周瑞澤, 周 雅, 毛 婷, 姜 潔

(北京市食品安全監(jiān)控和風險評估中心, 北京 100094)

廣義上來說,奶油包括天然奶油和人造奶油。天然奶油是以乳為原料加工而成的乳制品,根據含脂量的不同可分為稀奶油和黃油[1],同時含有蛋白質、維生素、礦物質等多種營養(yǎng)成分[2,3]。人造奶油指食用油脂加水和其他輔料乳化后,經速冷捏和或不經速冷捏和而制成的可塑性或流動性的產品,其中的脂肪含量不低于80%[4],包含植脂奶油和人造黃油(又稱麥淇淋)。人造奶油有來源穩(wěn)定、原料成本低廉、用途與天然奶油相近的特點[5]。近年來,隨著我國經濟增長和人們生活水平的提高,國內對奶油的消費量大幅增加。研究表明,人造奶油的制作中經過氫化處理,會產生反式脂肪酸,從而對人體健康造成一定的危害[6,7]。由于不同種類的奶油以及同一種類但來源不同的奶油中所含脂肪酸種類、含量有一定差異[8,9],因此建立奶油中脂肪酸組成和含量的分析方法,獲取不同種類奶油的特征脂肪酸標識物,對于確保奶油的質量安全、減少奶油的摻假偽劣等都有重要意義。

目前有關奶油中脂肪酸組成檢測中常見的儀器分析方法有氣相色譜法[10]、氣相色譜- 質譜法[11]、核磁共振法[12]、拉曼光譜法[13]、紅外光譜法[14]和分子熒光光譜法[15]等。這些方法常見于高含量脂肪酸成分的分析,但是由于奶油中脂肪成分復雜,且有許多脂肪酸的含量較低,使用上述方法較難對奶油中的所有脂肪酸做進一步的鑒別區(qū)分。近年來發(fā)展的全二維氣相色譜- 質譜(GC×GC- MS)技術具有峰容量大、靈敏度高、分離度好等特點,已被廣泛運用到復雜基質成分分析等領域[16-19]。但采用GC×GC- MS進行奶油中脂肪酸成分分析的研究未見報道。本研究建立了天然奶油和人造奶油中脂肪酸成分的GC×GC- MS定性定量分析方法,一些奶油中的微量脂肪酸成分也得到了識別。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

QP2010Ultra GC×GC- MS儀(日本島津公司) 配ZX1冷噴調制器(美國Zoex公司); 7890A氣相色譜儀配氫火焰離子檢測器(FID)、DB- 5毛細管氣相色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)購自美國Agilent公司; BPX- 50毛細管氣相色譜柱(2.5 m×0.1 mm×0.1 μm,美國SGE公司)。一維數據采集由GC- MS solution 4.2軟件完成,二維數據采集由GC Image R 2.5軟件完成。

37種混合脂肪酸甲酯標準品(純度≥99.0% )購自美國NU- CHEK公司;甲苯、正己烷和甲醇(均為色譜級)購自美國Thermo Fisher公司;乙酰氯(色譜級)購自德國CNW公司。其他試劑均為國產分析純。

稀奶油、植脂奶油、黃油和麥淇淋均為市售商品。

1.2 實驗步驟

1.2.1樣品制備

奶油中脂肪酸的衍生參考國標方法[20]進行,簡述如下:準確稱取奶油試樣0.2 g于15 mL干燥螺口玻璃管中,加入5.0 mL甲苯和6 mL乙酰氯- 甲醇(1∶9,v/v)溶液,充氮氣后振蕩混合,于(80±1) ℃水浴中放置2 h,期間每隔20 min取出振搖1次,水浴后取出冷卻至室溫。將反應后的樣液轉移至50 mL離心管中,分別用3 mL碳酸鈉溶液清洗玻璃管3次,合并碳酸鈉溶液于50 mL離心管中,混勻,以5 000 r/min的速度離心5 min,取上清液作為試液待測。

1.2.2標準溶液的配制

稱取適量混合脂肪酸甲酯標準品,用正己烷稀釋定容,儲存于-10 ℃以下冰箱。

1.3 儀器條件

1.3.1GC

色譜柱:HP- 88毛細管氣相色譜柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm,美國Agilent公司);進樣口溫度:250 ℃;進樣量:1μL;分流比:30∶1。升溫程序:130 ℃保持1 min,以6.5 ℃/min的速率升溫至170 ℃,然后以2.75 ℃/min的速率升溫至205 ℃,保持15 min,再以2.75 ℃/min的速率升溫至215 ℃,保持5 min,最終以4 ℃/min的速率升溫至230 ℃,保持6 min。FID溫度:270 ℃;氫氣流量:30 mL/min;空氣流量:300 mL/min。

