李圓圓 張 婧 韓慶姝 劉蘇雅 吳鳳芝 周新剛 劉守偉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

葉片衰老是葉片發(fā)育的最后一個階段，是營養(yǎng)物質(zhì)從老葉向新葉和種子轉(zhuǎn)移的復(fù)雜過程（Guiboileau et al.，2010；Zhang et al.，2012）， 其間伴隨著一系列生理生化變化，受生長發(fā)育時期和環(huán)境脅迫的誘導(dǎo)（孫玉瑩 等，2013）。黃瓜是我國種植范圍最廣、栽培面積最大的蔬菜種類之一（商慶梅 等，2010），葉片衰老是限制黃瓜長季節(jié)生產(chǎn)的重要因素（孫艷 等，2008），北方越冬栽培時的低溫寡照以及南方露地栽培的高溫，均可造成葉片提早衰老及秧苗壽命的縮短。多年來，人們對黃瓜葉片正常衰老過程中的外部形態(tài)特征（商慶梅，2009）及生理指標(biāo)（王利 等，2007）等方面進(jìn)行了相關(guān)研究，也探討了環(huán)境脅迫下與黃瓜葉片衰老相關(guān)的一些生理指標(biāo)的變化（晉曉彤，2009），提出了通過改善光質(zhì)（王虹 等，2010）、添加秸稈（高青海和王亞坤，2014）等措施可延緩黃瓜葉片衰老。研究表明，黃瓜伴生小麥具有控病促生的作用，能促進(jìn)黃瓜生長，提高產(chǎn)量，降低霜霉病和角斑病的發(fā)病率和病情指數(shù)（王東凱 等，2012），降低葉綠素和蛋白質(zhì)的降解速度，提高抗氧化酶活性，減緩黃瓜葉片衰老（高春琦和吳鳳芝，2014）。

糖是調(diào)控植物代謝和生長發(fā)育的重要信號物質(zhì)，糖代謝在植物衰老過程中起著非常重要的作用（雷美玉 等，2007）。研究表明，葉片衰老是由于細(xì)胞內(nèi)糖水平升高（Wingler et al.，2006）；衰老加劇了煙草和擬南芥葉片中糖的積累（Wingler et al.，2012），強(qiáng)光下培育的煙草和大麥，其離體葉片表現(xiàn)出黃化加劇和糖的積累（Krapp et al.，1991；Parrott et al.，2005），高水平的糖含量促進(jìn)了葉片衰老，說明糖代謝在一定程度上調(diào)控著葉片的衰老（Wingler et al.， 2006）?？梢?，糖代謝影響著植物的生長、發(fā)育以及衰老進(jìn)程。本試驗采用田間試驗，用小麥伴生黃瓜栽培，通過測定黃瓜同一葉片不同葉齡的糖代謝產(chǎn)物含量以及相關(guān)酶的活性，探明在小麥伴生栽培模式下，黃瓜葉片衰老過程中糖代謝相關(guān)指標(biāo)的變化情況，以期為小麥與黃瓜伴生栽培模式的應(yīng)用及進(jìn)一步開展黃瓜衰老問題的研究提供基本理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤為黃瓜多年連作土壤，基本化學(xué)性質(zhì)：銨態(tài)氮含量47.65 mg·kg-1，硝態(tài)氮149.66 mg·kg-1，速效磷 319.27 mg·kg-1，速效鉀 316.00 mg·kg-1，全氮 1.41 g·kg-1，全磷 1.43 g·kg-1，有機(jī)質(zhì) 68.38 g·kg-1，pH 7.7，EC 值 1.03 mS·cm-1。

主栽作物黃瓜（Cucumis sativusL.）品種津早9號，購自天津科潤黃瓜研究所。伴生作物小麥（Triticum aestivumL.）選用品資II-5，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院設(shè)施園藝與蔬菜生理生態(tài)研究室提供。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2017年4～7月在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站試驗實習(xí)基地大棚和園藝園林學(xué)院蔬菜生理生態(tài)實驗室進(jìn)行。

