劉春菊+王彩霞+張玉芹+杜傳印+梁子敬+于金鳳

摘要：采用以Ca3（PO4）2作為唯一磷源的無機(jī)磷固體培養(yǎng)基對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的青霉菌株進(jìn)行解磷作用初篩，并以Ca3（PO4）2作為磷源的液體培養(yǎng)基對(duì)初篩菌株的解磷能力進(jìn)行定量測(cè)定分析，然后對(duì)篩選出的高效解磷青霉菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。定量分析結(jié)果表明，初篩青霉菌株中QM-10解磷能力最強(qiáng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，液體培養(yǎng)基中可溶性磷含量先增加后降低并趨于穩(wěn)定，振蕩培養(yǎng)96 h后，培養(yǎng)液可溶性磷含量最高，為1 386.93 mg/L；培養(yǎng)過程中pH值先降低后趨于穩(wěn)定，對(duì)應(yīng)最小pH值為2.09。形態(tài)學(xué)和分子鑒定結(jié)果表明，QM-10為草酸青霉（Penicillium oxalicum）。

關(guān)鍵詞：高效解磷青霉菌株；解磷能力；可溶性磷含量；鑒定

中圖分類號(hào)：S154.38文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2017）12-0050-04

Abstract Using the medium with Ca3（PO4）2 as the sole phosphorus source to screen the phosphate solubilizing ability isolates of Penicillium strains which were stored in laboratory. In order to obtain the strains with the highest phosphate-solubilizing capacity， the first selected Penicillium strains were individually inoculated into the liquid medium containing Ca3（PO4）2 as the sole phosphorus source to quantitatively analyze their phosphate solubilizing ability. The results showed that the QM-10 strain had the highest ability of phosphorus solution. With the increase of incubation time， the soluble phosphorus content increased firstly， then decreased and finally tended to stabilize. After 96 hours of concussion culture， the soluble phosphorus content in the culture solution of QM-10 was the highest as 1 386.93 mg/L.The pH value of its culture solution first decreased and then tended to be stable，corresponding to the minimum value as 2.29. The morphological and molecular identification confirmed that QM-10 strain belonged to Penicillium oxalicum.

Keywords Phosphate-solubilizing Penicillium strains；Phosphate-solubilizing capability； Soluble phosphorus content； Identification

磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的礦質(zhì)元素之一，對(duì)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和新陳代謝具有重要作用[1]。為提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，農(nóng)民每年向土壤中施入大量磷肥。但由于土壤礦物質(zhì)對(duì)磷元素具有很強(qiáng)的吸附和固定作用，大部分磷與土壤中的Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+結(jié)合形成溶解性較差難以被植物吸收利用的磷酸鹽[2]，導(dǎo)致施入磷肥的當(dāng)季作物利用率僅為5%～25%。因此，如何有效提高磷肥的利用效率，是目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中亟待解決的問題。

土壤中存在著細(xì)菌、真菌和放線菌等多種解磷微生物，它們通過自身的生命活動(dòng)，將土壤中不溶性磷轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄粤?，一方面供植物生長(zhǎng)發(fā)育需要，另一方面提高植物對(duì)施入土壤的磷肥利用效率。目前，國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的解磷微生物中，解磷細(xì)菌的種類、數(shù)量較多，但研究表明真菌的解磷能力比細(xì)菌要強(qiáng)幾倍或10倍以上[3]。1952年Johnson首次探索了真菌解磷效果，并且報(bào)道Aspergillus niger具有較強(qiáng)的解磷能力[4]。目前報(bào)道的解磷真菌主要有青霉（Penicillium）、曲霉（Aspergillus）、根霉（Rhizopus）、鐮孢菌（Fusarium）等，其中研究較多的是黑曲霉（Aspergillus niger）和青霉（Penicillium）[5]。Acevedo報(bào)道了兩株高效解磷真菌（Aspergillus和Penicillium）的解磷能力分別能達(dá)到82%和80%[6]。

