梁仲珍，曾 婧，陳 莉，劉 斌，王 芳*

(1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 甘肅 蘭州 730000；3.中國(guó)人民解放軍蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院 病理科，甘肅 蘭州 730000)

研究論文

異紫堇堿抑制裸鼠人宮頸癌Siha細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)

梁仲珍1，曾 婧2，陳 莉1，劉 斌3，王 芳1*

(1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 甘肅 蘭州 730000；3.中國(guó)人民解放軍蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院 病理科，甘肅 蘭州 730000)

目的研究異紫堇堿(ICD)對(duì)裸鼠人宮頸癌Siha細(xì)胞移植瘤的影響，探討異紫堇堿抑制宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。方法將人宮頸癌Siha細(xì)胞接種于BALB/c(nu/nu)裸鼠皮下建立動(dòng)物模型，待移植瘤平均直徑≥0.5 cm時(shí)，隨機(jī)分為對(duì)照組及腹腔注射不同劑量異紫堇堿干預(yù)組。4周后取出瘤體組織，用HE染色法觀察瘤體組織病理形態(tài)學(xué)，用免疫組化染色及Western blot方法觀察負(fù)荷瘤組織中的蛋白表達(dá)。結(jié)果經(jīng)異紫堇堿干預(yù)后的宮頸癌Siha細(xì)胞裸鼠負(fù)荷瘤體積減小(P<0.05)；細(xì)胞形態(tài)可由干細(xì)胞樣向上皮樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化；上皮細(xì)胞分化成熟標(biāo)記E-cadherin表達(dá)明顯升高，而HPV16E6蛋白和間葉組織標(biāo)志物vimentin的表達(dá)下降。結(jié)論異紫堇堿可能通過(guò)抑制攜帶HPV亞型的宮頸癌Siha細(xì)胞中E6蛋白的表達(dá)及EMT相關(guān)信號(hào)通路來(lái)抑制宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

異紫堇堿；Siha細(xì)胞；皮下移植瘤；蛋白表達(dá)

宮頸癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致全世界婦女死亡的主要惡性腫瘤之一。2012年GLOBOCAN(全球癌統(tǒng)計(jì)組織)調(diào)查顯示全球每年有近53萬(wàn)宮頸癌新發(fā)病例，近27萬(wàn)例死于該疾病，主要發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。中國(guó)每年約有13.2萬(wàn)新發(fā)病例，發(fā)病率為15.7/10萬(wàn)，病死率為8.3/10萬(wàn)，嚴(yán)重危害女性健康[1- 2]。持續(xù)高危型人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件和根本因素。生殖系統(tǒng)人乳頭瘤病毒有200多種亞型，其中高危型的有HPV16、18、31、33、52和58等。E6和E7蛋白是高危型HPV的主要癌蛋白，E6和E7蛋白分別與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白p53和RB結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞失去周期阻滯及凋亡功能，不受機(jī)體的控制，呈惡性增殖[3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，異紫堇堿(isocorydine, ICD)能夠抑制攜帶不同HPV亞型的人宮頸癌HeLa和Siha細(xì)胞系中E6、E7基因和蛋白的表達(dá)，并且能夠抑制人宮頸癌HeLa、Siha和C33A細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。計(jì)算機(jī)分子對(duì)接篩選技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，異紫堇堿(ICD)可以穩(wěn)定地結(jié)合HPV16E6蛋白[4]，表明HPV16E6很可能是異紫堇堿的作用靶點(diǎn)[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)，異紫堇堿能夠顯著降低肝癌細(xì)胞系中具有干細(xì)胞特征的側(cè)群細(xì)胞的比例，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性，并且對(duì)腫瘤干細(xì)胞具有較好的靶向性，對(duì)其多藥耐藥具有逆轉(zhuǎn)作用[6- 7]。異紫堇堿的新型衍生物的抗腫瘤活性及穩(wěn)定性顯著增加[8- 10]。目前，異紫堇堿在宮頸癌中的研究較少，因此尋找針對(duì)HPV的新型抗腫瘤藥物意義重大。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑：異紫堇堿單體(中國(guó)科學(xué)院蘭州化物所柳軍璽等研究員從罌粟科植物禿瘡花中提取后制得，純度大于90%)，并在4 ℃條件下避光保存。E-cadherin抗體和HPV16E6抗體(Santa Cruz公司)；vimentin抗體和GAPDH抗體(CST公司)。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞：SPF級(jí)BALB/c(nu/nu)裸鼠，雌性，4～6周齡，體質(zhì)量18～20 g(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物檢疫合格證號(hào)：3100110324)。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室。攜帶HPV16E6的宮頸癌Siha細(xì)胞系(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))，在蘭州大學(xué)第二醫(yī)院消化腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 宮頸癌Siha細(xì)胞系的培養(yǎng)：用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2，空氣濕度為95%的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。用處于對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 宮頸癌Siha細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立及分組：取處于對(duì)數(shù)增殖期的Siha細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞為1×107個(gè)/mL，注射于裸鼠后背部靠近腋窩處皮下，0.2 mL/只。達(dá)成瘤標(biāo)準(zhǔn)(負(fù)荷瘤瘤徑≥0.5 cm)后，隨機(jī)分組。PBS組，8只，0.1 mL/d腹腔注射；異紫堇堿高、中和低劑量組，每組7只，0.4、0.2和0.1 mg/(kg·d)腹腔注射；紫杉醇(paclitaxel,TAX)組，7只，12 mg/(kg·d)，連續(xù)腹腔注射5 d/周；用藥4周后取出瘤體組織。