黃瓜常規(guī)育苗，兩葉一心時定植于大棚，株距30 cm，行距60 cm，壟作，每壟定植12株，單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，每處理3次重復(fù)，小區(qū)面積3 m2（5 m×0.6 m），小區(qū)兩側(cè)設(shè)保護(hù)行。定植黃瓜的同時播種小麥種子，采用穴播的方式，在黃瓜壟的一側(cè)，距黃瓜莖基部5 cm處播種40粒小麥種子。小麥生長到30 cm左右時刈割（此時黃瓜株高50 cm左右），留10 cm茬，以不影響黃瓜生長為準(zhǔn)。以黃瓜單作為對照。

待黃瓜幼苗長至三葉一心時，對第4片葉進(jìn)行葉齡（葉片伸出后天數(shù)）標(biāo)記，在第4片葉葉齡為20 d開始取第4、5片葉，每次選取長勢較一致的植株3株，每10 d取1次，共取5次，每次每重復(fù)取3株，一部分鮮樣用于可溶性糖、還原糖、葡萄糖和蔗糖含量的測定，一部分葉片保存于-80 ℃冰箱中用于蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶、中性轉(zhuǎn)化酶和酸性轉(zhuǎn)化酶活性的測定。

1.3 測定項目

1.3.1 糖含量測定 參考張志良等（2009）的方法：可溶性糖含量的測定采用蒽酮比色法；還原糖含量的測定采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法；葡萄糖含量的測定采用葡萄糖氧化酶法；蔗糖含量的測定采用Roe比色法。

1.3.2 酶活性測定 蔗糖合成酶（SS）活性的測定采用Rufly和Huber（1983）的方法；蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性的測定采用Zhun等（1997）的方法；中/酸性轉(zhuǎn)化酶（N/AI）活性的測定采用Merlo和Passera（1991）的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)的整理使用 Microsoft Excel（Office 2003）軟件，數(shù)據(jù)處理采用 SAS 9.2軟件的Turkey法進(jìn)行方差分析（P＜0.05），差異顯著性測驗采用t檢驗法。

2 結(jié)果與分析

2.1 伴生小麥對黃瓜葉片糖含量的影響

從表1可以看出，整個取樣時期黃瓜葉片可溶性糖含量變化總體呈先下降后上升趨勢。在黃瓜第4片葉葉齡為20、30 d時，伴生小麥處理和黃瓜單作的葉片可溶性糖含量均較高，在40 d時明顯下降；與單作相比，伴生小麥處理的黃瓜葉片中可溶性糖含量在第4片葉葉齡為30、50 d時分別顯著降低了14.06%和20.93%。

表1 伴生小麥對黃瓜葉片糖含量的影響

整個取樣時期黃瓜葉片還原糖、葡萄糖、蔗糖含量變化也呈先下降后上升趨勢（表1）。其中伴生小麥處理的黃瓜葉片還原糖含量在各時期均低于黃瓜單作（20 d除外），在黃瓜第4片葉葉齡為30、50 d時分別比單作顯著降低了7.01%和16.18%；伴生小麥處理的黃瓜葉片葡萄糖含量在各時期始終低于單作，在黃瓜第4片葉葉齡為30、50、60 d時分別比單作顯著降低了10.50%、13.61%和6.33%；在黃瓜第4片葉葉齡為20～50 d時，伴生小麥處理的黃瓜葉片中蔗糖含量分別比單作顯著降低了12.72%、28.30%、8.78%和12.62%。

2.2 伴生小麥對黃瓜葉片糖代謝關(guān)鍵酶活性的影響

從表2可以看出，伴生小麥處理的黃瓜葉片蔗糖合成酶活性在各時期均高于單作處理（60 d除外），在黃瓜第4片葉葉齡為30、40、50 d時分別比單作顯著提高了27.89%、33.97%和75.41%。

