楊發(fā)斌+劉華+邱念偉+王鳳德+高建偉

摘要：大白菜是我國栽培面積最廣、產(chǎn)量最高的蔬菜作物之一。大白菜性喜冷涼，高溫條件下不結球或者結球松散，因而高溫嚴重影響大白菜的產(chǎn)量和商品性。近年來，人們對大白菜耐熱的生理生化以及分子生物學機制進行了大量研究，發(fā)現(xiàn)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的大量積累、穩(wěn)定的細胞膜結構以及完整的保護酶系統(tǒng)是大白菜適應高溫脅迫的重要生理條件；熱激轉錄因子（HSFs）、熱激蛋白（HSPs）以及小RNAs等則在大白菜耐熱的分子層面扮演著重要角色。此外，科研人員在對大白菜耐熱分子標記的開發(fā)等方面也開展了大量研究并取得了較大進展，這為下一步大白菜耐熱性分子標記輔助選擇育種奠定了基礎。本文對上述研究進行了系統(tǒng)的綜述，以期為今后耐熱大白菜新品種的培育提供科學依據(jù)。

關鍵詞：大白菜；熱脅迫；耐熱機制；分子標記

中圖分類號：S634.1文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）12-0149-05

Abstract Chinese cabbage is one of the most widely cultivated vegetable crops with the highest yield in China. Chinese cabbage likes cool climate， so it can not form leaf head or only form loose leaf head at high temperature， which seriously influences its yield and commodity characteristics. In recent years， people have conducted many researches on the physiological， biochemical and molecular biological mechanisms of heat tolerance in Chinese cabbage. The results showed that accumulation of osmotic， maintaining stability of cell membrane structure and completely protective enzyme system played very important roles for Chinese cabbage to adapt to heat stress. Heat shock transcription factors （HSFs）， heat shock proteins （HSPs） and small RNAs in Chinese cabbage played important roles for response to heat tolerance at molecular level. In addition， researchers have carried out many studies on developing heat-tolerant molecular markers of Chinese cabbage and achieved great progresses， which laid foundations for its molecular marker assisted breeding in heat resistance. In this paper， we summarized the above researches so as to provide scientific bases for breeding new varieties of heat-resistant Chinese cabbage.

Keywords Chinese cabbage； Heat stress； Mechanism of heat tolerance； Molecular markers

大白菜起源于我國，常年種植面積2×106 hm2左右，總產(chǎn)約1億噸，是種植面積最大、產(chǎn)量最高的蔬菜作物之一。大白菜性喜冷涼，我國北方地區(qū)主要在秋季種植，南方地區(qū)則多種植在冷涼的高山地帶。近年來，隨著人們生活水平的提高及飲食結構的多樣化，人們對夏白菜的需求量越來越大。為了滿足市場需求，人們采取各種栽培方式在炎熱的夏季種植大白菜，而夏季大白菜種植的關鍵在于耐熱品種的培育。目前，國內(nèi)外科學家已培育出多個耐熱大白菜品種，并對其耐熱的生理生化機制以及分子生物學機制進行了大量研究。本文對近年來關于大白菜耐熱機制的研究進行綜述，以期為下一步耐熱大白菜新品種的培育提供科學依據(jù)。

1 大白菜耐熱生理生化機制

1.1 滲透調(diào)節(jié)與大白菜耐熱性

細胞脫水是高溫導致大白菜受傷害的重要原因[1，2]。葉陳亮等研究了高溫脅迫下不同耐熱性大白菜品種在水分保持方面的差異，發(fā)現(xiàn)耐熱品種葉細胞較不耐熱品種具有更高的持水力，其束縛水的含量遠高于不耐熱品種[3]。此外，耐熱性不同的大白菜品種間蒸騰速率也存在顯著差異，高溫逆境下大白菜蒸騰速率提高的比率與品種的耐熱性呈反比，也就是說耐熱品種在高溫下失水較慢[3]。

滲透調(diào)節(jié)能力高低是影響大白菜耐熱性的重要因素。在高溫脅迫下，大白菜體內(nèi)會積累大量滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來提高耐熱性。脯氨酸是一種小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物細胞適應熱脅迫過程中扮演重要角色[4-6]。葉陳亮等的研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下大白菜體內(nèi)脯氨酸含量會大量增加，并且耐熱品種比不耐熱品種具有更大增幅[7-9]。李曉峰等[29]對夏季高溫條件下不同品種大白菜在不同發(fā)育期的脯氨酸含量進行了研究，發(fā)現(xiàn)幼苗期脯氨酸含量顯著高于其他生長階段，這與該時期大白菜對熱脅迫反應最靈敏相對應；同時該研究也發(fā)現(xiàn)大部分耐熱品種的脯氨酸含量在幼苗期顯著高于熱敏感品種。除了脯氨酸，可溶性蛋白也是非常常見和有效的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量高低直接與植物耐熱性相關[10]。研究發(fā)現(xiàn)，耐熱大白菜品種在高溫下可保持較高的蛋白質(zhì)合成速率和較低的蛋白質(zhì)降解速率[7]。