1.2.3 HE染色：HE染色觀察PBS組、紫杉醇組及不同濃度異紫堇堿干預(yù)組宮頸癌Siha細(xì)胞裸鼠負(fù)荷瘤組織的病理學(xué)變化。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色觀察E-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)含量：根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞在全部癌細(xì)胞中所占比例及陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度判定試驗(yàn)結(jié)果，A：按陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分，每張切片計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野(×400)中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，陽(yáng)性細(xì)胞率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<1/3為1分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)1/3～2/3為2分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥2/3為3分；B：按細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分，無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。積分?jǐn)?shù)=A×B，A×B=0判定為無(wú)表達(dá)，A×B≤4判定為低表達(dá)，A×B>4判定為高表達(dá)。

1.2.5 Western blot檢測(cè)HPV16E6、E-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)：將各組負(fù)荷瘤組織分別研磨，然后加入細(xì)胞裂解液提取蛋白樣品，取等量蛋白樣品，上樣、電泳和轉(zhuǎn)膜，封閉后分別加入HPV16E6、E-cadherin和vimentin一抗，4℃孵育過(guò)夜，PBST脫色，加二抗，ECL化學(xué)發(fā)光試劑，X線膠片曝光、定影和顯影，最后用凝膠成像儀拍照。結(jié)果以目的蛋白/內(nèi)參照吸光度的比值來(lái)表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 裸鼠皮下移植瘤體積

用藥4周后，ICD組的瘤體體積小于對(duì)照組。高、中和低3個(gè)劑量ICD組的瘤體體積分別為(0.15±0.05)cm3，(0.19±0.08)cm3和(0.23±0.07)cm3，顯著低于對(duì)照組(0.41±0.10)cm3(P<0.05)，也低于TAX組(0.38±0.13)cm3(P<0.05)。

2.2 HE染色結(jié)果(圖1)

2.3 免疫組化染色結(jié)果

ICD組和TAX組宮頸癌Siha細(xì)胞裸鼠負(fù)荷瘤組織中E-cadherin的表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)，而ICD組vimentin的表達(dá)顯著低于TAX組和對(duì)照組(P<0.05)(圖2，表1)。

圖1 HE染色：宮頸癌Siha細(xì)胞裸鼠負(fù)荷瘤組織細(xì)胞形態(tài)發(fā)生上皮樣轉(zhuǎn)化

圖2 經(jīng)異紫堇堿干預(yù)后的宮頸癌Siha細(xì)胞裸鼠負(fù)荷瘤組織中E-cadherin(A)及vimentin(B)的表達(dá)

groupnE-cadherinvimentinlowhighlowhighPBS65124ICD92*7*6*3*TAX60606

*P<0.05 compared with control.

2.4 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果

ICD組和TAX組E-cadherin蛋白的表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)，而ICD中劑量組vimentin和HPV16E6蛋白的表達(dá)顯著低于PBS組和TAX組(P<0.05)(圖3，表2)。

