趙雪淞 王冬旭 劉鑫 石倩倩 史帥

（遼寧工程技術(shù)大學(xué) 遼寧省礦物加工與利用重點實驗室，阜新 123000）

金屬離子對中等嗜熱混合菌活性的影響

趙雪淞 王冬旭 劉鑫 石倩倩 史帥

（遼寧工程技術(shù)大學(xué) 遼寧省礦物加工與利用重點實驗室，阜新 123000）

通過金屬耐受試驗，測定了金屬離子Mo6+、Cu2+、Zn2+對中等嗜熱混合菌（喜溫嗜酸硫桿菌和氧化亞鐵微螺菌共培養(yǎng)體系）活性的影響。結(jié)果表明，隨著金屬離子濃度的提高，細(xì)菌的活性降低，受試菌對上述3種金屬離子的耐受濃度分別為0.6 g/L、10 g/L和30 g/L，3種金屬離子的毒性順序為：Mo6+＞Cu2+＞Zn2+。喜溫嗜酸硫桿菌對金屬離子的耐受能力高于氧化亞鐵微螺菌。結(jié)果說明喜溫嗜酸硫桿菌和氧化亞鐵微螺菌共培養(yǎng)體系具有較強的金屬離子耐受能力，特別是耐受鉬的能力很強，適于含鉬硫化礦、含鉬廢料以及含鉬污泥等的生物浸出。

金屬離子；中等嗜熱菌；喜溫嗜酸硫桿菌；氧化亞鐵微螺菌；活性

鉬因具有耐高溫、不易膨脹和軟化、導(dǎo)熱性好等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于鋼鐵、超合金和不銹鋼生產(chǎn)中［1-2］。盡管我國鉬礦儲量大、類型多，但品位較低，選冶較困難，因而需要探索高效的選冶方法［1，3］。此外，含鉬廢料、含鉬廢催化劑以及含鉬污泥等也需要無害化處理。

生物浸出是利用微生物能夠通過多種途徑將固體物質(zhì)中的有價金屬轉(zhuǎn)化為溶液中的離子來獲取金屬的一種提取技術(shù)。它與傳統(tǒng)工藝相比，具有污染小、成本低、對資源利用率高等優(yōu)點，是處理低品位礦、復(fù)雜礦及環(huán)境污染物的新方法。目前，生物浸出已在銅、金、鈾等金屬硫化礦中得到廣泛應(yīng)用，但鉬礦生物浸出的工業(yè)應(yīng)用尚未成功［4-9］。鉬礦生物浸出率不高的關(guān)鍵問題之一是目前所用菌種對鉬離子的金屬抗性較差［1］。為了篩選對金屬離子、特別是鉬離子抗性較強的菌種，本研究測定了Mo6+、Cu2+和Zn2+對中等嗜熱的喜溫嗜酸硫桿菌（Acidithiobacillus caldus）和氧化亞鐵微螺菌（Leptospirillum ferriphilum）混合菌活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試 劑 ：FeSO4·7H2O、 升 華 硫、K2Cr2O7、Na2MoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O， 均 為分析純；蒸餾水，自制。

儀器：FA2004型電子天平；THZ-98A恒溫振蕩箱；TG16-WS臺式高速離心機；PHS-3E型酸度計；XSZ-4G型光學(xué)雙筒顯微鏡；SW-CG-1A單人凈化工作臺；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

菌株：氧化亞鐵微螺菌與喜溫嗜酸硫桿菌均來自中南大學(xué)生物實驗室。自制無鐵9K液體培養(yǎng)基成分，見表1。

表1 無鐵9K培養(yǎng)基

1.2 方法

取18只三角瓶，分為6組，每組分別加入90 mL含不同濃度金屬離子的無鐵9K培養(yǎng)基（每種濃度重復(fù)3次），調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為2.0，再分別依次加入10 g FeSO4·7H2O、1 g S和10 mL菌種（菌液濃度約為3.0×107個/mL），恒溫振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150 r/min，溫度45℃。每隔24 h測定培養(yǎng)液pH值、Fe2+氧化率和細(xì)菌個數(shù)。實驗重復(fù)2次，取平均值。