1.2 細胞膜熱穩(wěn)定性與大白菜耐熱性

高溫脅迫會導致細胞膜的結構和功能發(fā)生改變，并且還會改變水、離子、有機溶質(zhì)等的跨膜運輸[11，12]。大白菜葉片受高溫脅迫后，細胞膜通透性增加，胞質(zhì)外滲量上升，組織浸出液中電解質(zhì)濃度隨之增高，電導率升高[13-16]。因此，細胞質(zhì)膜熱穩(wěn)定性是反映大白菜耐熱性的一個重要指標[17]。例如，羅少波等研究發(fā)現(xiàn)， 耐熱性與植株電導率呈明顯負相關[18]；吳國勝等研究也發(fā)現(xiàn)，不同耐熱性大白菜品種葉片細胞膜熱穩(wěn)定性與其耐熱性呈正相關[19，20]；而司家鋼等的研究則認為，將電導率和高溫脅迫后的半致死時間相結合可以更好地反映品種間的耐熱性差異[21]。

1.3 保護酶系統(tǒng)與大白菜耐熱性

高溫脅迫條件下，植物體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等會清除一些由高溫產(chǎn)生的活性氧（ROS）[22，23]，減少高溫對細胞膜的傷害[24]，進而提高植物耐熱性[25-28]。葉陳亮等研究發(fā)現(xiàn)高溫脅迫下，大白菜耐熱品種對氧負離子、H2O2的清除力增強， 其中耐熱品種對H2O2的清除活力顯著增強，增幅幾乎是不耐熱品種的3倍，表明耐熱品種較不耐熱品種的SOD、CAT活性有所提高[7]。而POD活性在大白菜生長發(fā)育期表現(xiàn)出逐漸升高趨勢，不耐熱品種POD活性在不同發(fā)育期低于大部分耐熱性品種，在蓮座期和結球期差異更顯著[29]。

2 大白菜耐熱分子機制

2.1 熱激轉錄因子（HSF）與大白菜耐熱性

熱激轉錄因子（heat shock transcription factor， HSF）是存在于細胞內(nèi)、在熱脅迫下可以激活熱激基因表達的一類轉錄調(diào)節(jié)基因[30]，在植物熱脅迫信號轉導和耐熱性的產(chǎn)生過程中起著不可替代的作用[31]。

近年來，已有多個課題組對大白菜HSF基因進行了系統(tǒng)分析。其中大部分研究人員認為大白菜中存在30個HSF成員[32-34]，但Song等[30]研究則認為大白菜中存在35個HSF成員。通過比較發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)上述差異的主要原因在于他們對某些HSF基因的認定標準存在一定差別。例如，Bra012828在Song等[30]的研究中被認定是HSF基因，而其他人的研究則認為該基因不具備完整的HSF結構域，所以被排除出HSF基因家族。但無論如何，他們對其中30個HSF基因的認定是一致的，也就說大白菜中至少存在30個HSF基因家族成員。

基因表達模式通常與其生物學功能相關聯(lián)。Song等[30]以非耐熱性大白菜（Chiifu-401-42）為材料，利用熒光實時定量PCR（qRT-PCR）方法對大白菜HSF家族基因的表達模式進行分析發(fā)現(xiàn)，其中23個HSF基因在38℃熱處理1 h后出現(xiàn)明顯上調(diào)。由此可見HSF基因在大白菜耐熱性方面具有十分重要的作用。

2.2 熱激蛋白（HSP）與大白菜耐熱性

HSPs是植物體在熱激條件下形成的高度有序的結構復合體，具有高度熱穩(wěn)定性，不受高鹽濃度和去垢劑影響，與植物耐熱性密切相關[35，36]。植物在熱脅迫后會瞬時合成新的或功能增強的HSPs從而提高植株耐熱性[37，38]。

