黃星昱，郭盛，朱邵晴，嚴輝，錢大瑋，段金廒

(南京中醫(yī)藥大學江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協同創(chuàng)新中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點研究室/中藥資源產業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯合工程研究中心，江蘇 南京 210023)

·專題·

虎杖不同組織器官中二苯乙烯類及蒽醌類資源性化學成分的分析與評價△

黃星昱，郭盛*，朱邵晴，嚴輝，錢大瑋，段金廒*

(南京中醫(yī)藥大學江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協同創(chuàng)新中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點研究室/中藥資源產業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯合工程研究中心，江蘇 南京 210023)

目的對蓼科植物虎杖PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc不同組織器官(葉、莖、枝、根莖和根)中二苯乙烯類和蒽醌類資源性化學成分進行分析評價，為其資源綜合利用提供數據支撐。方法采用高效液相色譜法對虎杖不同組織器官中的二苯乙烯類(虎杖苷、白藜蘆醇)及游離型蒽醌類(大黃素、大黃素甲醚)和結合型蒽醌類成分的含量進行測定。結果虎杖植物中二苯乙烯類及蒽醌類資源性物質主要分布于地下根及根莖，并整體呈現出根、根莖、莖、枝、葉漸次減少的分布規(guī)律。兩類成分在地下部位尤以根皮部位分布豐富，其二苯乙烯類成分虎杖苷、白藜蘆醇含量分別達50.06、5.17 mg·g-1，游離大黃素和大黃素甲醚含量分別達5.75、0.38 mg·g-1，結合型大黃素和大黃素甲醚含量分別達5.26、0.43 mg·g-1。結論虎杖植物中二苯乙烯類和蒽醌類資源性化學成分分布部位具有一定的局限性，研究結果為虎杖植物資源的綜合利用提供了數據支撐。

虎杖；非藥用部位；分析評價；二苯乙烯類；蒽醌類

虎杖為蓼科蓼屬多年生草本植物虎杖PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根莖和根，具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰的功能，常用于濕熱黃疸、淋濁、帶下、風濕痹痛、癰腫瘡毒、水火燙傷、經閉、癥瘕、跌打損傷、肺熱咳嗽[1]?；⒄戎参镌谖覈蟛糠值貐^(qū)均有分布，主產于江蘇、四川、陜西、江西、山東等地?，F代研究顯示，虎杖及其提取物具有抑菌、抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛、心腦血管系統(tǒng)保護、抗腫瘤、調節(jié)免疫等藥理作用[2]，其生物活性組分主要為以虎杖苷、白藜蘆醇為代表的二苯乙烯類化合物和以大黃素、大黃素甲醚為代表的蒽醌類化合物[3-6]。近年來，隨著人們對虎杖中主要活性成分白黎蘆醇研究的不斷深入，其開發(fā)利用的領域在不斷擴展，資源消耗量日漸增大，人工栽培生產已逐漸成為目前商品藥材供應的主要來源。而在其采收過程中，大量地上莖葉無有效利用途徑而廢棄。為此，本研究圍繞虎杖植物藥用部位根、根莖及其地上傳統(tǒng)非藥用部位中含有的二苯乙烯類及蒽醌類活性成分的分布進行分析評價，旨在為虎杖資源的綜合利用提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 2695 Alliance高效液相色譜系統(tǒng)(含四元泵、在線脫氣及自動進樣系統(tǒng)，Waters公司)，2996型二極管陣列檢測器(Waters公司)；分析天平(1/10 000，瑞士Mettler Toledo公司)；Milli-Q Integral 5超純水系統(tǒng)(美國Merck Millipore公司)；超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；Microfuge?22R Centrifuge離心機(美國Beckman Coulter公司)。

1.2 試劑

對照品虎杖苷(批號：lw16062005)、白藜蘆醇(批號：lw16040901)、大黃素(批號：lw16071004)及大黃素甲醚(批號：DHJM20140926)均購自南京良緯生物科技有限公司，質量分數均大于98%。色譜甲醇(江蘇漢邦科技有限公司)，色譜乙腈(德國默克公司)，其他試劑均為分析純；超純水為自制。

1.3 材料

虎杖新鮮植株于2017年7月采自南京中醫(yī)藥大學藥用植物園，經南京中醫(yī)藥大學段金廒教授鑒定為蓼科植物虎杖PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.。樣品采集后分離為根木質部、根皮、根莖、葉、莖及枝6個不同部位及器官，40 ℃烘干后粉碎成粗粉，置干燥器中備用。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

PhenomenexGemini C6-Phenyl(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；柱溫：30℃；流動相：0.5%甲酸(A)和乙腈(B)，線性梯度洗脫(0 min，85% A；30 min，65% A；50 min，35% A)；流速：1 mL·min-1；檢測波長：306、280 nm。對照品與樣品色譜圖見圖1。

