張子通 張愛亮 陳啟悅 / 上海市計量測試技術(shù)研究院

常見微生物快速檢測技術(shù)

張子通 張愛亮 陳啟悅 / 上海市計量測試技術(shù)研究院

0 引言

微生物技術(shù)是人類21世紀(jì)三大科技革命之一，其對食品、醫(yī)學(xué)、材料等諸多領(lǐng)域都有著深遠的影響。作為微生物技術(shù)的基礎(chǔ)，微生物檢測技術(shù)的重要性不言而喻。微生物檢測的對象有細胞（細菌、單細胞生物、低等藻類等）及病毒，檢測指標(biāo)包括數(shù)量、類別，較高要求的會涉及細胞的活性狀態(tài)等方面。

涂布法是傳統(tǒng)的微生物檢測方法?，F(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789-2016《食品微生物檢測方法》的主體內(nèi)容就是一系列涂布方法：即在達到潔凈要求的實驗室里對樣品進行溶解稀釋，然后將不同比例稀釋的樣品液涂于相應(yīng)培養(yǎng)基表面，必要時取空白基參照，恒溫（一般是 35～37 ℃）培養(yǎng)一段時間（一般是 1～3 d）后進行菌落計數(shù)，其中計數(shù)可行有效的稀釋樣品用于計算原始樣品的濃度；依所測指標(biāo)，試劑、器材、實驗條件亦會相應(yīng)調(diào)整。GB 4789-2016系列標(biāo)準(zhǔn)于2017年正式生效，代替了GB 4789-2010。雖然冠以“食品”之名，GB 4789-2016總則及其包含的各單獨方法對不同行業(yè)的微生物檢測都具有較高的指導(dǎo)性和代表性。譬如對于更嚴苛的藥品檢測，操作流程類似，但實驗室要求更高，同樣的指標(biāo)培養(yǎng)時間一般會更長（5～7 d）。

隨著經(jīng)濟的發(fā)展，市場對微生物檢測的時效性和精密分析能力提出了較高要求，如：對食藥、生化流水線產(chǎn)品品質(zhì)的即時監(jiān)控；執(zhí)法部門、海關(guān)對樣品執(zhí)法、通關(guān)檢測；高端生化行業(yè)對特定菌種的大批量、高精度檢測。在這些訴求面前，經(jīng)典的涂布法在對實驗室要求高（包括硬件、環(huán)境、種類試劑耗材的采購制備）、對人員專業(yè)性和人數(shù)要求高、樣品培養(yǎng)時間長、無法檢測病毒等方面，其局限性日益顯現(xiàn)，故微生物快速檢測方法和儀器（以下簡稱速測方法、速測儀器）應(yīng)運而生。從21世紀(jì)初開始到現(xiàn)在，不同原理的速測方法都已經(jīng)取得了長足的進步，目前常見的儀器在可靠性、動作機構(gòu)等方面已經(jīng)比較成熟，應(yīng)用的范圍也各自確立了。

新版GB 4789-2016整合了部分快速檢測方法。比如《PCR熒光法檢測諾如病毒》（GB 4789.42-2016，替代了原來只適用于貝類的SN/T 1635-2005《貝類的諾沃克病毒檢測方法》），填補了涂布法無法檢測病毒空白。在許多特定微生物檢測項目中，新標(biāo)準(zhǔn)也使用了PCR方法在涂布后用來確認物種。可以說，我國對微生物的檢測在國家層面上也已經(jīng)順應(yīng)時勢進行了自我完善，PCR方法作為菌種判定和病毒檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法的地位基本確立。

隨著速測方法在各個方面的應(yīng)用越來越廣泛，相關(guān)儀器的計量工作也勢在必行。目前國家尚無對此類儀器的統(tǒng)一的計量校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)，非常重要的一個原因是因為儀器的種類豐富、原理各異、應(yīng)用條件也不同。故本文對常見的速測方法的原理特點、主要應(yīng)用領(lǐng)域進行概括歸納，既可以為未來的計量工作整合信息，同時在開展微生物速測工作時，對方法的選用，也可以提供一些建議和參照。

