胡秀彩 楊小平 呂愛軍? 孫敬鋒

（1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 300384）（2.江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 江蘇 徐州 221116）

敵敵畏對斑馬魚急性毒性試驗(yàn)

胡秀彩1楊小平2呂愛軍1?孫敬鋒1

（1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 300384）（2.江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 江蘇 徐州 221116）

為探究農(nóng)藥對斑馬魚的毒性與安全評價(jià)，選用在農(nóng)業(yè)害蟲防治中廣泛使用的有機(jī)磷農(nóng)藥敵敵畏進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，以24～96h半致死濃度（LC50）判斷斑馬魚對敵敵畏的敏感性。結(jié)果表明，敵敵畏24h LC50、48h LC50、72h LC50、96h LC50分別為66.189mg/L、46.647mg/L、35.836mg/L、33.764mg/L，安全質(zhì)量濃度（SC）為6.95mg/L。參照我國化學(xué)物質(zhì)對魚類毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，判定敵敵畏對斑馬魚急性毒性為Ⅲ級，根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》對魚類毒性等級劃分，可判定敵敵畏對斑馬魚為低毒農(nóng)藥。

斑馬魚；敵敵畏；急性毒性；半致死濃度；安全質(zhì)量濃度

斑馬魚（Brachydanio rerio）是最早生活在印度和南亞的一種熱帶魚，目前已經(jīng)成為遺傳學(xué)和毒理學(xué)研究的重要模式生物，其具有發(fā)育快、易于實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)、繁殖量大、周期短、胚胎透明以及易于實(shí)驗(yàn)操作等優(yōu)點(diǎn)。斑馬魚作為一種生態(tài)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ絼?dòng)物，除了具有經(jīng)濟(jì)、觀賞價(jià)值外，目前已成為研究脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育及對外界環(huán)境變化，如紫外線、重金屬鹽類、農(nóng)藥、消毒液、工業(yè)污水、放射性物質(zhì)等的良好的研究材料。近年來，我國農(nóng)業(yè)得到了迅猛的發(fā)展，特別是南方地區(qū)出現(xiàn)了水產(chǎn)養(yǎng)殖與稻田耕作有效結(jié)合的科學(xué)養(yǎng)殖方式（水產(chǎn)養(yǎng)殖與稻田緊密相鄰、稻田-魚塘水相互交錯(cuò)使用），直接向水體施藥或農(nóng)田施用的農(nóng)藥隨地表和地下徑流等途徑進(jìn)入水體等情況，使得化學(xué)農(nóng)藥的大量施用對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，乃至生態(tài)環(huán)境帶來了嚴(yán)重的影響。我國目前農(nóng)藥年產(chǎn)量達(dá)80萬噸，居世界第二位，而敵敵畏因其具有殺蟲譜廣，廉價(jià)易得，對人和高等動(dòng)物低毒等特性，現(xiàn)已成為使用最為廣泛的有機(jī)磷農(nóng)藥之一。

敵敵畏又名DDVP，學(xué)名O,O-二甲基-O-(2,2-二氯乙烯基)磷酸酯，屬于有機(jī)磷農(nóng)藥，具有很高的水溶性，用在農(nóng)業(yè)害蟲和衛(wèi)生害蟲防治上。近年來，隨著水質(zhì)環(huán)境的惡化和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，魚類急性毒性研究備受關(guān)注，但多用鯉魚、金魚、草魚等作為試驗(yàn)對象。斑馬魚急性毒性試驗(yàn)作為檢測工業(yè)污染及水體污染的重要手段之一，目前還未廣泛采用。而在敵敵畏的急性毒性研究中，兩棲類的研究成果較豐富，魚蝦的研究較少，蚯蚓等土壤生物偶有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最普遍使用的農(nóng)藥敵敵畏對斑馬魚進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，獲得了敵敵畏對斑馬魚的基礎(chǔ)毒理學(xué)數(shù)據(jù)，為漁業(yè)生產(chǎn)提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