表2 伴生小麥對黃瓜葉片糖代謝關(guān)鍵酶活性的影響

伴生小麥處理的黃瓜葉片蔗糖磷酸合成酶活性、中性轉(zhuǎn)化酶活性、酸性轉(zhuǎn)化酶活性在各時期均高于單作處理（表2）。其中蔗糖磷酸合成酶活性在黃瓜第4片葉葉齡為30、40 d時分別比單作處理顯著提高了45.34%和23.33%，在黃瓜第4片葉葉齡為30 d時活性最高，達(dá)到130.92 mg·g-1·h-1；中性轉(zhuǎn)化酶活性在黃瓜第4片葉葉齡為20、60 d時分別比單作處理顯著提高了10.80%和5.42%；酸性轉(zhuǎn)化酶活性在黃瓜第4片葉葉齡為20、30、50 d時分別比單作處理顯著提高了7.95%、7.67%和6.33%。

3 結(jié)論與討論

3.1 伴生小麥對黃瓜葉片糖含量的影響

糖是調(diào)控植物代謝和發(fā)育的重要信號物質(zhì)，眾多研究表明可溶性碳水化合物在植物衰老過程中起到重要作用（Gibson，2005）。Holland等（2016）研究發(fā)現(xiàn)植株發(fā)育過程中碳水化合物的濃度誘導(dǎo)了植株的衰老，高濃度碳水化合物與衰老起始的發(fā)生有關(guān)（Parrott et al.，2005）。在煙草和擬南芥的研究中也發(fā)現(xiàn)衰老加劇了葉片中糖的積累（Wingler et al.，2012）。本試驗結(jié)果表明，伴生小麥栽培的黃瓜葉片可溶性糖與還原糖含量在黃瓜第4片葉葉齡為30、50 d時顯著低于單作，且蔗糖含量（60 d除外）以及葡萄糖含量（20 d與40 d除外）也顯著低于單作，說明伴生小麥栽培模式在一定程度上能夠降低這4種糖的積累，表明伴生小麥延緩黃瓜衰老可能是通過調(diào)節(jié)葉片內(nèi)的糖含量，增強(qiáng)了植株抵御外界不良環(huán)境的能力（Watanabe et al.，2013），從而達(dá)到延緩植株衰老的作用（Wingler et al.，2012）。

另外一些研究表明，糖積累是光合作用的主要抑制因子（Pego et al.，2000），能夠顯著抑制光合作用，加劇葉片衰老（Jang et al.，1997），而低糖含量則促進(jìn)光合作用與營養(yǎng)的循環(huán)利用，延緩植物葉片衰老（Rolland et al.，2002）。近年來，國內(nèi)外眾多研究也發(fā)現(xiàn)糖和激素之間存在相互作用，并對它們各自的代謝途徑產(chǎn)生影響。研究表明，較低濃度的葡萄糖和脫落酸促進(jìn)植物生長（Leon & Sheen，2003），高水平的葡萄糖和脫落酸共同參與了植物幼苗的生長停滯（Dekkers et al.，2008），而在植物體內(nèi)脫落酸和蔗糖以一種協(xié)調(diào)的方式相互作用積累儲存（Finkelstein & Gibson，2001）。本試驗中黃瓜植株伴生小麥后，可能通過對碳水化合物的調(diào)節(jié)進(jìn)而調(diào)控了葉片的衰老進(jìn)程，降低了糖在葉片中的積累，影響了植株激素水平，增強(qiáng)了黃瓜葉片的光合作用（高春琦和吳鳳芝，2014），與前人研究結(jié)果一致（Shi et al.，2016），這可能是伴生小麥延緩黃瓜葉片衰老的原因之一。伴生小麥后黃瓜葉片內(nèi)糖與光合作用以及激素的相互作用還有待研究。