1 常見微生物快速檢測方法

1.1 快速測試卡（套裝）

快速測試卡（套裝）是對涂布方法通過技術(shù)手段盡可能簡化步驟來達到提速的一種微生物速測方法。這種方法技術(shù)成熟，成本低廉，攜帶方便，非常適合常見指標(biāo)的現(xiàn)場檢測。該方法將實驗室培養(yǎng)基用含有營養(yǎng)物質(zhì)的預(yù)制“取樣-保存-培養(yǎng)”一體化的壓片、紙卡或小型容器替代，取樣涂布同時進行，取樣后的預(yù)制載體或直接用于培養(yǎng)，多無需稀釋，減輕了現(xiàn)場采樣和實驗室檢測的工作量，并且試圖通過改良培養(yǎng)物質(zhì)以求縮短某些指標(biāo)的培養(yǎng)時間，但一般依舊難以短于12 h。

同時，亦有根據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或其他特定需求專用的試紙型器材。這類器材通過色差，可定性表現(xiàn)或粗略定量地表現(xiàn)某些指標(biāo)。其原理與涂布法稍有不同，多是通過特征菌與特定物質(zhì)反應(yīng)顯色而非涂布計數(shù)，但大多依舊無法繞開培養(yǎng)時間長這一瓶頸。其中比較典型的有餐具大腸桿菌專用試紙，其根據(jù)GB 14934-2016《消毒餐(飲）具》所述，在定性分析餐具大腸桿菌存否這一指標(biāo)上和GB 4789.3-2016《大腸桿菌測試方法》等效。

1.2 聚合酶鏈反應(yīng)方法（Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR方法）

PCR方法是一種比較快速的精密微生物檢測方法，其原理是利用DNA在95 ℃時變性成單鏈，低溫60 ℃左右時，引物與單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合，再升溫至72 ℃左右，DNA聚合酶在此最佳活性溫度沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。由于原理上其直接復(fù)制目標(biāo)堿基配對，故可非常準(zhǔn)確地測量某一特定微生物種的數(shù)量。然而其存在假陽性概率較高的問題，原因是已死微生物的DNA鏈也會被檢出，所以排除干擾是實驗設(shè)計中的重要一環(huán)。此法可用于檢測病毒，國標(biāo)中收錄的有GB 4789-2016.42《食品微生物檢測標(biāo)準(zhǔn)熒光法檢測諾如病毒》，還有在禽流感流行時期催生的GB/T19438.1-2004《禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測方法》等。目前GB 4789-2016里所涉及的PCR方法主要為PCR熒光法，即對培養(yǎng)得到的堿基透過熒光物質(zhì)染色然后定量分析的做法。

除了與其他微生物檢測方法類似的注意點以外，由于此方法所涉及的生物反應(yīng)對溫度極度敏感，所以溫控準(zhǔn)確是保障檢測可靠性的必須條件，故多作為實驗室的固定設(shè)備。目前存在用戶通過對溫控系統(tǒng)的校準(zhǔn)來輔助判斷儀器可靠性的做法。

1.3 腺苷三磷酸熒光法（Adenosine Triphosphate Fluorescence，簡稱ATP熒光法）

ATP熒光法的基本原理是通過螢火蟲熒光素酶（簡稱蟲光素酶）催化螢火蟲熒光素（簡稱蟲熒光素）與生命體中常在能量物質(zhì)腺苷三磷酸在有氧狀態(tài)下發(fā)生氧化還原反應(yīng)發(fā)光。當(dāng)蟲光素酶和蟲熒光素在體系中處于過量情況下，發(fā)光強弱取決于ATP 數(shù)量。只要排除非檢測項目因素的ATP，則可以通過發(fā)光強度直接求得目標(biāo)量的數(shù)值。因此ATP法在應(yīng)對復(fù)雜的情況或是用于檢測特定項目時，需要追加前處理，一般較涂布法的培養(yǎng)基或是培養(yǎng)過程調(diào)整來說容易。如伍季等將此技術(shù)用于啤酒菌落總數(shù)的檢測：啤酒中含有其他有機活性物質(zhì)，他們通過追加了減壓過濾富集裝置，降低了啤酒中酶抑制劑和發(fā)光干擾的影響，達到的檢測線可達到10-15ATP，即相當(dāng)于103cfu的菌落。

ATP法檢測速度一般為15～30 min，對現(xiàn)場要求比較低，無需培養(yǎng)，步驟少，誤操作、無效數(shù)據(jù)易被發(fā)覺，設(shè)備也已經(jīng)小型化，較之速測套裝依舊需要等待培養(yǎng)時間以及只能檢測基礎(chǔ)指標(biāo)，可謂優(yōu)勢明顯，而且操作上，“取樣-儀器-讀數(shù)”的用戶體驗也更符合當(dāng)代人操作習(xí)慣，故ATP技術(shù)是目前各技術(shù)中比較有潛力發(fā)展成“傻瓜”型民用或執(zhí)法用便攜產(chǎn)品的速測儀器。