本試驗(yàn)使用無機(jī)磷培養(yǎng)基對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的180株青霉菌進(jìn)行解磷能力初篩，再用無機(jī)磷液體培養(yǎng)基對(duì)初篩菌株進(jìn)行培養(yǎng)并測(cè)定菌液的可溶性磷含量、pH值，從中選擇解磷效果較好青霉菌株，并對(duì)這個(gè)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定，為今后研究和開發(fā)相應(yīng)的微生物菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株：實(shí)驗(yàn)室保存的180株青霉菌，分離自山東濰坊煙株根際土壤和山東棲霞、蓬萊、昌邑，遼寧大連、金州、秦皇島，河北滄州等渤海灣果園土壤；其中QM-10分離自山東蓬萊地區(qū)的果樹根際土壤。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，用于青霉菌株的培養(yǎng)；以Ca3（PO4）2作為唯一磷源的無機(jī)磷固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基，用于供試菌株解磷能力定性及定量測(cè)定[7]。endprint

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 解磷青霉的初篩 取活化后青霉菌株接種于無機(jī)磷固體培養(yǎng)基上， 28℃恒溫培養(yǎng)7 d，測(cè)定菌落直徑（d）、解磷圈直徑（D），重復(fù)3次。根據(jù)解磷圈直徑與菌落直徑比值（D/d）初步確定各菌株解磷能力[8]。

1.2.2 解磷能力定量測(cè)定 按照魏景超[10]研究方法制作磷標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程，計(jì)算菌株的解磷量。將初篩具有一定解磷能力的青霉菌株孢子分別刮入無菌水中，于28℃、160 r/min條件下，搖床振蕩培養(yǎng)30 min，使孢子充分散開，制備成菌懸液，用移液槍吸取孢子懸浮液置于血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，最終得到濃度為108 cfu/mL的孢子懸浮液。按1%接種量將孢子懸浮液接種于100 mL無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，分別在0、24、48、72、96、120、144、168 h取上清液，按照鉬銻抗比色法[9]測(cè)定可溶性磷含量，采用pH計(jì)（賽多利斯pH計(jì)，PB-10）測(cè)定pH值。

1.2.3 菌株鑒定 形態(tài)特征觀察測(cè)定參照《真菌鑒定手冊(cè)》[10] 和《中國(guó)真菌志（第三十五卷）》 [11]青霉屬及其相關(guān)屬的鑒定方法進(jìn)行；分子生物學(xué)鑒定按照參考文獻(xiàn)[12]中的方法進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效解磷青霉菌株的初篩

根據(jù)解磷圈直徑與菌落直徑比值（D/d）的大小，初步篩選到6株具有解磷效果的菌株（詳見表1），其中QM-10、QM-6、QM-4-1解磷效果較好，D/d分別為1.47、1.33和1.27。

2.2 高效解磷青霉菌株的復(fù)篩

由表2可見，青霉菌株QM-10對(duì)Ca3（PO4）2的溶解效果最好，其對(duì)應(yīng)的最大可溶性磷含量為1 386.93 mg/L，此時(shí)對(duì)應(yīng)的pH值為2.09。

2.3 高效解磷青霉菌株的解磷能力定量測(cè)定

菌株QM-10在液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)（圖1），隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液中可溶性磷含量先增加后降低并趨于穩(wěn)定，培養(yǎng)0～24 h時(shí)變化不是很明顯，培養(yǎng)至24～96 h時(shí)可溶性磷含量急劇增加，且在96 h時(shí)達(dá)到最大值；培養(yǎng)基初始pH為6.9，在培養(yǎng)過程中，pH值均有所降低，后趨于穩(wěn)定。可見pH值大小與菌株最大可溶磷含量基本呈反比，即可溶性磷含量越高，對(duì)應(yīng)的pH值越小。