3.2 伴生小麥對黃瓜葉片糖代謝關(guān)鍵酶活性的影響

植物葉片中蔗糖合成酶主要作用是催化蔗糖分解（Hoffmann-Thoma et al.，1996），其活性可作為庫強(qiáng)度的指示器（Schaffer & Petreikov，1997）。蔗糖磷酸合成酶活性反映蔗糖合成途徑的能力，較高的蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶活性反映了葉片將光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為蔗糖的能力（Halford et al.，2011）。本試驗結(jié)果表明，伴生小麥處理的黃瓜葉片蔗糖合成酶活性在黃瓜第4片葉葉齡為30、40、50 d時顯著高于單作，且在50 d時活性達(dá)到最高，說明在黃瓜葉片衰老的前中期蔗糖合成活動占主要地位；而伴生小麥處理的蔗糖磷酸合成酶活性在黃瓜第4片葉葉齡為30、40 d時顯著高于單作，且各處理在30 d時活性均達(dá)到最高，說明在黃瓜葉片衰老后期蔗糖降解比較活躍，在這一時期葉片內(nèi)蔗糖含量開始下降，且伴生小麥處理顯著低于單作，伴生小麥處理降低了黃瓜葉片蔗糖的積累，可能是增強(qiáng)了葉片對蔗糖的利用和運輸，促進(jìn)蔗糖的重新分配（Chen & Wang，2012）。說明伴生小麥后黃瓜葉片具有更強(qiáng)的源強(qiáng)度以確保把蔗糖高效地運輸?shù)綆旖M織，增強(qiáng)了對葉片糖代謝的調(diào)控，延緩了葉片的衰老。

植物體內(nèi)轉(zhuǎn)化酶主要有酸性轉(zhuǎn)化酶和中性轉(zhuǎn)化酶兩種形式（Koch，2004），其催化質(zhì)外體和細(xì)胞內(nèi)的蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖，參與蔗糖的分解代謝（Roitsch & Gonzalez，2004）。本試驗結(jié)果表明，伴生小麥處理后，黃瓜葉片中中性轉(zhuǎn)化酶活性在黃瓜第4片葉葉齡為20 d和60 d時顯著高于單作，酸性轉(zhuǎn)化酶活性在黃瓜第4片葉葉齡為20、30 d和50 d時顯著高于單作，說明在衰老的各個時期伴生小麥處理的黃瓜葉片均具有較強(qiáng)的蔗糖分解能力，促進(jìn)了葉片的糖代謝，延緩了葉片的衰老（Sebastian & Sofia，2016）。

綜觀以上數(shù)據(jù)，當(dāng)伴生小麥處理的黃瓜葉片轉(zhuǎn)化酶活性顯著高于單作時，葡萄糖和蔗糖含量卻低于單作，這可能是因為在這些時期，與單作相比，伴生小麥處理的黃瓜植株具有更活躍的轉(zhuǎn)化酶活性變化的同時，蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶的活性變化也同樣活躍，蔗糖的分解代謝和合成代謝都處于活躍狀態(tài)，使得伴生小麥處理后黃瓜葉片中糖這種能源物質(zhì)在保證葉片正常生長外，可能還源源不斷地向植株其他部位進(jìn)行轉(zhuǎn)移以提供能量，保持植株整體更健康的生長，從而有利于延緩衰老。由單一因素誘導(dǎo)的衰老已有諸多研究，而這些途徑與植物發(fā)育和內(nèi)源信號感知途徑之間的交叉作用的研究卻很少（Guo & Gan，2012）。伴生小麥對黃瓜葉片糖代謝的影響可能是伴生小麥對植株體內(nèi)各項生理活動的調(diào)控，影響糖和光合作用、糖和激素等的相互作用（Fareen et al.，2016）；另一個更深層次的原因可能是由于伴生小麥后，小麥根系分泌物直接或間接改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性（吳鳳芝 等，2014），進(jìn)而提高作物的養(yǎng)分利用效率，促進(jìn)伴生作物的生長（Wu et al.，2016），而這些過程可能會直接或間接影響伴生作物葉片中糖含量以及與糖代謝相關(guān)的酶活性，從而調(diào)控了葉片的糖代謝過程，延緩葉片的衰老。具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。綜上所述，本試驗通過對伴生小麥條件下黃瓜葉片衰老期間不同糖含量、相關(guān)酶活性的分析，表明伴生小麥通過降低了黃瓜葉片內(nèi)糖的積累，增強(qiáng)了糖代謝關(guān)鍵酶活性，從而提高了葉片糖代謝能力，延緩了黃瓜葉片的衰老。

