位點的等位基因數(shù)最多，額爾古納和庫都爾種群子代的遺傳多樣性高于母本，而布爾津種群子代的遺傳多樣性與母本無顯著差異，這可能與該種群的多父權比例低、窩仔數(shù)少有關，建議加大對該種群的研究和保護力度.

胎生蜥蜴；微衛(wèi)星；等位基因

0 引言

在動物的有性生殖過程中，父本遺傳信息的加入以及染色體分離和重組增強了子代的基因多樣化和親本的遺傳互補，使子代產(chǎn)生更大的變異和新的性狀，比母本具有更多的遺傳多樣性，從而有利于種族的繁衍和對環(huán)境的適應[1-3].目前，應用于種群遺傳多樣性檢測、婚配制度及親子關系分析、個體識別和物種保護等方面的分子標記較多.其中，微衛(wèi)星標記技術因為具有高度的個體特異性、多態(tài)性和雜合性而被廣泛使用[4,5].

胎生蜥蜴(Zootoca vivipara)隸屬于爬行綱有鱗目蜥蜴科，具有卵生-卵胎生雙重繁殖方式，我國分布的種群均為卵胎生[6].胎生蜥蜴不同地理種群在形態(tài)大小、生活史特征及遺傳結構等方面存在顯著變化[7-9].因此，該文采用微衛(wèi)星標記技術對我國胎生蜥蜴不同種群母本與子代之間的遺傳多樣性進行分析和比較，為該物種的保護和管理提供分子生物學方面的基礎資料.

1 材料與方法

1.1 實驗動物的采集和飼養(yǎng)

在2012～2014年的4～5月份，采用徒手法捕捉的方式從新疆布爾津、內(nèi)蒙古額爾古納和庫都爾等地采集已經(jīng)交配后的雌性胎生蜥蜴，剪指標記后帶回哈爾濱師范大學實驗室內(nèi)室溫條件下( 20～25℃)飼養(yǎng)[10,11].當懷孕的雌性胎生蜥蜴腹部明顯膨大時，將其單獨飼養(yǎng)，直至產(chǎn)下幼體.繁殖結束后，額爾古納種群6只雌體共產(chǎn)仔蜥25只，庫都爾種群6只雌體共產(chǎn)仔蜥24只，布爾津種群6只雌體共產(chǎn)仔蜥18只，總計85只個體.

1.2 DNA提取和PCR擴增

取胎生蜥蜴的尾部肌肉放入無水乙醇中保存并做好標記，確保母本和子代之間能夠相互對應.使用上海生工生物工程有限公司SanPrep柱式動物基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，將稀釋的DNA模板放在-20℃保存.在Genbank上選取11對多態(tài)性較好的微衛(wèi)星引物(見表1)[12-14]，由哈爾濱博仕生物公司合成后進行PCR擴增.PCR反應體系為模板DNA1.0 μL，上下游引物各0.8 μL，10×PCR Buffer2 μL，dNTP1.6 μL，Taq酶0.2 μL，ddH2O13.6 μL.反應條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，最適退火溫度30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)，再72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫.

表1 衛(wèi)星引物反應條件及Genbank登錄號

1.3 PCR產(chǎn)物檢測和染色

使用10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(30%聚丙烯酰胺17 mL，5×TBE 10 mL，10%APS 500 μL，TEMED 50 μL，去離子水定容至50 mL)檢測PCR產(chǎn)物.每個產(chǎn)物上樣7 μL(含1.5 μL Buffer)，在100 V電壓下進行電泳.在電泳結束后，用銀染法進行染色.首先放入固定液中固定15 min，然后在雙蒸水中浸泡3 min，重復3次后放入0.1% AgNO3溶液15 min，再用dd H2O洗脫3次，最后放入顯色液中靜置，當有條帶出現(xiàn)后快速拿出，在蒸餾水中清洗后放入固定液中保存.

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

使用SONY單反照相機DSC-F828對電泳結果拍照記錄，電泳圖片用Gel-pro analyzer 4.5軟件分析，擴增片段的大小與天根生化科技有限公司的DNA Marker pBR322進行比較，將相同遷移距離的條帶看作同一位點，標記為1，沒有出現(xiàn)條帶則標記為0，使用Quantity One軟件分析母本和子代的基因型[15]，并統(tǒng)計等位基因數(shù).應用 Popgene 1.32 軟件計算觀察等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s多樣性指數(shù)和Shannon’s指數(shù)，利用Gervus 3.0軟件計算多態(tài)信息含量.