注：A.混合對照品，B.虎杖根皮；1.虎杖苷(306nm)；2.白藜蘆醇(306nm)；3.大黃素(254nm)；4.大黃素甲醚(254nm)。圖1 對照品及虎杖根皮樣品色譜圖

2.2 對照品溶液制備

精密稱取各對照品適量，加50%乙醇溶解，配成質量濃度分別為虎杖苷(244.8 μg·mL-1)、白藜蘆醇(41.0 μg·mL-1)、大黃素(130.2 μg·mL-1)、大黃素甲醚(43.8 μg·mL-1)的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

精密稱取虎杖根皮、根木質部、根莖、葉、莖、枝粗粉各0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇25 mL，密塞，靜置30 min，稱定質量，回流提取60 min，取出，放冷，密塞后再次稱定質量，以50%乙醇補足減失的重量，搖勻，離心(10 000 r·min-1)10 min，取上清液2 mL作為供試品溶液A，用于測定二苯乙烯類和游離蒽醌類化合物。必要時供試品溶液可加50%乙醇稀釋后測定。

另精密吸取上述離心所得上清液10 mL，置具塞錐形瓶中，加2.0 mL濃鹽酸，搖勻，回流水解60 min，取出，放冷，轉移至25 mL量瓶中，以50%乙醇定容，搖勻，作為供試品溶液B，用于測定總蒽醌。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察及檢測限和定量限測定 分別精密吸取2.2項下制備的對照品溶液，加50%乙醇依次稀釋成不同濃度的系列溶液，進樣10 μL，按2.1項下色譜條件檢測，以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，得回歸方程(見表1)。最低檢測限(LOD)與最低定量限(LOQ)分別在信噪比(S/N)為3和10時測定(見表1)。結果顯示，所測定的4種成分在相應范圍內均呈良好的線性關系，且其檢測靈敏度相對較高。

表1 各對照品線性關系及LOD、LOQ

2.4.2精密度試驗 取混合對照品溶液，按上述色譜條件重復進樣6次，記錄峰面積。結果顯示，虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.2%、1.9%、1.3%和1.5%，表明其精密度良好。

2.4.3重復性試驗 精密稱取虎杖根粗粉0.2 g，6份，按照2.3項下方法制備供試品溶液，依法進樣，分別記錄虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚的峰面積，計算其質量分數及RSD值。結果顯示，其質量分數RSD分別為1.7%、0.9%、0.7%、1.5%，表明本方法重復性良好。

2.4.4穩(wěn)定性試驗 精密稱取1份虎杖根粗粉0.2 g，按照2.3項下方法制備供試品溶液，24 h內每隔2 h進樣1次，記錄峰面積并計算其RSD值。結果顯示，虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚峰面積的RSD依次為2.8%、1.8%、1.7%和1.5%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.4.5加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的虎杖根粗粉0.1 g，6份，分別加入等量對照品，依法制備供試品溶液并進樣分析，計算回收率。結果顯示，虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚平均回收率分別為98.1%、98.3%、100.5%和 99.1%，RSD值分別為2.3%、1.9%、2.3%和2.9%，表明所建立的提取方法準確可靠。

2.5 樣品測定

分別精密吸取對照品溶液和虎杖不同部位樣品供試品溶液，注入液相色譜儀，記錄虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素及大黃素甲醚的峰面積，按外標法計算供試品中各成分的量，每個樣品平行3次進樣測定，以均值作為測定結果，且均以干燥品計。其中，供試品溶液A所測得的蒽醌類成分的量為樣品中游離型蒽醌類成分的量；結合型蒽醌類成分的量=總蒽醌類成分的量(供試品溶液B)-游離型蒽醌類成分的量(供試品溶液A)?；⒄戎仓瓴煌课粯悠分卸揭蚁╊惡洼祯惓煞址治鼋Y果(表2)顯示，虎杖植物中二苯乙烯類及蒽醌類資源性物質主要分布于地下根及根莖，并整體呈現出根、根莖、莖、枝、葉漸次減少的分布規(guī)律；兩類成分在地下部位尤以根皮部位分布豐富，其二苯乙烯類成分虎杖苷、白藜蘆醇含量分別達50.06、5.17 mg·g-1，游離大黃素和大黃素甲醚含量分別達5.75、0.38 mg·g-1，結合型大黃素和大黃素甲醚含量分別達5.26、0.43 mg·g-1，而其葉中均未檢測到二苯乙烯類和游離蒽醌類成分。