高春琦，吳鳳芝．2014．伴生小麥對黃瓜生長及生理指標(biāo)的影響．中國蔬菜，（10）：24-28．

高青海，王亞坤．2014．作物秸稈對黃瓜衰老中根系活力和葉片氮代謝的影響．干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，（6）：32．

晉曉彤．2009．高溫、強(qiáng)光、氮營養(yǎng)脅迫對黃瓜幼苗衰老的影響〔碩士論文〕．天津：天津大學(xué)．

雷美玉，李輝亮，劉立元，彭世清．2007．糖在植物中的感知與信號傳導(dǎo)研究進(jìn)展．西北植物學(xué)報，27（10）：2118-2127．

商慶梅．2009．黃瓜衰老特征特性研究〔碩士論文〕．哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)．

商慶梅，秦志偉，周秀艷．2010．黃瓜植株衰老過程中根系內(nèi)生理生化指標(biāo)變化．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，41（9）：27-30．

孫艷，梁宇柱，陳敬東．2008．黃瓜葉片衰老過程中抗壞血酸含量與生理指標(biāo)關(guān)系的研究，西北植物學(xué)報，28（3）：512-516．

孫玉瑩，畢京翠，趙志超．2013．作物葉片衰老研究進(jìn)展．作物雜志，（4）：11-19．

王東凱，楊威，劉博．2012．不同栽培方式對設(shè)施黃瓜主要病害及品質(zhì)的影響．北方園藝，（9）：10-13．

王虹，姜玉萍，師愷．2010．光質(zhì)對黃瓜葉片衰老與抗氧化酶系統(tǒng)的影響．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，43（3）：529-534．

王利，張亞紅，郭文忠．2007．黃瓜博耐13-b葉片衰老機(jī)理研究．農(nóng)業(yè)科學(xué)研究，28（4）：12-15．

吳鳳芝，李敏，曹鵬，馬亞飛，王麗麗．2014．小麥根系分泌物對黃瓜生長及土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響．應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，25（10）：2861-2867．

張志良，瞿偉菁，李小方．2009．植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)．北京：高等教育出版社：103-107．

Chen H J，Wang S J．2012．Abscisic acid enhances starch degradation and sugar transport in rice upper leaf sheaths at the post-heading stage．Acta Physiologiae Plantarum，34（4）：1493-1500．

Dekkers，B，Schuurmans J，Smeekens S．2008．Interaction between sugar and abscisic acid signaling during early seedling development inArabidopsis．Plant Mol Boil，67：151-167．

Fareen S，Mohammad Y，Mohammad F，Ahmad F，Shamsul H．2016．Role of sugars under abiotic stress．Plant Physiology and Biochemistry，109：54-61．

Finkelstein R，Gibson S．2001．ABA and sugar interactions regulating development：crosstalk or voices in a crowd? Plant Biol，5：26-32．

Gibson S I．2005．Control of plant development and gene expression by sugar signaling．Plant Biol，8：93-102．

Guiboileau A，Sormani R，Meyer C，Masclaux-Daubresse C．2010．Senescence and death of plant organs：nutrient recycling and developmental regulation．Plant Biol，333：382-391．

Guo Y，Gan S S．2012．Convergence and divergence in gene expression profiles induced by leaf senescence and 27 senescence-promoting hormonal，pathological and environmental stress treatments．Plant Cell and Environment，35：644-655．

Halford N G，Curtis T Y，Muttucumaru N，Postles J，Mottram D S．2011．Sugars in crop plants．Ann Appl Biol，158：1-25．

Hoffmann-Thoma G，Hinkel K，Nicolay P，Willenbrink J．1996．Sucrose accumulation in sweet sorghum stem internodes in relation to growth．Physiol Plant，97：277-284．

