周堅(jiān)，郝剛

(蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，江蘇 蘇州 215104)

·中藥工業(yè)·

UPLC-MS/MS法檢測(cè)千柏鼻炎膠囊中阿多尼弗林堿△

周堅(jiān)，郝剛*

(蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，江蘇 蘇州 215104)

目的基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)建立千柏鼻炎膠囊中阿多尼弗林堿的檢測(cè)方法。方法以野百合堿為內(nèi)標(biāo)物，BEH-C18為分析柱，流動(dòng)相為0.5%甲酸水溶液-乙腈(93∶7)，電噴霧電離(ESI+)，采用一級(jí)、二級(jí)掃描及多重反應(yīng)檢測(cè)(MRM)模式。結(jié)果所建方法能快速檢測(cè)阿多尼弗林堿，在46.00～1.15 ng·mL-1內(nèi)線性良好(r=0.9998)，平均加樣回收率為95.9%，方法檢出限為56 ng·g-1，方法重復(fù)性和精密度良好。結(jié)論所建方法快速、靈敏，適用于千柏鼻炎膠囊中阿多尼弗林堿的檢測(cè)。

千柏鼻炎膠囊；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；阿多尼弗林堿

千柏鼻炎膠囊具有清熱解毒、活血祛風(fēng)的功能，臨床上常用于風(fēng)熱犯肺、內(nèi)郁化火、凝滯氣血所致的鼻塞、鼻癢氣熱及慢性鼻炎、急慢性鼻竇炎等癥狀。其處方由千里光、卷柏、羌活、決明子、麻黃、川穹、白芷7味藥組成，其中千里光為主要成分(占76.2%)[1]。千里光為菊科千里光屬植物SenecioscandensBuch.-Ham.的干燥地上部分，其特征成分吡咯里西啶類生物堿具有強(qiáng)烈的肝毒性。目前已從千里光屬植物分離的吡咯里西啶類生物堿(PAs)包括阿多尼弗林堿、千里光堿、克式千里光堿等[2-5]。2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》中千里光檢查項(xiàng)下已有阿多尼弗林堿的限量檢查，但千柏鼻炎膠囊項(xiàng)下未有相關(guān)檢測(cè)規(guī)定。本實(shí)驗(yàn)基于UPLC-MS/MS法建立千柏鼻炎膠囊中阿多尼弗林堿的檢測(cè)方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ACQUITY xevo TQ-S超高效液相色譜儀-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)；Masslynx 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；KQ-300DA型數(shù)控型超聲波清洗器(昆山舒美)；Thermo低溫離心機(jī)；MILLIPORE純水儀。

1.2 試藥

阿多尼弗林堿對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111877-201201，質(zhì)量濃度：0.092 μg·mL-1)；野百合堿對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111878-201102，純度：100%)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；其他試劑均為色譜純。

千柏鼻炎膠囊樣品為市售產(chǎn)品。

2 方法

2.1 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)；正離子掃描；毛細(xì)管電壓4.0 kV；毛細(xì)管溫度：350 ℃；脫溶劑氣體流量：350 L·h-1；錐孔氣流量：150 L·h-1；采用Daughter Scan子離子掃描及多反應(yīng)檢測(cè)模式(MRM)監(jiān)測(cè)，檢測(cè)參數(shù)見(jiàn)表1；氬氣為碰撞氣。

表1 質(zhì)譜MRM檢測(cè)參數(shù)

2.2 色譜條件

BEH-C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：A(含0.5%甲酸水溶液)-B(乙腈)，A∶B=93∶7(體積比)；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣器溫度：15 ℃；流速0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：1 μL。

2.3 內(nèi)標(biāo)溶液制備

精密稱取內(nèi)標(biāo)物野百合堿對(duì)照品適量，加0.5%甲酸溶液溶解、混勻，制成每1 mL含0.2 μg的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.4 對(duì)照品溶液

取阿多尼弗林堿對(duì)照品(0.092 μg·mL-1)1 mL置10 mL量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，

加0.5%甲酸溶液定容，搖勻，0.22 μm濾膜過(guò)濾，即得對(duì)照品溶液。

2.5 供試品溶液制備

取膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱定1.0 g置具塞錐形瓶中，精密加入0.5%甲酸溶液50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，冷卻，再稱定重量，以0.5%甲酸溶液補(bǔ)足減失重量，搖勻，過(guò)濾。取續(xù)濾液5 mL置10 mL量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加0.5%甲酸溶液定容，搖勻，0.22 μm濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。

