楊俊杰，嚴(yán)進(jìn)，陸兔林

(1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院 信陽(yáng)市中藥資源開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心，信陽(yáng)市中藥分析檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 信陽(yáng) 464000；2.河南羚銳制藥股份有限公司，河南 信陽(yáng) 464000；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023)

·中藥工業(yè)·

苯酚-硫酸法聯(lián)合DNS法測(cè)定商陸多糖及響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取研究△

楊俊杰1*，嚴(yán)進(jìn)2，陸兔林3

(1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院 信陽(yáng)市中藥資源開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心，信陽(yáng)市中藥分析檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 信陽(yáng) 464000；2.河南羚銳制藥股份有限公司，河南 信陽(yáng) 464000；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023)

目的探尋一種商陸多糖快速、簡(jiǎn)捷的測(cè)定方法。方法利用紫外分光光度計(jì)，分別采用苯酚-硫酸法測(cè)定商陸總糖含量，DNS法測(cè)定還原糖含量，用二者的差值作為測(cè)得的商陸多糖含量，并從重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率等方面進(jìn)行方法學(xué)考察；通過(guò)對(duì)商陸多糖超聲波輔助提取的單因素研究，以多糖提取率為響應(yīng)值，采用四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行工藝優(yōu)化。結(jié)果苯酚-硫酸法聯(lián)合DNS法測(cè)定商陸多糖具有良好的適用性；最佳提取工藝為料液比1∶40(g∶mL)、超聲時(shí)間30 min、超聲溫度60 ℃、超聲功率350 W，在此這條件下得到商陸多糖提取率平均為(12.38%±0.59%)。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)采用的樣品處理方法簡(jiǎn)單，測(cè)定方法可靠，可用于商陸多糖的測(cè)定。

商陸多糖；二硝基水楊酸法；苯酚-濃硫酸法；響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)；超聲波輔助提取

商陸系商陸科植物商陸PhytolaccaacinosaRoxb或垂序商陸PhytolaccaamerrcanaL.的干燥根[1]。具有逐水消腫、通利二便、解毒散結(jié)等功能，多用于治療水腫、咳嗽等疾病。其主要有效成分為商陸皂苷、多糖等。現(xiàn)代研究表明，商陸多糖具有抗腫瘤、促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖、增強(qiáng)免疫力等作用[2-6]。但現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)藥典》[1]中并未對(duì)商陸中商陸多糖含量做質(zhì)量要求。故在商陸產(chǎn)地加工炮制研究中關(guān)于商陸多糖變化的研究不多。目前關(guān)于商陸多糖測(cè)定方法的記載最早見(jiàn)于王莉等[7]采用水提醇沉法提取商陸多糖，用酚-硫酸比色法測(cè)定多糖含量。魯建江等[8]運(yùn)用微波技術(shù)，用水提醇沉法制得商陸粗多糖，并采用酚-硫酸比色法對(duì)其多糖含量進(jìn)行測(cè)定。段靜等[9]沿用了王莉等人的水提醇沉方法提取商陸多糖，采用蒽酮-硫酸法測(cè)定含量。上述方法中的水提醇沉法前期采用不同有機(jī)溶劑，反復(fù)回流除雜后熱水回流提取，操作繁雜、耗時(shí)長(zhǎng)。而微波提取技術(shù)尚不成熟。超聲波輔助提取目前已經(jīng)廣泛用于多糖的提取和測(cè)定[11-13]。蒽酮-硫酸法、酚-硫酸法只能測(cè)定總糖的含量，需要前期對(duì)多糖進(jìn)行提純和除雜，除了多糖會(huì)受到損失外，同時(shí)還存在單糖的干擾。張志君等[14]采用聯(lián)合3，5-二硝基水楊酸法(DNS)和苯酚-濃硫酸法，通過(guò)紫外分光光度法分別測(cè)定黃精原藥材中還原糖和總糖的含量，取兩者之差即為藥材中多糖的含量，效果良好。毛淑敏等[15]采用上述方法成功測(cè)定了金銀花不同花期多糖的含量。本研究嘗試采用苯酚-硫酸法聯(lián)合DNS法測(cè)定商陸多糖含量，采用響應(yīng)面法對(duì)超聲波輔助提取商陸多糖的提取功率、溫度、液料比、提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，從而擬建立一種操作簡(jiǎn)便，測(cè)定準(zhǔn)確的商陸多糖測(cè)定方法。

1 材料

UV1801型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用有限公司)；DHG-9240A型電熱風(fēng)干燥箱(上海索譜有限公司)；分析天平(瑞士梅特勒公司)。