在真核細胞中由熱激基因所編碼的熱激蛋白在結構上可分為6個家族：Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60、小分子量熱激蛋白（small Hsps， sHsps） 以及泛素蛋白[39]。在高溫脅迫條件下，耐熱能力不同的大白菜品種間不同類型HSP蛋白表達存在差異。Lee等以耐熱大白菜Kenshin和不耐熱大白菜Chiifu為材料進行研究，發(fā)現(xiàn)BrHSP70等基因在兩種大白菜體內(nèi)的表達均很高；而BrHSP90.2、cpHSP70-1和BrHSP60-2在Kenshin體內(nèi)極易受熱誘導高效表達，但在Chiifu內(nèi)表達量卻很低；還有一些HSP蛋白只在特定的組織或者白菜品種內(nèi)表達，如葉綠體特有的HSP蛋白基因BrHSP101只在Kenshin體內(nèi)表達，而類BrHSP101蛋白基因則在Chiifu內(nèi)表達等，這些HSP蛋白表達的差異性賦予大白菜品種不同耐熱性，在大白菜抗熱過程中扮演著重要角色[40]。

2.3 microRNA、csRNA與大白菜耐熱性

除了HSF、HSP等在大白菜耐熱方面具有重要作用，一些非編碼的小RNAs在大白菜響應熱脅迫的過程中也扮演著非常重要的角色[41]。沈慧[42]研究發(fā)現(xiàn)，大白菜在46℃熱激1 h后， microRNA398的表達量顯著下調(diào)，與之相反miR398靶基因BraCSD1的表達在熱激后則顯著上調(diào)；進一步將大白菜CSD1基因在擬南芥中過量表達，可以明顯提高擬南芥對外源和內(nèi)源氧化脅迫的抗性并提高其耐熱性。上述結果表明，miR398及其靶基因可以通過調(diào)節(jié)對氧化脅迫的響應來影響植株對高溫脅迫的抗性[42]。

Wang等[43]從大白菜葉綠體基因組中分離出了響應高溫脅迫的小RNAs，并分析了其與大白菜耐熱性的關系，發(fā)現(xiàn)許多由葉綠體產(chǎn)生的csRNA家族成員對高溫極其敏感，其中一些csRNAs可通過沉默靶基因的方式達到響應熱脅迫的目的。csR-mYCF-8和csR-mATP-2都是大白菜csRNAs家族中的成員，高溫會使兩者的表達量降低，但卻使其靶基因ycf1、atpE的表達量急劇上升，這些基因在大白菜抵抗逆境脅迫方面均具有重要作用。

3 大白菜耐熱分子標記開發(fā)

對大白菜耐熱遺傳標記在雜交后代的分離類型進行分析是了解這些標記以及與它們緊密連鎖的其他基因所控制遺傳性的主要途徑[44]。

鄭曉鷹等采用單粒傳的方法從大白菜耐熱品種和熱敏感品種雜交后代獲得遺傳性穩(wěn)定的重組近交系群體，以此為材料用同工酶、RAPD和AFLP分子標記技術鑒定了與大白菜耐熱性數(shù)量性狀相關的遺傳標記，發(fā)現(xiàn)了9個與耐熱性QTL緊密連鎖的分子標記：包括5個AFLP標記、3個RAPD標記和1個PGM 同工酶標記，這些標記對耐熱性遺傳的貢獻率為46.7%。9個標記中有5個分布在同一連鎖群上，其他4個標記與任何一個標記無連鎖關系，表明上述9個標記分布在大白菜的5個連鎖群上[45]。

于拴倉等應用352個標記位點的大白菜AFLP和RAPD圖譜，采用復合區(qū)間作圖方法對控制大白菜耐熱性的數(shù)量性狀基因位點（QTL）進行定位和遺傳效應研究。用苗期熱害指數(shù)進行耐熱性表型鑒定，共檢測到5個耐熱性QTL位點，分布于3個連鎖群上。其中，QTL位點ht-1、ht-3和ht-5表現(xiàn)為增效加性效應，ht-2和ht-4表現(xiàn)為減效加性效應。ht-2對大白菜耐熱性的遺傳貢獻率最大，其次是ht-5。還發(fā)現(xiàn)了與5個QTLs緊密連鎖的側連分子標記，它們與QTL間的距離為0.1～2.4 cM[46]。這為大白菜耐熱性分子標記輔助選擇提供了理論基礎。

4 結語

大白菜是深受國人喜愛的一種蔬菜，在蔬菜消費市場上占有極大份額。雖然科研工作者對夏季耐熱大白菜品種的培育已進行大量研究，但仍存在諸多問題。例如，耐熱大白菜通常個體較小，基因范圍狹窄，雜交后產(chǎn)量優(yōu)勢小等。因此，深入了解大白菜耐熱機制將會幫助我們從根本上解決大白菜耐熱的難題。目前，關于大白菜耐熱的生理生化機制研究較為深入，分子機制方面也取得了較大進展，但是如何將我們所掌握的知識應用到大白菜耐熱育種實踐中則是我們未來需要解決的關鍵問題。

參 考 文 獻：

[1] 劉祖祺， 張石城. 植物抗性生理學[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社， 1994： 199-215.