表2 虎杖不同組織器官樣品中活性成分分析結果(n=3) mg·g-1

注：“—”表示未檢測到。

3 討論

現有文獻報道虎杖中二苯乙烯類和蒽醌類成分的測定，多為兩類成分分別進行供試品溶液制備及色譜分離，分析時間較長且操作繁瑣。據此，本研究參照文獻方法[7]優(yōu)化了以同一種供試品溶液制備方法在同一色譜條件下同時測定虎杖中以上兩類成分的HPLC定量分析方法，并在此基礎上優(yōu)化建立了用于分別測定游離蒽醌類和結合蒽醌類成分的分析方法，且經系統(tǒng)適應性實驗證實該方法可行。樣品溶液制備過程中，分別考察了不同體積分數乙醇(30%～80%乙醇)作為提取溶劑，以及超聲、回流不同提取方法，發(fā)現采用50%乙醇加熱回流60 min提取，能夠兼顧上述二苯乙烯類及蒽醌類成分的溶解性，使得目標成分的提取效率較高，且影響色譜分離干擾峰較少。

研究結果顯示，虎杖植株中各部位兩類主要成分分布差異較大，地下根及根莖部位兩類成分含量顯著高于地上莖葉，符合對虎杖傳統(tǒng)入藥部位的認識。分析結果顯示，根皮中活性成分含量顯著高于根木質部及根莖，因此可以藥材含韌皮部的多寡作為判斷虎杖藥材優(yōu)劣的依據之一。

此外，據初步測算，虎杖藥材采收期其地上莖葉資源的生物量約為地下根及根莖的5～8倍，目前因無有效利用途徑而廢棄。因此，對其開發(fā)利用不僅可實現虎杖植物資源的有效利用，也可解決虎杖藥材采收過程中莖葉資源廢棄造成的環(huán)境污染。資源的利用價值在于其可利用物質的多用性和多宜性特點[8]。本研究結果提示，虎杖地上莖葉中蒽醌類及茋類成分含量相對較低，資源可利用性較差，但其是否含有其他可利用資源性物質，如糖類、蛋白及氨基酸類等營養(yǎng)物質，本研究尚未涉及，因此尚需遵循中藥資源化學的研究思路與方法[8]，在此基礎上進一步開展其他多類型資源性化學成分研究，以充分揭示虎杖植物的資源價值，實現其綜合、高效利用，最終為虎杖資源綠色產業(yè)鏈的構建提供支撐。

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AnalysisofStilbenesandAnthraquinoneinDifferentPartsofPolygonumcuspidatum

HUANGXingyu，GUOSheng*，ZHUShaoqing，YANHui，QIANDawei，DUANJin’ao*

(JiangsuCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization；StateAdministrationofTraditionalChineseMedicineKeyLaboratoryofChineseMedicinalResourcesRecyclingUtilization；NationalandLocalCollaborativeEngineeringCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrializationandFormulaeInnovativeMedicine，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China)

Objective：To analyze the chemical constituents of stilbenes and anthraquinones in different tissues and organs (leaves，stems，shoots，rhizomes and roots) ofPolygonumcuspidatumSieb.et Zucc，and provide data for the comprehensive utilization ofP.cuspidatumresources.MethodsThe contents of stilbenes (polydatin，resveratrol)，free anthraquinones (emodin，emodin) and conjugated anthraquinones in different tissues and organs ofP.cuspidatumwere determined by HPLC.ResultsThe results showed that stilbenes and anthraquinones contained inP.cuspidatumwere mainly distributed in underground roots and rhizomes，especially in the root bark，and their contents exhibited a gradually decreasing trend from roots to rhizomes，stems，branches and leaves.Most of these analytes appeared the highest levels in the root bark，where the contents of polydatin，resveratrol，free emodin and physcion，conjugated emodin and physcionare 50.06，5.17，5.75，0.38，5.26 and 0.43 mg·g-1，respectively.ConclusionThe distribution organs of the stilbenes and anthraquinones inP.cuspidatumwas limited，and the results could provide data support for the comprehensive utilization ofP.cuspidatum.

Polygonumcuspidatum；non-medicinal parts；analysis and evaluation；stilbenes；anthraquinones

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.12.006

國家自然科學基金面上項目(81473538)；教育部霍英東教育基金會高等院校青年教師基金項目(141040)；公益性行業(yè)科研專項(201407002)；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目(ysxk-2014)

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郭盛，博士，副研究員，研究方向：中藥資源化學與資源循環(huán)利用，E-mail：guosheng@njucm.edu.cn；段金廒，教授，博士生導師，中國自然資源學會中藥及天然藥物資源研究專業(yè)委員會主任委員，中國中藥協會中藥資源循環(huán)利用專業(yè)委員會主任委員，研究方向：中藥資源化學與資源循環(huán)利用，E-mail：dja@njucm.edu.cn

2017-10-02)