商陸樣品于2016年10月份在信陽(yáng)市平橋區(qū)采挖，經(jīng)信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院周巍副教授鑒定為商陸科植物垂序商陸PhytolaccaamerrcanaL.的新鮮根莖。

葡萄糖對(duì)照品(中國(guó)計(jì)量科學(xué)院，批號(hào)：GBW10062)；所有試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品處理

商陸采挖后，洗凈，除去蘆頭和須根，切成2 mm厚片，粉碎成粗顆粒后，備用。

2.2 多糖含量測(cè)定

2.2.1 葡萄糖對(duì)照溶液的配制 精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖，用蒸餾水溶解，配制質(zhì)量濃度為1.007 g·L-1的葡萄糖對(duì)照溶液。

2.2.2 苯酚溶液的配制 精密稱取5 g苯酚，用蒸餾水溶解并定容于100 mL量瓶中。

2.2.3 DNS溶液的配制 稱取0.65 g DNS用適量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL棕色量瓶中，依次加入32.5 mL的2 mol·L-1的NaOH溶液和4.5 g丙三醇，定容。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.6、2.0 mL，加入蒸餾水至4 mL，再分別精確加入5 mL的DNS溶液，混勻后置沸水浴中煮沸5 min，冷卻至室溫，定容至10 mL，以空白管為對(duì)照，在540 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度(g·L-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.530 1X-0.051 3(r=0.994)，在0.02～0.2 g·L-1線性關(guān)系良好，用于DNS法測(cè)定還原糖。

精密量取葡萄糖對(duì)照品溶液1 mL，用蒸餾水定容至10 mL，精密量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、1.0 mL于10 mL量瓶中，用蒸餾水補(bǔ)足1 mL，再分別精密加1.6 mL的5%苯酚溶液和7 mL的濃硫酸溶液，搖勻，水浴加熱20 min，冷卻至室溫，以空白管為對(duì)照，在490 nm測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度(g·L-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=7.144 1X+0.02 1(r=0.999 2)，在0.001～0.01 g·L-1呈線性關(guān)系，用于測(cè)定總糖。

2.2.5 供試品溶液的制備與測(cè)定 精密稱取商陸粉末2 g，加入10 mL石油醚(60～90 ℃)，熱回流脫脂30 min，過(guò)濾，揮去殘留石油醚，加入蒸餾水100 mL，熱回流提取2 h，取上清液，過(guò)濾，精密吸取1 mL作為DNS法測(cè)定用的原糖供試品溶液。另取上清液1 mL，加入蒸餾水定容至10 mL，精密吸取1 mL作苯酚-硫酸法測(cè)定用總糖供試品溶液。

以總糖含量減去還原糖含量即為樣品中多糖的含量。

2.2.6 方法學(xué)考察 精密度試驗(yàn)：分別精密稱取藥材粉末6份，按照2.2.5項(xiàng)下的方法制備成供試品溶液，分別測(cè)定還原糖和總糖的含量，結(jié)果RSD分別1.44%、1.72%，表明精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：分別精密吸取1 mL還原糖供試品溶液和1 mL總糖供試品溶液各6份，分別測(cè)定還原糖和總糖的含量，結(jié)果RSD分別1.32%、1.62%，表明重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：分別精密吸取1 mL還原糖供試品溶液和1 mL總糖供試品溶液各1份，在0、10、20、30、60、90 min分別測(cè)定還原糖和總糖的含量，結(jié)果RSD分別為1.64%、1.72%，表明試驗(yàn)在90 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收率試驗(yàn)：分別稱取還原糖含量和總糖含量已知的商陸藥材粉末2.0 g，共6份，精密稱定，精確加入葡萄糖對(duì)照品適量，按照2.2.5項(xiàng)下方法測(cè)定還原糖和總糖的含量，結(jié)果見(jiàn)表1～2。RSD分別1.42%、1.67%。

表1 DNS法測(cè)定還原糖加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表2 苯酚-硫酸法測(cè)定總糖加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.3 商陸多糖超聲波提取工藝優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗(yàn)與結(jié)果 稱取商陸粉末2 g，至具塞三角瓶中，加入20 mL石油醚(60～90 ℃)，超聲提取30 min，棄去石油醚，揮去殘留，備用。

2.3.1.1 料液比對(duì)多糖提取的影響 經(jīng)脫脂后的樣品按照料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g·mL-1)加入純化水，設(shè)定超聲時(shí)間為40 min，溫度為50 ℃，功率為350 W。過(guò)濾，取續(xù)濾液按照2.2.5項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，分別計(jì)算總糖和還原糖的含量。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 料液比對(duì)多糖提取的影響