[2] 高麗紅. 白菜、生菜高溫傷害機理及其越夏栽培技術的研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學， 1994.

[3] 葉陳亮， 柯玉琴， 陳偉. 大白菜耐熱性的生理研究Ⅱ.葉片水分和蛋白質(zhì)代謝與耐熱性[J]. 福建農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版）， 1996， 25（4）：490-493.

[4] Verbruggen N， Hermans C. Proline accumulation in plants： a review[J]. Amino Acids， 2008， 35 （4）： 753-759.

[5] 曲復寧， 王云山， 張敏， 等. 高溫脅迫對仙客來根系活力和葉片生化指標的影響[J].華北農(nóng)學報， 2002， 17（1）： 127-131.

[6] 張慶峰， 徐勝， 李建龍. 高溫脅迫下高羊茅生理生化特性研究[J] . 草業(yè)科學， 2006， 23（4）： 26-28.

[7] 葉陳亮， 柯玉琴， 陳偉. 大白菜耐熱性的生理研究Ⅲ. 酶性和非酶性活性氧清除能力與耐熱性[J]. 福建農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），1997，26 （4）：498-501.

[8] 耶興元， 馬鋒旺， 王順才， 等. 高溫脅迫對獼猴桃幼苗葉片某些生理效應的影響[J]. 西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2004，32（12）： 33-37.

[9] 劉應迪， 李和平， 肖冬林. 高溫脅迫下蘚類植物游離脯氨酸含量的變化[J] . 吉首大學學報（自然科學版），2001， 22（1）：1-3.

[10]王志和，于麗艷，曹德航，等.短期高溫處理對大白菜幾個生理指標的影響[J].西北農(nóng)業(yè)學報，2005，14（3）：82-85.

[11]陸世鈞， 喬炳根. 早熟大白菜耐熱性與EC值關系初探[J]. 上海蔬菜， 1990（2）： 25.

[12]Franklin K A. Light and temperature signal crosstalk in plant development[J]. Curr. Opin. Plant Biol.， 2009， 12： 63-68.

[13]Cragg G M， Schepartz S A， Matthew S， et al. The taxol supply crisis.New NCI policies for handling the large-scale production of novel natural product anticancer and anti-HIV ahents[J]. J. Nat. Prod.，1993， 56（10）： 1657-1668.

[14]龔萍， 王健. 利用電導率法測定六種芳香植物的耐熱性[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2011，50（10）：2038-2040.

[15]馬曉娣， 王麗， 彭惠茹. Siete Cerros×Seri-82重組近交系小麥耐熱性的測定[J]. 麥類作物學報， 2006， 26（1）：126-128.

[16]姚士才， 秦賀蘭， 古潤澤. 5個小菊新品種耐熱性綜合評價與鑒定[J]. 中國農(nóng)學通報， 2006， 22（12）： 217-219.

[17]Mallick N， Mohn F H. Reactive oxygen species： response of algal cells[J]. J. Plant Physiol.， 2000，157（2）： 183-193.

[18]羅少波， 李智軍， 周微波， 等. 大白菜品種耐熱性的鑒定方法[J]. 中國蔬菜， 1996（2）： 16-18.

[19]吳國勝， 王永健， 曹宛虹， 等. 大白菜熱害發(fā)生規(guī)律及耐熱性篩選方法的研究[J]. 華北農(nóng)學報， 1995， 10（1）：111-115.

[20]吳國勝， 曹婉虹， 王永健， 等. 細胞膜熱穩(wěn)定性及保護酶和大白菜耐熱性的關系[J]. 園藝學報， 1995， 22（4）：353-358.

[21]司家鋼， 孫日飛， 吳飛燕， 等. 高溫脅迫對大白菜耐熱性相關生理指標的影響[J]. 中國蔬菜， 1995（4）： 4-6，15.

[22]Bowler S R， McKersie B D. Relationships among freezing， low temperature flooding， and ice encasement tolerance in alfalfa[J]. Can. J. Plant Sci.， 1990， 70（1）： 227-235.

[23]Droillard M J， Paulin A， Massot J C. Free radical production， catalase and superoxide dismutase activities and membrane integrity during senescence of petals of cut carnations （Dianthus caryophyllus） [J]. Physiol. Plantarum，1987，71（2）：197-202.