斑馬魚（平均體長3.9cm，平均體重0.44g）：購于徐州市某花鳥市場；敵敵畏（有效成分含量77.5%，350g劑型乳油）購自湖北沙隆達(dá)股份有限公司，現(xiàn)配現(xiàn)用。試驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)5d以上，試驗(yàn)前一天停止喂食，試驗(yàn)期間也不喂食。試驗(yàn)在容積為1L的玻璃燒杯中進(jìn)行，每組隨機(jī)放10尾魚。試驗(yàn)用水為經(jīng)曝氣48h以上去除余氯后的蒸餾水，試驗(yàn)期間保持充氣。培養(yǎng)箱溫度為25±2℃。光照/黑暗為12h/12h。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性試驗(yàn)

參照呂愛軍等試驗(yàn)方法進(jìn)行，采用靜水法進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。以有效成分含量為77.5%的敵敵畏配制7個(gè)不同濃度的試劑系列，并且設(shè)一個(gè)空白對照，每個(gè)濃度及對照組隨機(jī)放入10尾試驗(yàn)魚。試驗(yàn)開始連續(xù)觀察8h，觀察記錄魚的中毒情況（平衡、游動(dòng)、反應(yīng)、呼吸、體色變化）以及96h內(nèi)的死亡情況及開始死亡時(shí)間和死亡數(shù)目。當(dāng)魚死亡時(shí)，及時(shí)撈出，以免污染水質(zhì)，觀察并記錄其體表特征和內(nèi)臟表面特征。試驗(yàn)時(shí)間為96h，96h后若仍有活魚，繼續(xù)試驗(yàn)至7d。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

采用Bliss法計(jì)算斑馬魚的半致死濃度LC50，安全質(zhì)量濃度SC用公式SC=48h LC50×0.3/（24h LC50/48h LC50）2計(jì)算。死亡率=死亡試驗(yàn)魚數(shù)/試驗(yàn)魚總數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

敵敵畏對斑馬魚急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明：敵敵畏質(zhì)量濃度達(dá)到60 mg/L以上時(shí)，24h內(nèi)試驗(yàn)魚出現(xiàn)死亡，48h內(nèi)全部死亡；敵敵畏的質(zhì)量濃度為80 mg/L時(shí)，2h后個(gè)別魚即出現(xiàn)側(cè)翻，7h后在底掙扎、腹部朝上、嚴(yán)重失衡，12h后完全喪失活動(dòng)能力，張口喘氣，15h開始出現(xiàn)死亡、30h全部死亡，其中15-24h為試驗(yàn)魚集中死亡時(shí)段；敵敵畏質(zhì)量濃度達(dá)到50mg/L以上，試驗(yàn)魚在72h內(nèi)全部死亡。敵敵畏質(zhì)量濃度低于30mg/L時(shí)，7d后仍有存活魚。試驗(yàn)魚7d時(shí)的死亡率相比96h，30mg/L和40mg/L試驗(yàn)魚的死亡率有所提高。當(dāng)敵敵畏質(zhì)量濃度為10mg/L，沒有出現(xiàn)魚死亡，說明此濃度敵敵畏對斑馬魚的毒性作用較小。

2.2 斑馬魚中毒表現(xiàn)及死亡特征

敵敵畏對斑馬魚中毒較慢，斑馬魚剛放入水中時(shí)出現(xiàn)急速躥游現(xiàn)象，但很快消失，稍后魚群安靜地沉于水底。適應(yīng)環(huán)境后，魚較多游動(dòng)，偶有集群現(xiàn)象，既而出現(xiàn)上浮、頂水、尾略下垂、安靜浮于水面現(xiàn)象。隨著中毒程度加深，試驗(yàn)魚出現(xiàn)顫抖、失衡現(xiàn)象，或沉于水底，或側(cè)翻浮于水中部，或弓背、頭朝上、尾朝下立于水中，腹鰭擺動(dòng)不平衡及展開不全，游動(dòng)能力減弱甚至喪失，反應(yīng)遲鈍、呼吸頻率加快、張口喘氣、鰓蓋外掀，最后腮部出血死亡，或側(cè)躺沉于水底，或腹部朝上浮于水面，部分魚死亡時(shí)嘴、胸鰭張開，出現(xiàn)明顯折彎現(xiàn)象，體色加深(見圖1)。高質(zhì)量濃度組試驗(yàn)魚從受試、中毒到死亡的間隔時(shí)間短，中毒現(xiàn)象也更明顯。