2 結果

2.1 胎生蜥蜴母本和子代之間等位基因數(shù)的比較

在11個微衛(wèi)星位點中，額爾古納種群中共檢測到70個等位基因，其中母本有53個等位基因，子代有66個等位基因，新增17個等位基因，YW16位點的等位基因最多，母本有8個等位基因，子代有9個等位基因，總體有11個等位基因；庫都爾種群中共檢測到64個等位基因，其中母本有50個等位基因，子代有63個等位基因，新增14個等位基因，YW18位點的等位基因最多，母本有8個等位基因，子代有8個等位基因，總體有9個等位基因；布爾津種群中共檢測到68個等位基因，其中母本有55個等位基因，子代有66個等位基因，新增13個等位基因，YW16位點的等位基因最多，母本有8個等位基因，子代有9個等位基因，總體有9個等位基因(見表2).

表2 胎生蜥蜴不同種群母本與子代的等位基因數(shù)

2.2 胎生蜥蜴母本與子代之間遺傳多樣性的比較

額爾古納、庫都爾和布爾津3個胎生蜥蜴種群子代11個微衛(wèi)星位點的觀察等位基因數(shù)和Shannon’s指數(shù)的平均值均顯著高于母本，額爾古納和庫都爾2個種群子代的有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量和Nei’s多樣性指數(shù)的平均值均顯著高于母本，而布爾津種群子代的有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量和Nei’s多樣性指數(shù)的平均值和母本之間無顯著差異(見表3).

表3 胎生蜥蜴不同種群母本與子代遺傳多樣性分析

3 討論

以往的研究表明，胎生蜥蜴雌性具有多次交配的行為，繁殖期在腹面形成多個交配痕[11,16]，并在子代中表現(xiàn)出多父權現(xiàn)象[17].雌性選擇與多個雄性交配的婚配制度可以使雌性獲得更多高質(zhì)量的配偶，從而提高后代的適合度，使得子代比母本具有更多的遺傳多樣性[2].在本研究中，布爾津種群的平均窩仔數(shù)為3.00±0.89只，額爾古納種群的平均窩仔數(shù)為4.17±1.33只，庫都爾種群的平均窩仔數(shù)為4.00±1.27只，布爾津種群的平均窩仔數(shù)顯著低于其他兩個種群.由此推測，與額爾古納和庫都爾種群相比，布爾津種群子代新增的等位基因數(shù)少，遺傳多樣性也沒有顯著增加，可能與該種群的多父權比例低、窩仔數(shù)少有關.

胎生蜥蜴是所有蜥蜴中分布最廣泛的種類，從西班牙西北部向東橫跨整個歐洲，一直延伸到庫頁島，向北可達北緯73°，向南可達北緯41°.我國是胎生蜥蜴分布的南部邊界，主要分布在新疆、內(nèi)蒙古和黑龍江等地區(qū).作為胎生蜥蜴的邊緣種群，布爾津種群的數(shù)量少、分布范圍小、遺傳多樣性水平低[6,18]，因此，應加大對該種群的研究和保護力度，探討不同種群之間的系統(tǒng)發(fā)育和起源演化關系.

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GeneticDiversityofFemalesandOffspringsBasedonMicrosatelliteMarkinginDifferentPopulationsofZootocaVivipara

Zhao Dan, Liu Yufen, Zhao Wenge, Liu Peng

(Harbin Normal University)

Using microsatellite marking technology, the genetic diversity of 18 females and 67 offsprings in 3 populations of Zootoca vivipara in China were analyzed. The results showed that the number of alleles in Eerguna, Kutul and Buerjin population respectively were 70, 64 and 68. There were most alleles on YW16 and YW18 in the 11 pairs of microsatellite primers. The genetic diversity of offsprings was higher than their female parents in both Eerguna population and Kutul population, while it was not significantly different in Buerjin population. It may be associated with the lower proportion of multiple fatherhood and less litter sizes in Buerjin population, so more researches and protections should be given to the population in the future.

Zootoca vivipara; Microsatellite; Alleles

于達)

Q347

A

1000-5617(2017)04-0050-04

2017-04-22

*黑龍江省自然科學基金項目(C2016035)

**通訊作者：liupeng111111@163.com