2.6 千里光陰性溶液制備

按2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》千柏鼻炎膠囊處方比例，取卷柏、決明子、麻黃3味加水煎煮二次，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮成稠膏，加入羌活、川芎、白芷3味的細(xì)粉，混勻，干燥，粉碎，制成陰性樣品，按2.5項(xiàng)下方法制成千里光陰性溶液。

3 結(jié)果

3.1 方法專屬性

分別對(duì)阿多尼弗林堿對(duì)照品(0.092 μg·mL-1)、野百合堿(0.2 μg·mL-1)進(jìn)行Daughter Scan質(zhì)譜掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1，阿多尼弗林堿分子量為365.3。本實(shí)驗(yàn)采用Daughter Scan掃描模式得到阿多尼弗林堿準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z 366，主要二級(jí)碎片離子為m/z 338和138(圖1A)，內(nèi)標(biāo)物野百合堿分子量為325.3，實(shí)驗(yàn)中得到其準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z 326，主要二級(jí)碎片離子為m/z 237和121(圖1B)。

注：A.阿多尼弗林堿；B.野百合堿。圖1 阿多尼弗林堿、野百合堿Daughter Scan掃描圖

按表1參數(shù)建立MRM檢測(cè)方法，阿多尼弗林堿對(duì)照品溶液(加內(nèi)標(biāo))及內(nèi)標(biāo)野百合堿溶液的總離子流圖(TIC)分別見(jiàn)圖2A、2B，野百合堿保留時(shí)間為0.94 min，阿多尼弗林堿保留時(shí)間為1.39 min。

注：A.阿多尼弗林堿對(duì)照品溶液(加內(nèi)標(biāo))；B.野百合堿。圖2 阿多尼弗林堿對(duì)照品溶液(加內(nèi)標(biāo))、野百合堿TIC圖

進(jìn)一步考察千里光陰性樣品溶液，結(jié)果表明，在所建方法下陰性樣品對(duì)阿多尼弗林堿及內(nèi)標(biāo)野百合堿的測(cè)定均無(wú)干擾。供試品溶液(加內(nèi)標(biāo))TIC圖見(jiàn)圖4，千柏鼻炎膠囊供試品對(duì)內(nèi)標(biāo)野百合堿無(wú)干擾，所建方法專屬性良好。

注：A.無(wú)內(nèi)標(biāo)；B.加內(nèi)標(biāo)。圖3 陰性樣品TIC圖

圖4 供試品溶液TIC圖

3.2 線性范圍、檢出限與定量限

精密量取阿多尼弗林堿對(duì)照品(0.092 μg·mL-1)，用0.5%甲酸溶液稀釋成46.00、23.00、4.60、2.30、1.15 ng·mL-1的對(duì)照品溶液，分別取1 mL上述溶液至置10 mL量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加0.5%甲酸溶液定容，搖勻，取1 μL進(jìn)樣分析，以TIC圖對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)(Y)，各對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=2131X+191.2，r=0.999 8。以信噪比S/N=10確定定量限為1.15 ng·mL-1，以信噪比S/N=3確定檢測(cè)限為0.56 ng·mL-1。根據(jù)2.5項(xiàng)下的方法，樣品實(shí)際稀釋倍數(shù)為100，計(jì)算該方法下阿多尼弗林堿的方法檢出限為56 ng·g-1，方法定量限為115 ng·g-1。

3.3 精密度

精密量取阿多尼弗林堿對(duì)照品(0.092 μg·mL-1)0.5 mL至置10 mL量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加0.5%甲酸溶液定容，搖勻，連續(xù)進(jìn)樣6次，阿多尼弗林堿與野百合堿峰面積比值的RSD為1.2%，表明精密度良好。

3.4 穩(wěn)定性

取供試品，按2.5項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，分別于0、2、4、8、12、24 h測(cè)定，結(jié)果阿多尼弗林堿與野百合堿峰面積比值的RSD為2.5%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.5 重復(fù)性

取供試品6份，按2.5項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算阿多尼弗林堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.22 μg·g-1，RSD為1.8%，方法重復(fù)性良好。

3.6 回收率

取千柏鼻炎膠囊供試品6份(阿多尼弗林堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.22 μg·g-1)，每份0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入阿多尼弗林堿對(duì)照品溶液2 mL，加入0.5%甲酸溶液48 mL，按2.5項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算6份樣品回收率分別為101.5%、92.1%、98.4%、95.7%、99.2%、100.3%，平均回收率為95.9%，RSD=3.6%。

3.7 樣品測(cè)定

取市售千柏鼻炎膠囊10批，按2.5項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，每批樣品制備2份，按所建方法測(cè)定樣品中阿多尼弗林堿的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