Holland V，F(xiàn)ragner L，Jungcurt T，Weckwerth W，B rü ggemann W．2016．Girdling interruption between source and sink in Quercus pubescens does not trigger leaf senescence．Photosynthetica，54（4）：589-597．

Jang J，Leon P，Zhou L，Sheen J．1997．Hexokinase as a sugar sensor in higher plants．Plant Cell，9：15-19．

Koch K．2004．Sucrose metabolism：regulatory mechanisms and pivotal roles in sugar sensing and plant development．Curr Opin Plant Biol，7：235-246．

Krapp A，Quick W P，Stitt M．1991．Ribulose-1，5-biphosphate carboxylase/oxygenase，other Calvin enzymes，and chlorophyll decrease when glucose is supplied to mature spinach leaves via the transpiration stream．Planta，186：58-69．

Leon P，Sheen J．2003．Sugar and hormone connections．Trends Plant Sci，8：1360-1385．

Merlo L，Passera C．1991．Change in carbohydrate and enzyme levels during development of leaves ofPrunus persica，a sorbitol synthesizing species．Plant Physiol，83：621-626．

Parrott D，Yang L，Shama L，F(xiàn)ischer A M．2005．Senescence is accelerated，and several proteases are induced by carbon ‘feast’conditions in barley（Hordeum vulgareL．）leaves．Planta，222：989-1000．

Pego J，Kortstee A，Huijser C，Smeekens S．2000．Photosynthesis，sugars and the regulation of gene expression．J Exp Bot，51：407-416．

Roitsch M C，Gonzalez M C．2004．Function and regulation of plant invertases：sweet sensations．Trends Plant Sci，9：606-613．

Rolland F，Moore B，Sheen J．2002．Sugar sensing and signaling in plants．Plant Cell，14：185-205．

Rufly T W，Huber S C．1983．Changes in starch formation and activities of sucrose phosphate synthase and cytoplasmic fructose-1，6-biosphatase in response to source-sink alterations．Plant Physiol，72（2）：474-478．

Schaffer A A，Petreikov M．1997．Sucrose-starch metabolism in tomato fruit undergoing transient starch accumulation．Plant Physiol，113：739-746．

Sebastian M，Sofia B L．2016．Integrating transcriptomic and metabolomic analysis tounderstand natural leaf senescence in sun fl ower．Plant Biotechnology Journal，14：719-734．

Shi H，Wang B，Yang P，Li Y，Miao F．2016．Differences in sugar accumulation and mobilization between sequential and nonsequential senescence wheat cultivars under natural and drought conditions．PLoS One，11：155-166．

Watanabe M，Balazadeh S，Tohge T，Erban A，Giavalisco P，Kopka J，Mueller-Roeber B，F(xiàn)ernie A R，Hoefgen R．2013．Comprehensive dissection of spatiotemporal metabolic shifts in primary，secondary，and lipid metabolism during developmental senescence inArabidopsis．Plant Physiol，162：1290-1310．

Wingler A，Purdy S，MacLean J A，Pourtau N．2006．The role of sugars in integrating environmental signals during the regulation of leaf senescence．J Exp Bot，57：391-399．

Wingler A，Dellate T，O’Hara L，Premavesi L，Jhurreea D，Paul M，Schluepmann H．2012．Trehalose 6-phosphate is required for the onset of leaf senescence associated with high carbon availability．Plant Physiol，158：1241-1251．

Wu X，Wu F，Zhou X，F(xiàn)u X，Tao Y，Xu W，Pan K，Liu S．2016．Effects of intercropping with potato onion on the growth of tomato and rhizosphere alkaline phosphatase genes diversity．Front Plant Sci，7：846．

Zhang C，Liu M，F(xiàn)u J X．2012．Exogenous sugars involvement in senescence and ethylene production of tree peony ‘Luoyang Hong’cut flowers．Korean Journal of Horticultural Science & Technology，30（6）：718-724．

Zhun Y J，Komor E，Moore P H．1997．Surose accumulation in the sugarcane stem is regulared by the difference between the activities of soluble acid invertase and sucrose phosphate synthase．Plant Physiol，115：609-616．