1.4 流式細胞計數(shù)法（Flow Cytometer，簡稱FCM）

流式細胞計數(shù)法是基于細胞直接計數(shù)的一種微生物快速檢測方法，其基本原理是樣品流經(jīng)小孔時，檢測由于細胞存在而改變的環(huán)境參數(shù)，比如電傳導(dǎo)差、光散射、熒光標(biāo)記，進而可以獲得細胞大小、數(shù)量等信息。結(jié)合其他條件，可以進行諸如病菌種類、細胞死活狀態(tài)等精密分析，已經(jīng)成為專業(yè)生物實驗室的重要裝備。流式細胞計數(shù)裝置一般由五大部分組成：液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、信號收集與轉(zhuǎn)換系統(tǒng)、分析系統(tǒng)。經(jīng)過數(shù)年的發(fā)展，該系統(tǒng)已經(jīng)進入到了微生物檢測的各個領(lǐng)域，以熒光標(biāo)記為主要信號采集方式。該檢測方法速度較快，約為15 min，若進行連續(xù)批量操作，單個的平均時間更短。

除了用于精密分析，在批量分析的應(yīng)用中，流式細胞技術(shù)憑借其大批量以及在線處理能力所連帶的總成本下降，也具有一定優(yōu)勢。并且利用其原理上便能判斷細胞死活的特性，是常見速測方法里假陽性概率最低的方法。另外，流式細胞技術(shù)的應(yīng)變能力很強，在已經(jīng)有主體設(shè)備的情況下，如果需要拓展、改變檢測項目，流式細胞儀器往往只需要調(diào)整檢測程序，配合改變相應(yīng)的耗材即可，這使得該儀器實際利用率很高，盡管初期投入較大，不少企業(yè)依舊樂意使用。

1.5 阻抗法

微生物的活動會產(chǎn)生大分子電化學(xué)惰性物質(zhì)與小分子電化學(xué)活性物質(zhì)，可利用其對周遭電化學(xué)性質(zhì)的變化檢測微生物的數(shù)目。目前比較成熟的是阻抗法，即測量體系阻抗變化來推算微生物指標(biāo)。

這種方法原理經(jīng)典成熟，儀器自身廉價，敏感度、可靠性、重復(fù)性都較好。該方法不需要對樣品進行復(fù)雜的前處理，因而在線檢測容易實現(xiàn)。其主要缺點在于其本質(zhì)只是檢測阻抗，而影響阻抗的因素非常多，其中不乏很多非生物性的因素，所以其檢測往往需要在某個固定環(huán)境下，阻抗變化才會和微生物的多少有關(guān)。張愛萍等對牛奶的菌落總數(shù)使用阻抗法進行檢測的試驗中，其檢測對象就是某特定批次的牛奶產(chǎn)品，其實驗結(jié)果充分說明了阻抗法在固定工況下檢測的優(yōu)勢。由于多用于檢測環(huán)境相對固定的諸如生產(chǎn)線監(jiān)測，其計量也必須是現(xiàn)場或是在線的校準(zhǔn)。脫離工況狀態(tài)的校準(zhǔn)只能判斷儀器功能的完整性，對于使用方并無意義。

2 結(jié)語

就本文所介紹的五種常見的微生物速測方法，這些方法各有所長，特點歸納到表1。

表1 常見微生物快速檢測方法歸納

總體來說，目前生物速測方法經(jīng)過十幾年的發(fā)展，各種技術(shù)都日趨成熟，在各自應(yīng)用上的準(zhǔn)確度、可靠性上也都經(jīng)過了實踐檢驗，選擇上以任務(wù)特點導(dǎo)向為主，每個方法互為補充，不存在替代關(guān)系，更多是如同GB 4789-2016一般整合搭配使用，從而做到取長補短以提高總體的檢測質(zhì)量及能力。但對每種儀器的使用方法來說，未來如何尋求一個統(tǒng)一可行的標(biāo)準(zhǔn)來公證地校準(zhǔn)不同速測儀器將會是計量工作的一個主要問題。

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