由圖1可以知，料液比對(duì)還原糖測(cè)定的影響比較小，對(duì)總糖的測(cè)定影響大，在料液比較小時(shí)，總糖的測(cè)出率非常低，料液比在1∶40時(shí)，測(cè)出率最高，但料液比增大到1∶50后，測(cè)出率反而降低。故選擇料液比為1∶40。

2.3.1.2 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響 經(jīng)脫脂后的樣品按照料液比1∶40加入純化水，設(shè)定溫度為50 ℃，功率為350 W。提取時(shí)間分別設(shè)定為10、20、30、40、50、60 min。過(guò)濾，取續(xù)濾液按照2.2.5項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，分別計(jì)算總糖和還原糖的含量。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取的影響

由圖2可知，隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)，還原糖和總糖測(cè)出率明顯增高，30 min達(dá)到一個(gè)比較高的水平，隨后變化較小，但隨著時(shí)間進(jìn)一步地增長(zhǎng)，提取率反而有所降低。原因可能是長(zhǎng)時(shí)間的提取對(duì)多糖造成破壞，或者是雜質(zhì)溶出過(guò)多，干擾了測(cè)定結(jié)果。根據(jù)上述情況選擇超聲提取時(shí)間為30 min。

2.3.1.3 超聲溫度比對(duì)多糖提取率的影響 經(jīng)脫脂后的樣品按照料液比1∶40加入純化水，提取時(shí)間30 min，功率為350 W。設(shè)定溫度分別為40、50、60、70、80 ℃。過(guò)濾，取續(xù)濾液按照2.2.5項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，分別計(jì)算總糖和還原糖的含量。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 提取溫度對(duì)多糖提取的影響

由圖3可以知，高溫可以促使多糖溶出，60 ℃提取率最高，繼續(xù)升溫提取率反而下降。根據(jù)上述情況選擇超聲提取溫度為60 ℃。

2.3.1.4 超聲功率對(duì)多糖提取率的影響 經(jīng)脫脂后的樣品按照料液比1∶40加入純化水，提取時(shí)間30 min，溫度為60 ℃。設(shè)定功率分別為250、300、400、450、500 W。過(guò)濾，取續(xù)濾液按照2.2.5項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，分別計(jì)算總糖和還原糖的含量。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 提取功率對(duì)多糖提取的影響

由圖4可以知，提高功率可以促使多糖溶出，350 W以后提取率變化不大。根據(jù)上述情況選擇超聲提取溫度為350 W。

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化工藝設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理，選擇料液比(A)、超聲時(shí)間(B)、超聲溫度(C)、超聲功率(D)4個(gè)因素為影響因子，商陸多糖提取率為影響值，進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素及設(shè)計(jì)水平見(jiàn)表3。

表3 Box-Benhnken試驗(yàn)因素及水平(n=6)

2.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析 按照上述方設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.3.3.1 回歸模型的建立 用Design Expert8.06軟件對(duì)表4結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到回歸模型為R1=12.35+0.89A+0.55B-0.13C+0.20D-0.12AB-0.49AC-0.18AD+0.21BC+0.42BD+0.43CD-2.16A2-2.11B2-2.63C2-1.89D2。

2.3.3.2 回歸模型的分析 對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表5。該模型P值<0.01，表明本回歸模型極顯著，試驗(yàn)設(shè)計(jì)可行，誤差較小。失擬項(xiàng)P值>0.05，差異不顯著。經(jīng)可信度分析，校正決定系數(shù)為0.807，信噪比為10.96，遠(yuǎn)大于4。說(shuō)明使用該方程進(jìn)行擬合的效果很好，其他因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾較小。因此，可以用該方程來(lái)確定商陸多糖提取的最佳工藝參數(shù)。一次項(xiàng)A影響極顯著，B影響顯著，二次項(xiàng)影響均為極顯著，說(shuō)明料液比對(duì)商陸多糖提取影響最大，其次是提取時(shí)間、超聲溫度和超聲功率對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著。

表5 方差分析

2.3.3.3 回歸模型的建立交互作用分析 響應(yīng)面分析見(jiàn)圖5～10。從各響應(yīng)面可較直觀看出各因素交互作用對(duì)商陸多糖提取率的影響，曲線越陡，表明該因素對(duì)多糖提取率影響越大。就因素的交互作用而言，料液比與提取時(shí)間對(duì)提取效率影響較大，其他的交互作用差別不大。與方差分析結(jié)果相吻合。