[24]Lu P， Sang W G， Ma K P. Differential responses of the activities of antioxidant enzymes to thermal stresses between two invasive Eupatorium species in China [J]. J. Integr. Plant Biol.， 2008， 50（4）： 393-401.

[25]蘇小俊， 袁希漢， 徐海. 大白菜田間耐熱性的鑒定方法[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報， 2007，23（1）： 78-80.

[26]Suzuki N， Mittler R. Reactive oxygen species and temperature stresses： a delicate balance between signaling and destruction[J]. Physiol. Plantarum， 2006，126（1）： 45-51.

[27]Almeselmani M， Deshmukh P S， Sairam R K， et al. Protective role of antioxidant enzymes under high temperature stress[J]. Plant Science， 2006， 171（3）： 382-388.

[28]Vierling E. The roles of heat shock proteins in plants[J]. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.， 1991， 42：579-620.

[29]李曉鋒， 朱玉英， 侯瑞賢， 等. 夏季高溫對大白菜不同發(fā)育期生化特性的影響研究[J]. 上海農(nóng)業(yè)學報， 2008， 24（1）：36-39.

[30]Song X， Liu G， Duan W， et al. Genome-wide identification，classification and expression analysis of the heat shock transcription factor family in Chinese cabbage [J]. Mol. Genet. Genomics， 2014，289（4）： 541-551.

[31]Baniwal S K， Bharti K， Chan K Y， et al. Heat stress response in plants： a complex game with chaperones and more than twenty heat stress transcription factors [J]. J. Biosci.， 2004，29（4）： 471-487.

[32]黃小云， 陶鵬， 王五宏， 等. 大白菜和甘藍熱激轉錄因子基因家族鑒定及比較分析[J].分子植物育種，2014，12（2）：296-305.

[33]徐堅， 王燕， 陳先知， 等. 大白菜熱激轉錄因子基因家族鑒定及表達分析[J]. 核農(nóng)學報， 2014， 28（4）：586-596.

[34]Huang X Y， Tao P， Li B Y， et al. Genome-wide identification， classification， and analysis of heat shock transcription factor family in Chinese cabbage （Brassica rapa pekinensis） [J]. Genet. Mol. Res.， 2015， 14 （1）： 2189-2204.

[35]黃祥富， 黃上志， 傅家瑞. 植物熱激蛋白的功能及其基因表達的調(diào)控[J]. 植物學通報， 1999， 16（5）：530-536.

[36]栗振義， 龍瑞才， 張鐵軍，等. 植物熱激蛋白研究進展[J]. 生物技術通報， 2016， 32（2）：7-13.

[37]Jinn T L， Yeh Y C， Chen Y M， et al. Stabilization of soluble proteins in vitro by heat shock proteins-enriched ammonium sulfate fraction from soybean seedlings [J]. Plant Cell Physiol.，1989， 30（4）： 463-469.

[38]Jinn T L， Wu S H， Yeh C H， et al. Immunological kinship of class Ⅰ low molecular weight heat shock proteins and thermostabilization of soluble proteins in vitro among plants [J]. Plant Cell Physiol.， 1993， 34（7）： 1055-1062.

[39]王建義， 慈忠玲. 熱激蛋白的研究進展[J]. 山西林業(yè)科技， 2008（1）： 27-32.

[40]Lee J， Song H， Han C T， et al. Expression characteristics of heat shock protein genes in two comparable inbred lines of Chinese cabbage， Chiifu and Kenshin [J]. Genes Genomics， 2010， 32（3）： 247-257.

[41]Hüttenhofer A， Schattner P， Polacek N. Non-coding RNAs： hope or hype？[J]. Trends Genet.， 2005， 21（5）： 289-297.

[42]沈慧. miR398參與白菜抗熱性的分子機制研究[D]. 上海：中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態(tài)研究所， 2013.

[43]Wang L， Yu X， Wang H， et al. A novel class of heat-responsive small RNAs derived from the chloroplast genome of Chinese cabbage （Brassica rapa）[J]. BMC Genomics， 2011， 12： 289.

[44]韓磊， 孫欣. 植物分子標記研究進展[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技， 2015（15）： 47-48.

[45]鄭曉鷹， 王永建， 宋順華， 等. 大白菜耐熱性分子標記的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2002， 35（3）： 309-313.

[46]于拴倉， 王永健， 鄭曉鷹. 大白菜耐熱性QTL定位與分析[J]. 園藝學報， 2003， 30（4）： 417-420.