表1 敵敵畏對斑馬魚的LC50和SC

圖1 斑馬魚中毒特征：魚腮部出血、胸鰭展開（上）、側(cè)折彎現(xiàn)象（下）

2.3 LC50值及質(zhì)量安全濃度（SC）

經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，敵敵畏的半致死濃度及質(zhì)量安全濃度值見表1。結(jié)果表明，敵敵畏的安全質(zhì)量濃度為6.95mg/L。參照我國化學(xué)物質(zhì)對魚類毒性分級標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21281-2007(96h LC50≤1.0mg/L時(shí)為急性毒性Ⅰ級，1.0mg/L≤96h LC50≤10.0mg/L為急性毒性Ⅱ級，10.0mg/L≤96h LC50≤100.0mg/L為急性毒性Ⅲ級)。敵敵畏的96h LC50為33.764mg/L，由此判定敵敵畏對斑馬魚的急性毒性為Ⅲ級。根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中農(nóng)藥對魚類的毒性等級劃分（劇毒，96h LC50≤0.1mg/L；高毒，96h LC50≤1.0mg/L；中毒，1.0 mg/L＜96h LC50≤10.0mg/L；低毒，96h LC50＞10.0mg/L），可判定敵敵畏對斑馬魚為低毒農(nóng)藥。

3 討論

近年來，針對敵敵畏的急性毒性試驗(yàn)研究，在蛙、蟾蜍等兩棲類報(bào)道較多，在魚、蝦等研究較少。斑馬魚急性毒性試驗(yàn)作為檢測工業(yè)污染及水體污染的重要手段之一，目前鮮有報(bào)道。本研究采用農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最普遍使用的有機(jī)磷農(nóng)藥敵敵畏對斑馬魚進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，以期為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、水產(chǎn)養(yǎng)殖及魚病防治等方面提供一定的參考依據(jù)。在本試驗(yàn)中，敵敵畏對斑馬魚的安全質(zhì)量濃度為6.95 mg/L，與韓慶莉等報(bào)道敵敵畏對鯽魚幼魚48h、72h和96h的LC50分別為45.1 mg/L、30.4mg/L和23.3mg/L，安全質(zhì)量濃度為2.3mg/L，與黃周英等報(bào)道敵敵畏對金魚24h、48h、72h和96h的 LC50分別為39.17mg/L、33.65mg/L、27.10mg/L和25.94mg/L，安全質(zhì)量濃度為2.594 mg/L相差較大，說明不同魚類對藥物的敏感性不同。姚慶禎等通過敵敵畏對南美白對蝦幼蝦的急性致毒研究發(fā)現(xiàn)，敵敵畏對南美白對蝦幼蝦24h、48h、72h和96h的LC50分別為44.0×10ˉ3mg/L、37.8×10ˉ3mg/L、10.0×10ˉ3mg/L和7.6×10ˉ3mg/L，安全質(zhì)量濃度為7.6×10ˉ4mg/L，說明蝦類對環(huán)境變化較敏感，敵敵畏對蝦類的毒性較強(qiáng)。在敵敵畏的急性毒性研究成果較豐富的兩棲類領(lǐng)域，何海艷等采用常規(guī)方法研究了敵敵畏對云南小狹口蛙蝌蚪的急性毒性影響，結(jié)果表明敵敵畏對小狹口蛙蝌蚪24h、48h、72h和96h的LC50分別為114.82mg/L、102.33mg/L、81.28mg/L和51.29mg/L。耿寶榮等指出敵敵畏對黑眶蟾蜍蝌蚪96h的LC50為51.61mg/L。以上數(shù)據(jù)表明敵敵畏對兩棲類的毒性相比較斑馬魚要低一些，但王健鑫等則報(bào)道敵敵畏對中國林蛙蝌蚪的安全質(zhì)量濃度為1.86 mg/L。耿寶榮等對沼蛙蝌蚪進(jìn)行了敵敵畏的急性毒性試驗(yàn)，表明敵敵畏對沼蛙蝌蚪24h、48h、72h和96h的LC50分別為9.104mg/L、8.064mg/L、6.304mg/L和5.680mg/L。薛清清等通過敵敵畏的急性毒性試驗(yàn)測得敵敵畏對紋飾姬蛙蝌蚪24h和48h的LC50為3.91mg/L和1.97mg/L，安全質(zhì)量濃度為0.15mg/L。以上數(shù)據(jù)中，敵敵畏對兩棲類的毒性又明顯高于斑馬魚，以此說明兩棲類中不同品種的蛙類對敵敵畏的耐受性存在著顯著的差異。另外，胡霞等在敵敵畏的急性毒性研究中，涉及到了對蚯蚓的毒性，結(jié)果顯示，用濾紙接觸法測得敵敵畏對蚯蚓的LD50為0.14g/L，自然土壤法測得敵敵畏對蚯蚓的LD50為1.11g/L。