2.4 高效解磷青霉菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

菌株QM-10在PDA培養(yǎng)基上菌落平坦，質(zhì)地絨狀，菌落正面墨綠色，反面淡黃色（培養(yǎng)168 h），邊緣厚密（圖2）。分生孢子易脫落，產(chǎn)生大量分生孢子。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，菌落表面孢子堆積成殼狀，有滲出液出現(xiàn)。

顯微鏡觀察結(jié)果顯示，該菌株具有青霉屬典型的帚狀枝（圖3B），分生孢子梗通常雙輪，偶有三輪或單輪，梗基彼此較緊貼；瓶梗每輪5 ～ 8 個(gè)或更多；分生孢子形態(tài)近圓柱狀，梗頸通常明顯，壁平滑。這些形態(tài)特征與草酸青霉（Penicillium oxalicum）的描述性狀相符合。

2.5 高效解磷青霉菌株的分子鑒定

以 ITS1 和 ITS4 為引物，對(duì)菌株QM-10的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到500～750 bp左右條帶（圖4）。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中已提交序列比對(duì)、進(jìn)行同源性分析，利用軟件MEGA 5.0，以部分Penicillium sp. 菌株為基礎(chǔ)構(gòu)建5.8S rDNA基因進(jìn)化樹（圖5），發(fā)現(xiàn)菌株與草酸青霉菌株NJDL-03（KT354504.1）的相似性為 100%。

根據(jù)以上分生孢子特征，參照《真菌鑒定手冊(cè)》[10]和《中國(guó)真菌志（第三十五卷）》[11]青霉屬及其相關(guān)有性屬，確定菌株QM-10為草酸青霉（Penicillium oxalicum）。

3 討論與結(jié)論

平板解磷圈法和液體培養(yǎng)法是研究微生物解磷能力最常用的兩種方法，本研究利用這兩種方法篩選到一株高效解青霉菌株 QM-10，結(jié)合菌體形態(tài)特征、ITS序列分析等研究方法，最終將菌株QM-10 的分類地位明確為草酸青霉（Penicillium oxalicum）。

關(guān)于微生物解磷能力與培養(yǎng)介質(zhì)pH值之間的關(guān)系，有人認(rèn)為培養(yǎng)基的pH值與解磷量的相關(guān)性不明顯[13]，也有人認(rèn)為培養(yǎng)基中pH值與解磷微生物的解磷能力具有很明顯的相關(guān)性[14，15]，即培養(yǎng)介質(zhì)的pH值越低，培養(yǎng)液中的可溶性磷量越大，表明培養(yǎng)介質(zhì)的酸度對(duì)溶磷量有很大影響。本研究中，菌株QM-10上清液的 pH值與可溶性磷含量存在一定負(fù)相關(guān)性，基本是可溶性磷含量越高，對(duì)應(yīng)的pH值越小，與Vassilev等[14]的研究結(jié)果相似。

分泌有機(jī)酸，使pH 值降低，溶解難溶性磷，增加可溶性磷含量，是微生物解磷的重要機(jī)制之一。結(jié)合微生物解磷機(jī)理分析，可能是在培養(yǎng)過程中菌株QM-10產(chǎn)生有機(jī)酸與復(fù)合磷酸鹽中的鈣結(jié)合形成穩(wěn)定的可溶性復(fù)合物，進(jìn)一步溶解土壤中的難溶性磷酸鹽。但在培養(yǎng)過程中可溶性磷含量會(huì)在某一時(shí)刻達(dá)到最大值，卻不會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而一直增加，可能因?yàn)椋孩倥囵B(yǎng)基中已有的可溶性磷含量會(huì)抑制對(duì)磷酸鈣的進(jìn)一步溶解；②碳源的消耗會(huì)限制有機(jī)酸的產(chǎn)生及青霉的活動(dòng)[16]。

參 考 文 獻(xiàn)：

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