1.3.2GC×GC- MS

氣相色譜參數:一維色譜柱為DB- 5毛細管氣相色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);二維色譜柱為BPX- 50毛細管氣相色譜柱(2.5 m×0.1 mm×0.1 μm)。進樣口溫度:250 ℃;進樣量:1 μL;分流比:100∶1;恒線速度模式:80.8 cm/s。升溫程序:50 ℃保持2 min,以20 ℃/min的速率升溫至180 ℃,然后以2.5 ℃/min的速率升溫至250 ℃,再以3 ℃/min的速率升溫至300 ℃,保持5 min。

質譜參數:掃描范圍為m/z40～385;電子轟擊(EI)源為70 eV;離子源溫度為200 ℃;傳輸線溫度為300 ℃;冷氣流量為6 L/min;熱氣溫度為350 ℃;調制周期為5 s;熱噴時間為400 ms;溶劑延遲時間為6 min。其他質譜參數見表1。

表 1 37種化合物的保留時間、基峰離子及特征離子

Retention I: retention time of the 1st dimensional chromatography; Retention II: retention time of the 2nd dimensional chromatography.

2 結果與討論

2.1 GC×GC- MS條件優(yōu)化

2.1.1載氣控制模式的選擇

色譜分離系統的第一維選用DB- 5型弱極性色譜柱,柱長為30 m,膜厚為0.25 μm;第二維選用BPX- 50型中等極性色譜柱,柱長為2.5 m,膜厚為0.1 μm,柱長與膜厚均比第一維色譜柱小很多,該柱系統可有效分離奶油中的脂肪酸。在此基礎上,比較了不同載氣控制模式(恒壓模式和恒線速度模式)的分離效果(見圖1)。結果表明,在15～28 min,恒線速度模式下C10～C15的脂肪酸甲酯分布更均勻;而在34～54 min, C18和C20類脂肪酸甲酯在恒線速度模式下分離效果更好。因此選擇恒線速度模式。

圖 1 不同載氣控制模式下37種化合物的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the 37 compounds in different carrier gas control modes

2.1.2升溫程序的優(yōu)化

選擇合適的柱溫是實現各種脂肪酸良好分離的關鍵。為保證目標物從一維柱流出后能被有效切割3次以上,程序升溫的速率不能太大,一般為0.5～5 ℃/min[21]。由于奶油中的脂肪酸組成多大于8個碳原子,大部分均在180 ℃以后出峰,因此本試驗選擇以較大的升溫速率10 ℃/min升至180 ℃,再以較小的速率2 ℃/min升溫,色譜條件如下:60 ℃始溫保持2 min,以10 ℃/min的速率升溫至180 ℃,保持2 min后再以2 ℃/min的速率升溫至300 ℃,保持10 min。結果顯示,雖然脂肪酸組分分離完全,但整個程序持續(xù)86 min,耗時太長(見圖2a)。由于37種脂肪酸的相對分子質量、熔點和沸點分布范圍較廣,很難用簡單的升溫程序得到最佳分離效果。在確保分離度的前提下,通過仔細調節(jié)色譜柱升溫程序,發(fā)現多階升溫程序對脂肪酸有很好的分離效果。最終確定的升溫程序為:50 ℃始溫保持2 min,以20 ℃/min的速率升溫至180 ℃,然后以2.5 ℃/min的速率升溫至250 ℃,再以3 ℃/min的速率升溫至300 ℃,保持5 min。整個檢測過程僅需58 min,且奶油中的脂肪酸組成檢測完全,分離效果好,分布也更均勻(見圖2b)。

圖 2 不同升溫程序下37種化合物的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of the 37 compounds with different temperature programs a. chromatography of 86 min: 60 ℃, held for 2 min; increased to 180 ℃ at 10 ℃/min, held for 2 min; increased to 300 ℃ at 2 ℃/min, held for 10 min; b. chromatography of 58 min: 50 ℃, held for 2 min; increased to 180 ℃ at 20 ℃/min, increased to 250 ℃ at 2.5 ℃/min; increased to 300 ℃ at 3 ℃/min, held for 5 min.