2.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化及驗(yàn)證 由Design Expert 8.06軟件得到商陸多糖提取的最佳提取條件為料液比為1∶40.1(g∶mL)，超聲時(shí)間為30.02 min，超聲溫度為59.98 ℃，超聲功率350 W，在此條件下，商陸多糖提取率為12.35%。為了便于實(shí)際操作，將最佳工藝條件修正為料液比1∶40(g∶mL)、超聲時(shí)間30 min、超聲溫度60 ℃、超聲功率350 W，在此條件下得到商陸多糖提率平均為(12.38%±0.59%)，此條件與預(yù)測(cè)值十分接近，可說(shuō)明采用響應(yīng)面法得到的優(yōu)化工藝結(jié)果是比較可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

圖5 料液比與提取溫度對(duì)多糖提取的交互影響

圖6 料液比與提取時(shí)間對(duì)多糖提取的交互影響

圖7 料液比與超聲功率對(duì)多糖提取的交互影響

圖8 提取溫度與提取時(shí)間對(duì)多糖提取的交互影響

圖9 提取溫度與超聲功率對(duì)多糖提取的交互影響

圖10 提取時(shí)間與超聲功率對(duì)多糖提取的交互影響

3 討論

本研究建立了酚-硫酸法聯(lián)合DNS法測(cè)定商陸多糖含量方法，可以減少傳統(tǒng)方法經(jīng)過(guò)多次提取精制造成的商陸多糖的損失，較為準(zhǔn)確地反映出商陸多糖的實(shí)際含量，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。并用響應(yīng)面法優(yōu)化了商陸多糖超聲波輔助提取工藝，比傳統(tǒng)提取方法簡(jiǎn)單和快捷，具有良好的應(yīng)用前景。由于商陸中含有皂苷，可能會(huì)對(duì)酚-硫酸法和DNS法的測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生影響，初步推斷認(rèn)為兩種測(cè)定方法相減，可以抵消這種影響，但推斷是否正確，尚待進(jìn)一步研究。本研究采用的超聲波提取器，由于容積有限、功率較小，所得的優(yōu)化條件在其他超聲波設(shè)備上是否成立，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

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StudyonDeterminationofPolysaccharidesinRadixPhytolaccaebyPhenol-SulfuricAcidMethodCombinedwithDNSMethodandOptimizationofUltrasonicAssistedExtractionbyResponseSurfaceMethodology

YANGJunjie1*，YANjin2，LUTulin3

(1.XinyangEngineeringResearchCenterfortheexploitationofChineseMedicineResources，XinyangKeyLaboratoryofDetectionandanalysisofChineseMedicine，XinyangAgricultureandForestryUniversity，Xinyang464000，China；2.HenanLingruiPharmaceuticalCo.，Ltd.，Xinyang464000，China；3.NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China)

Objective：To find a quick and simple method for determination of polysaccharides in Radix Phytolaccae.MethodsUV spectrophotometry was used to determine the total sugar content by phenol-sulfuric acid method，DNS method was used to determine the content of reducing sugar，and the difference between the two methods was used to measure the content of polysaccharide，and the methods of repeatability，stability and recovery rate were investigated.Based on the single factor study of ultrasonic assisted extraction of polysaccharides from Radix Phytolaccae，the response rate of polysaccharide was taken as the response value，and the response surface experiment design with four factors and three levels was used to optimize the process.ResultsThe phenol-sulfuric acid combined with DNS method for determination of polysaccharides in Radix Phytolaccae showed a good applicability.The optimized extraction process was as follows：solid-liquid ratio 1∶40(g∶mL)，ultrasonic time 30 min，ultrasonic temperature 60 ℃，ultrasonic power 350 W.Under these conditions，the average extraction rate of polysaccharides was 12.38%±0.59%.ConclusionThe method is simple and reliable，and can be used for the determination of polysaccharides in Radix Phytolaccae.

Polysaccharides in Radix Phytolaccae；DNS method；phenol-sulfuric method；response surface methodology；ultrasonic assisted extraction

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.12.018

國(guó)家中醫(yī)藥行業(yè)專(zhuān)項(xiàng)(2015468002-2)；信陽(yáng)市科技攻關(guān)項(xiàng)目(150089)

*

楊俊杰，副教授，研究方向：中藥材產(chǎn)地加工及活性成份開(kāi)發(fā)；E-mail：nanyangjj@163.com

2017-03-30)