注：“—”表示測(cè)定結(jié)果小于方法檢出限。

4 討論

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)將色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力與質(zhì)譜具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對(duì)分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，目前已被廣泛應(yīng)用于藥品質(zhì)量控制研究領(lǐng)域[6]。與高效液相色譜法相比，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)由于采用了2.0 μm以下的色譜柱填料，進(jìn)一步縮短了分析時(shí)間，提高了分析的通量和靈敏度，尤其適合痕量物質(zhì)的檢測(cè)[7-8]。

作為千里光藥材安全性評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)成分，阿多尼弗林堿在不同地產(chǎn)千里光藥材中含量分布差異較大，有文獻(xiàn)報(bào)道[9]，我國(guó)浙江、安徽、云南等地產(chǎn)千里光中所含的吡咯里西啶類生物堿(PAs)主要為阿多尼弗林堿，廣東產(chǎn)千里光的主要PAs為克式千里光堿[10]，而熊愛(ài)珍等[4]在歐洲千里光中未檢測(cè)出阿多尼弗林堿。此外，阿多尼弗林堿化學(xué)結(jié)構(gòu)上無(wú)生色團(tuán)，紫外響應(yīng)弱[4]。因此，現(xiàn)行2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)千里光中的阿多尼弗林堿進(jìn)行限量檢查，并規(guī)定其含量不得過(guò)0.004%(40 μg·g-1)[1]。

千柏鼻炎膠囊、千柏鼻炎片等中成藥中的主要成分為千里光，2004年英國(guó)藥品和保健品管理機(jī)構(gòu)(MHRA)考慮到千柏鼻炎片(膠囊)的吡咯里西啶類生物堿(阿多尼弗林堿等)嚴(yán)重的肝損傷作用，對(duì)千柏鼻炎片(膠囊)等含千里光屬(植物)內(nèi)服中成藥禁止進(jìn)口和銷售[11-12]。此外，國(guó)內(nèi)也曾出現(xiàn)過(guò)千柏鼻炎片引起肝臟損害的相關(guān)報(bào)告[13]。為進(jìn)一步加強(qiáng)千柏鼻炎膠囊(片)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，本實(shí)驗(yàn)基于UPLC-MS/MS方法建立了千柏鼻炎膠囊中阿多尼弗林堿的檢測(cè)方法。與現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)藥典》方法相比，本實(shí)驗(yàn)采用多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)，選取阿多尼弗林堿兩個(gè)特征碎片離子進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步增強(qiáng)了質(zhì)譜檢測(cè)的專屬性，提高待測(cè)化合物及內(nèi)標(biāo)物的靈敏度[14-16]，儀器定量限為1.15 ng·mL-1，方法定量限為115 ng·g-1。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于UPLC-MS/MS技術(shù)，利用多反應(yīng)檢測(cè)模式(MRM)建立了千柏鼻炎片中阿多尼弗林堿的檢測(cè)方法，方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好、分析時(shí)間短，能夠滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)需求，為千柏鼻炎片等中成藥中阿多尼弗林堿的質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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DetectionofAdonifolineinQianbaiBiyanCapsulesbyUPLC-MS/MS

ZHOUJian，HAOGang*

(SuzhouInstituteforDrugControl，JiangsuSuzhou215104，China)

Objective：To establish a specific，sensitive and rapid UPLC-MS/MS method for determination of adonifoline in Qianbai Biyan capsules.MethodsMonocrotaline was used as an internal standard.Samples were detect by the ultra performance liquid chromatography-electrospray ion(ESI+)trap mass spectrometry method.The separation was performed on Waters UPLC using BEH-C18column with an isocratic elution(0.5% acetic acid：acetonitrile=93∶7).The qualitative and quantitative analysis of adonifoline was conducted in the MS Scan，Daughter Scan and MRM mode by UPLC-MS/MS.ResultsThe calibration curves showed a good linear relationship in the range of 46.00-1.15 ng·mL-1for the component(r=0.999 8).The determination limits was 56 ng·g-1and the average recovery rate was 95.9%.Good reproducibility and precision was also achieved.ConclusionThe method was proved to be specific，rapid and sensitive，which can be used to analyze adonifoline in Qianbai Biyan capsules.

Qianbai Biyan capsules；UPLC-MS/MS；adonifoline

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.12.022

蘇州市民生科技-醫(yī)療衛(wèi)生基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(SYS201663)

*

郝剛，副主任藥師，研究方向：藥品質(zhì)量與安全監(jiān)控研究；Tel：(0512)68222721，E-mail：haogang531@163.com

2017-03-20)