有機(jī)磷農(nóng)藥主要通過干擾生物神經(jīng)系統(tǒng)功能對水生生物產(chǎn)生毒害作用。敵敵畏屬神經(jīng)毒劑，其作用機(jī)制是通過它與掌管神經(jīng)正常沖動(dòng)傳遞的膽堿酯酶結(jié)合，將膽堿酯酶的活力點(diǎn)磷酸化，使膽堿酯酶活力受抑，失去水解乙酰膽堿的能力，從而使動(dòng)物神經(jīng)傳導(dǎo)失常，中毒死亡。本實(shí)驗(yàn)中敵敵畏暴露組斑馬魚表現(xiàn)出的急躁不安等癥狀是神經(jīng)系統(tǒng)中毒的表現(xiàn)。楊先樂等出水生動(dòng)物處于低濃度的有機(jī)磷中也會(huì)發(fā)生慢性中毒，臨床主要表現(xiàn)為水生動(dòng)物普遍表現(xiàn)為食欲減退，呼吸困難，食物轉(zhuǎn)化率下降，隨著新陳代謝水平的降低，生長減緩，甚至停止；有機(jī)磷農(nóng)藥能引起孵化率下降，對胚胎有致畸作用，可使幼體形體彎曲，身體瘦弱，眼睛色素沉淀，失去平衡，行為反常，身體上長出水泡，心包囊擴(kuò)大，血液循環(huán)受阻；有機(jī)磷能抑制各組織中的膽堿酯酶活性，也可引起血紅素水平下降，紅細(xì)胞數(shù)量下降，紅細(xì)胞比容降低，血漿脂類總蛋白和碳?xì)浠衔锖拷档?；?dāng)有機(jī)磷農(nóng)藥被攝人后，對肝臟、胰臟、鰓、腸、肌肉等實(shí)質(zhì)性臟器存在毒性效應(yīng)；嚴(yán)重時(shí)使這些組織的細(xì)胞壞死、破裂，致使其中的RNA和DNA含量降低；在生物體內(nèi)的累積效應(yīng)。此外，各種環(huán)境的理化因素，魚類的種類、大小、生長條件以及它們的適應(yīng)能力，水體的硬度、pH值、鹽度、有機(jī)物、懸浮物、水溫、溶解氧等都會(huì)對魚的死亡率產(chǎn)生影響，這些條件的稍微變化，都會(huì)對魚病防治效果產(chǎn)生影響。斑馬魚對環(huán)境的變化比較敏感，故以斑馬魚為試驗(yàn)對象測出的安全質(zhì)量濃度數(shù)據(jù)在漁業(yè)生產(chǎn)中比較保守，可以放心參考。

本研究結(jié)果表明敵敵畏對斑馬魚的急性毒性為Ⅲ級，對斑馬魚的毒性等級為低毒。敵敵畏的安全質(zhì)量濃度為6.95 mg/L，是漁業(yè)生產(chǎn)中常用質(zhì)量濃度的7-17倍，因而敵敵畏對斑馬魚的毒性較小，提示是斑馬魚的安全藥物用。

（略）

天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(16JCZDJC33500，15JCZDJC34000)；國家自然科學(xué)基金(31272692)；天津市水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（ITTFRS2017009）

胡秀彩，1976年生，女，江蘇徐州人，實(shí)驗(yàn)師，主要從事水產(chǎn)微生物學(xué)研究，E-mail:huxiucai@126.com。

呂愛軍，教授，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物疾病與防治方面研究，E-mail:lajand@126.com