pH值測定采用PHS-3E型酸度計；Fe2+氧化速率測定采用重鉻酸鉀滴定法；細(xì)菌計數(shù)采用血球計數(shù)法。

2 結(jié)果

2.1 金屬離子濃度對細(xì)菌生長的影響

2.1.1 鉬離子濃度對細(xì)菌生長的影響 由圖1-A可知，當(dāng)鉬離子濃度為0.2 g/L和0.4 g/L時，細(xì)菌的生長與對照組幾乎一致，細(xì)菌生長整體符合一般微生物生長規(guī)律，即調(diào)整期、對數(shù)期和穩(wěn)定期，說明鉬離子濃度在細(xì)菌可承受范圍之內(nèi)，對細(xì)菌影響不大。當(dāng)鉬離子濃度為0.5 g/L時，細(xì)菌的生長繁殖能力受到一定影響，當(dāng)鉬離子濃度為0.6 g/L時，細(xì)菌的生長繁殖能力受到明顯影響，當(dāng)鉬離子濃度為0.8 g/L和1 g/L時，細(xì)菌幾乎不生長，說明過高的鉬離子濃度對細(xì)菌產(chǎn)生了很大的毒性，抑制了細(xì)菌的生長繁殖。該菌種對鉬離子的耐受濃度為0.6 g/L。

2.1.2 銅離子濃度對細(xì)菌生長的影響 由圖1-B可知，當(dāng)銅離子濃度為10 g/L時，細(xì)菌個數(shù)的增長明顯低于對照，說明此時的銅離子濃度已經(jīng)對細(xì)菌產(chǎn)生了毒性，但毒性較小，細(xì)菌生長仍能保持較高水平；而銅離子濃度大于15 g/L時，細(xì)菌個數(shù)增長緩慢，但是直到銅離子濃度30 g/L時，仍然有少量細(xì)菌繁殖，說明此濃度下銅離子對細(xì)菌產(chǎn)生了很強的毒性，但是不能完全抑制細(xì)菌生長繁殖。氧化亞鐵微螺菌和喜溫嗜酸硫桿菌混合菌對銅離子的耐受濃度為10 g/L。

2.1.3 鋅離子濃度對細(xì)菌生長的影響 由圖1-C可知，在10 g/L、20 g/L鋅離子的濃度下，細(xì)菌個數(shù)與對照幾乎一致，30 g/L的鋅離子濃度影響了細(xì)菌的生長，而在50 g/L的鋅離子濃度下，細(xì)菌幾乎不增長，說明50 g/L的鋅離子濃度對細(xì)菌產(chǎn)生了嚴(yán)重毒性。氧化亞鐵微螺菌和喜溫嗜酸硫桿菌耐受的鋅離子濃度為30 g/L。

2.2 金屬離子濃度對Fe2+氧化率的影響

2.2.1 細(xì)菌氧化Fe2+的能力 為了解氧化亞鐵微螺菌氧化Fe2+的能力，設(shè)置了有菌和無菌的對照試驗，其他條件參數(shù)相同，試驗結(jié)果如圖2所示。在96 h后，有菌組Fe2+的氧化率達(dá)100%，而無菌組Fe2+氧化率僅為20%左右。

2.2.2 鉬離子濃度對Fe2+氧化率的影響 由圖3-A可知，鉬離子濃度為0.2 g/L和0.4 g/L時，F(xiàn)e2+氧化率與對照一致，能夠達(dá)到100%；鉬離子濃度為0.5 g/L時，F(xiàn)e2+的氧化率能夠達(dá)到80%，而鉬離子濃度為0.6 g/L時，F(xiàn)e2+的氧化率達(dá)到56%；大于0.8 g/L鉬離子濃度下的細(xì)菌，F(xiàn)e2+氧化率僅為20%左右，與無菌的自然氧化狀態(tài)下的Fe2+氧化率相似，說明當(dāng)鉬離子濃度為0.2 g/L和0.4 g/L時，細(xì)菌的活性沒有受到影響。當(dāng)鉬離子濃度為0.6 g/L時，鉬離子對細(xì)菌產(chǎn)生了毒性，但毒性較小，細(xì)菌通過調(diào)節(jié)自身的代謝，活性仍能保持一定的水平，當(dāng)鉬離子濃度大于0.8 g/L時，對細(xì)菌有強烈的抑制作用，細(xì)菌活性幾乎喪失，因此，氧化亞鐵微螺菌耐受鉬離子濃度為0.6 g/L。