3 討論

宮頸癌是女性常見(jiàn)的腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，且發(fā)病年齡趨于年輕化。目前，臨床上早期宮頸癌的治療主要以手術(shù)切除為主，中晚期主要以放化治療為主，其中化療以鉑類及紫杉醇等藥物為主，尚無(wú)針對(duì)HPV陽(yáng)性宮頸癌治療的靶向藥物。從具有中國(guó)西北特色的傳統(tǒng)中草藥禿瘡花中提取發(fā)現(xiàn)的異紫堇堿具有抑制HPV感染及高效抗腫瘤活性[11]，為臨床宮頸癌的藥物治療提供了新的思路。已有研究表明，異紫堇堿能夠顯著降低肝癌細(xì)胞系側(cè)群細(xì)胞的比例，而肝癌側(cè)群細(xì)胞具有干細(xì)胞特征，屬于高度耐藥細(xì)胞群，對(duì)多種臨床化療藥物不敏感，異紫堇堿對(duì)腫瘤干細(xì)胞CD133具有良好的靶向作用，并對(duì)其多藥耐藥具有逆轉(zhuǎn)作用。異紫堇堿能夠通過(guò)上調(diào)cyclinB1 and p-CDK1表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)G2/M期細(xì)胞周期阻滯和凋亡，降低了肝癌細(xì)胞系SMMC-7721和 Huh7的致瘤性[6- 7]。研究還發(fā)現(xiàn)，異紫堇堿新型衍生物具有抗腫瘤活性及穩(wěn)定性[8- 10]， 對(duì)開(kāi)發(fā)新型抗腫瘤藥物意義重大。

圖3 經(jīng)異紫堇堿干預(yù)后宮頸癌Siha細(xì)胞裸鼠負(fù)荷瘤組織中E-cadherin、vimentin及HPV16E6蛋白的表達(dá)

groupHPV16E6/GAPDHE-cadherin/GAPDHvimentin/GAPDHCtr. 0.165±0.011 0.153±0.040 0.588±0.021L 0.116±0.028* 0.194±0.049* 0.444±0.034*M 0.092±0.011* 0.459±0.016* 0.207±0.030*H 0.112±0.003* 0.380±0.035* 0.326±0.021*Tax. 0.158±0.037 0.621±0.110 0.637±0.082

*P<0.05 compared with control.

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)異紫堇堿干預(yù)后的宮頸癌Siha細(xì)胞裸鼠負(fù)荷瘤體積減小，說(shuō)明異紫堇堿可以顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，對(duì)于在臨床上腫瘤期別較晚，瘤體組織較大的患者，可以通過(guò)新輔助化療的方法縮小瘤體體積以獲得手術(shù)機(jī)會(huì)，從而達(dá)到延長(zhǎng)生存期，改善患者生活質(zhì)量的目的；上皮細(xì)胞分化成熟標(biāo)記E-cadherin表達(dá)明顯升高，而HPV16E6蛋白和間葉組織標(biāo)志物vimentin的表達(dá)下降，E-cadherin的低表達(dá)及vimentin表達(dá)的升高是上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)發(fā)生的重要標(biāo)志，而EMT是腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)[12]，說(shuō)明異紫堇堿可能通過(guò)抑制攜帶HPV亞型的宮頸癌Siha細(xì)胞中E6蛋白的表達(dá)及EMT相關(guān)信號(hào)通路來(lái)抑制宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，異紫堇堿有望被開(kāi)發(fā)成為針對(duì)HPV陽(yáng)性宮頸癌的有效靶向治療藥物，或與臨床常用抗腫瘤藥物聯(lián)合來(lái)增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。

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Isocorydine inhibits the growth of human cervical carcinoma (Siha) cells xenografts in nude mice

LIANG Zhong-zhen1, ZENG Jing2, CHEN Li1, LIU Bin3, WANG Fang1*

(1.Dept. of Gynaecology and Obstetrics, Lanzhou University Second Hospital, Lanzhou 730000; 2.Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000; 3.Dept. of Pathology, General Hospital of Lanzhou Military Region, Lanzhou 730000, China)

ObjectiveStudy on the effect of isocorydine in human cervical cancer Siha cells xenografts in nude mice, to explore the inhibition mechanism of isocorydine in cervical carcinoma.MethodsEstablishment of human cervical cancer Siha cells subcutaneous xenografts model in BALB/c (nu/nu) nude mice. When the average diameter of the transplanted tumor≥0.5 cm, mice were randomly assigned into control group and experimental group. In experimental group, the model was administered by intraperitoneal injection of different doses of isocorydaline. After 4 weeks, the tumor tissues were removed, the histopathological changes of the tumor were observed by HE staining, and the expression of proteins in the tumor tissue were observed by immunohistochemical staining and Western blot.ResultsCompared with the control group, the tumor volume of experimental group was significantly decreased(P<0.05); the cell morphology transformed from stem cells to epithelioid cells, and the expression of E-cadherin was significantly increased while the expression of HPV16E6 and vimentin was decreased.ConclusionsIsocorydine may inhibit the development of cervical cancer by inhibiting the expression of E6 protein and EMT-related signaling pathway.

isocorydine; Siha cells; xenografts; protein expression

2017- 08- 08

2017- 11- 06

甘肅省科技支撐計(jì)劃(145RJZA160)

*通信作者(correspondingauthor)：wangfang4323@126.com

1001-6325(2018)01-0069-05

R73- 35+4

A