圖1 金屬離子（A：Mo，B：Cu，C：Zn）濃度對細(xì)菌生長的影響

2.2.3 銅離子濃度對Fe2+氧化率的影響 由圖3-B可知，經(jīng)過1個周期的培養(yǎng)，當(dāng)銅離子濃度為10 g/L時，F(xiàn)e2+的氧化率為63%，而在15 g/L、20 g/L、25 g/L和30 g/L的銅離子濃度下，F(xiàn)e2+的氧化率僅在20%左右，說明大于15 g/L的銅離子濃度抑制了氧化亞鐵微螺菌的活性，使細(xì)菌幾乎失去了氧化Fe2+的能力。氧化亞鐵微螺菌耐受的銅離子濃度為10 g/L。

2.2.4 鋅離子濃度對Fe2+氧化率的影響 由圖3-C可知，在10 g/L和20 g/L的鋅離子濃度下，F(xiàn)e2+氧化率能夠達(dá)到100%；30 g/L的鋅離子濃度對Fe2+氧化率有一定的影響，而40 g/L和50 g/L的鋅離子濃度對細(xì)菌活性產(chǎn)生了強烈的抑制作用，F(xiàn)e2+的氧化率小于30%。受試菌能夠耐受的鋅離子濃度為30 g/L。

圖2 有菌和無菌條件下Fe2+的氧化率

2.3 金屬離子濃度對培養(yǎng)液pH值的影響

喜溫嗜酸硫桿菌能夠?qū)氧化為H2SO4，使培養(yǎng)液pH值下降，所以測定培養(yǎng)液pH值的變化，可以得知金屬離子濃度對喜溫嗜酸硫桿菌活性的影響。2.3.1 鉬離子濃度對培養(yǎng)液pH值的影響 由圖4-A可知，經(jīng)過6 d的培養(yǎng)，0.2 g/L和0.4 g/L的鉬離子濃度對細(xì)菌幾乎沒有影響，與對照相似，培養(yǎng)液pH值降到了pH1.0以下；0.6 g/L的鉬離子濃度條件下，培養(yǎng)液pH值降到了pH1.1，說明受試菌的活性還很高；值得注意的是，在1.0 g/L的鉬離子濃度條件下，培養(yǎng)液pH值仍然降到了pH1.2。2.3.2 銅離子濃度對培養(yǎng)液pH值的影響 由圖4-B可知，在10 g/L和15 g/L的銅離子濃度下，培養(yǎng)114 h后培養(yǎng)液pH值與對照相似，說明10 g/L和15 g/L的銅離子濃度沒有影響喜溫嗜酸硫桿菌的活性；在20 g/L的銅離子濃度下，培養(yǎng)液pH值仍然低于pH1.0；25 g/L和30 g/L銅離子濃度下，培養(yǎng)液pH值明顯高于對照，但是也下降到pH1.2以下。2.3.3 鋅離子濃度對培養(yǎng)液pH值的影響 由圖4-C可知，即使在50 g/L的鋅離子濃度下，培養(yǎng)液pH值也降低到了pH1.0以下。

圖3 金屬離子（A：Mo；B：Cu；C：Zn）濃度對Fe2+氧化率的影響

3 討論

金屬離子能夠使蛋白質(zhì)（如酶）變性，破壞正常的生理活動，導(dǎo)致生命有機體中毒甚至死亡。采用生物技術(shù)處理金屬礦物或回收固體廢物中的重金屬時，隨著生物浸出的進行，浸出液中的金屬離子濃度會不斷升高，微生物的生存壓力越來越大，導(dǎo)致微生物活性下降，甚至失活。所以，篩選金屬離子耐受能力強的菌種是提高生物浸出效率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究中鉬離子濃度范圍選取0-1 g/L，銅離子濃度范圍選取0-30 g/L，鋅離子濃度范圍選取0-50 g/L［1，7，10-13］。本研究所用菌種對鉬離子的耐受濃度為0.6 g/L。吉兆寧等［10］用嗜中溫細(xì)菌浸出以輝鉬礦為主的低品位原生硫化礦發(fā)現(xiàn)：當(dāng)鉬離子濃度為0.15 g/L時，細(xì)菌就幾乎不生長。與前人的研究相比，本研究選用的中等嗜熱菌的耐鉬能力更強，同時對銅、鋅也有很高的耐受性［7-8，10］。

圖4 金屬離子（A：Mo；B：Cu；C：Zn）濃度對培養(yǎng)液pH值的影響

生物浸礦的機理在于細(xì)菌能夠?qū)⒔鲶w系中的Fe2+氧化為Fe3+，將低價硫氧化為高價硫，F(xiàn)e3+和H+具有強氧化作用，對硫化礦物進一步氧化，達(dá)到浸出目標(biāo)金屬的目的，所以細(xì)菌氧化Fe2+的能力和產(chǎn)酸能力能夠反映其浸礦效率。本研究中受試菌種為氧化亞鐵微螺菌和喜溫嗜酸硫桿菌混合菌，其中氧化亞鐵微螺菌能夠?qū)e2+氧化成Fe3+，喜溫嗜酸硫桿菌能夠?qū)⒌蛢r硫氧化為高價硫。在培養(yǎng)96 h后，有菌組Fe2+的氧化率達(dá)100%，而無菌組Fe2+氧化率僅為20%左右，說明氧化亞鐵微螺菌有很強的Fe2+氧化能力。Pradhan等［11］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鉬離子濃度為0.04 g/L時，中溫浸礦菌嗜酸氧化亞鐵硫桿菌的Fe2+氧化活性幾乎被完全抑制，其對鉬離子的耐受濃度小于0.03 g/L。Zamani等［12］從伊朗Sarchesh-meh礦酸性礦坑水分離到的嗜酸氧化亞鐵硫桿菌能耐受0.25 g/L的鉬離子濃度。Olson等［13］的研究結(jié)果表明，在0.097 g/L鉬離子濃度條件下，嗜中溫菌失去了氧化Fe2+的能力。與上述研究相比，本研究選用的中等嗜熱的氧化亞鐵微螺菌在正常鐵離子濃度范圍內(nèi)對金屬鉬的耐受濃度為0.6 g/L，耐受能力更強。此外，在1.0 g/L的鉬離子濃度條件下，培養(yǎng)液pH值仍然降到了pH 1.2；在30 g/L銅離子濃度下，培養(yǎng)液pH值下降到pH1.2以下；在50 g/L的鋅離子濃度下，培養(yǎng)液pH值降低到了pH 1.0以下。上述結(jié)果說明，即使在高濃度金屬離子作用下，喜溫嗜酸硫桿菌也沒有完全失去氧化S的能力。參考圖3的結(jié)果，說明高濃度的金屬離子對氧化亞鐵微螺菌活性有強烈的抑制作用，但是對喜溫嗜酸硫桿菌活性的影響有限，喜溫嗜酸硫桿菌比氧化亞鐵微螺菌能耐受更高的金屬離子濃度。

4 結(jié)論

通過金屬離子耐受試驗，確定Mo6+、Cu2+和Zn2+對中等嗜熱混合菌（喜溫嗜酸硫桿菌和氧化亞鐵微螺菌）的耐受濃度分別為＜0.6 g/L、＜10 g/L和＜30 g/L。喜溫嗜酸硫桿菌對金屬離子的耐受能力高于氧化亞鐵微螺菌。本研究所用混合菌對鉬離子的耐受力達(dá)到0.6 g/L，說明該菌種有很強的鉬抗性，適于含鉬硫化礦、含鉬廢料及含鉬污泥等的生物浸出。

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Effects of Metal Ions on Activities of Mixed Moderately Thermophilic Bacteria

ZHAO Xue-song WANG Dong-xu LIU Xin SHI Qian-qian SHI Shuai
（Liaoning Key laboratory of Mineral Processing，Liaoning Technical University，F(xiàn)uxin 123000）

The effects of metal ions Mo6+，Cu2+，and Zn2+on the activities of mixed moderately thermophilic bacteria such as Leptospirillum ferriphilum and Acidithiobacillus caldus，were tested by the metal tolerance experiment. As results，the activities of mix moderately thermophilic bacteria decreased with increasing concentration of metal ions. The tolerated concentration of bacteria tested for metal ions Mo6+，Cu2+and Zn2+were 0.6 g/L，10 g/L and 30 g/L respectively. The toxicity order of metal ions was in Mo6+＞Cu2+＞Zn2+. A. caldus presented a higher degree of resistance to metal ions than L. ferriphilum. Results in this study demonstrated that L. ferriphilum and A. caldus in co-culture had strong resistance to metal ions，especially to Mo6+，thus it can be applied to the bioleaching for molybdenum sulphide ore，molybdenum waste and molybdenum sludge.

metal ion；moderately thermophilic bacteria；Acidithiobacillus caldus；Leptospirillum ferriphilum；activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0335

2017-04-25

國家自然科學(xué)基金項目（51204091）

趙雪淞，博士，教授，研究方向：生物工程；E-mail：zhaoxs210@163.com

（責(zé)任編輯 李楠）