2.1.3調制解調器參數的優(yōu)化

調制解調器是二維色譜的核心部件,包含冷噴氣和熱噴氣。在二維色譜運行過程中,冷噴氣持續(xù)釋放,熱噴氣脈沖式噴射,前后兩次熱噴之間的時間間隔稱為調制周期[22],每次熱噴氣釋放的時間稱為熱噴時間[23]。

本試驗考察了不同調制周期(3、4、5和6 s)對分離度的影響。如圖3所示,調制周期對目標物在二維色譜上的分離情況和信號強度有重要的影響,尤其是對同分異構體化合物如亞油酸甲酯、反式亞油酸甲酯、γ- 亞麻酸甲酯、油酸甲酯和反式油酸甲酯。調制周期為3 s時,γ- 亞麻酸甲酯和油酸甲酯被分割在多個調制周期,導致信號強度降低;調制周期為6 s時,5種化合物因保留時間超過調制周期導致共流出;調制周期為4和5 s時,5種化合物二維譜圖輪廓清晰,分離效果好。另外,通過比較發(fā)現調制周期為5 s時的三維輪廓圖峰形較4 s時更好,目標物基本不拖尾(見圖4)。

圖 4 不同調制周期的三維輪廓圖Fig. 4 Three dimensional profiles at different modulation periods

冷噴氣流量的大小與目標物沸點有關,對于C4～C40的化合物來說,其所需冷氣量隨碳數增加逐漸降低,一般為15.5～1.5 L/min[24]。通過觀察本研究中的目標物在不同冷氣流量條件下的一維色譜峰是否被切開,確定冷氣流量為6 L/min。

考察發(fā)現熱噴時間(350、400和450 ms)的加大并不能明顯改善分離效果,信號強度雖有所增大,但仍在同一數量級,因此選擇400 ms的熱噴時間。

2.1.4掃描范圍的確定

由于二維色譜峰峰形較窄,為提高分析靈敏度及定性定量的準確度,需要選擇盡量窄的質譜掃描范圍。由于丁酸、己酸、辛酸和癸酸等低碳數脂肪酸屬于奶油中的重要風味化合物,且質荷比41和43的碎片離子為脂肪酸甲酯的常見碎片離子,為保證譜圖的完整性,起始掃描質荷比設為40。而本研究考察的37種脂肪酸化合物中相對分子質量最大的為C24∶0,其甲酯化合物分子離子峰的質荷比為382,因此選擇385作為掃描的最大質荷比。各化合物的保留時間及特征離子見表1。

2.2 靈敏度的考察

圖 5 月桂酸甲酯在(a)GC- FID和(b)GC×GC- MS上的靈敏度Fig. 5 Sensitivities of C12∶0 by (a) GC- FID and (b) GC×GC- MS

本研究比較了優(yōu)化條件下脂肪酸甲酯在二維色譜GC×GC- MS和傳統一維色譜GC- FID上靈敏度的差異(見圖5)。其中圖5a為月桂酸甲酯在一維色譜上的響應情況,圖5b為月桂酸甲酯在二維色譜上的響應情況。月桂酸甲酯在二維色譜上被調制成3個碎片峰,其信號響應強度比一維色譜提高了10倍以上,信噪比比一維色譜提高了90倍以上,該結果與文獻[22]報道吻合。

2.3 定性和定量分析方法

本研究中37種脂肪酸化合物的定性分析主要通過將混合標準品的全掃描二維譜圖中各峰點質譜圖導入NIST譜庫檢索而實現;對于譜圖相近、無法識別的同分異構體則通過單一標準品進樣的方式進行判定。結果表明,所有化合物都得到了較好的分離,未發(fā)現在二維色譜上出現重組的現象;各化合物的色譜保留時間規(guī)律與質譜特征也與吳惠勤等[25]的描述一致。由于本研究旨在確定不同奶油中脂肪酸組成的差異,考慮到脂肪酸同系物的響應值相近,可用面積歸一化定量法測定各脂肪酸的相對含量來表示其含量。

2.4 實際樣品分析

選取包括稀奶油、植脂奶油、黃油和麥淇淋的4種奶油樣品進行檢測,結果見表2。由表2可知,天然奶油與人造奶油所含脂肪酸組成差異顯著。稀奶油、黃油及植脂奶油均以飽和脂肪酸為主,含量分別為51.72% ～98.96% ;其中植脂奶油的總飽和脂肪酸含量最高,為98.63% ～98.96% 。而麥淇淋則以不飽和脂肪酸為主,總含量為59.55% ～69.61% ;其中單不飽和脂肪酸總含量低于多不飽和脂肪酸總含量。

表 2 不同樣品中脂肪酸的含量

ND: not detected.

天然奶油以牛乳脂為主要原料,其脂肪酸組成與牛乳相似,含有丁酸、己酸、辛酸、癸酸等特征碳鏈脂肪酸[26],也包括本文檢出的肉豆蔻油酸、十五碳一烯酸、十七碳一烯酸等微量脂肪酸,這類風味物質可用于區(qū)別人造奶油。即便同為天然奶油,稀奶油和黃油因其原料乳受牧草生長、飼料來源、奶牛年齡和泌乳期的影響[27],脂肪酸組成也不盡相同。植脂奶油多以氫化棕櫚仁油為原料,其脂肪酸以飽和脂肪酸為主,常見的不飽和脂肪酸如十八碳烯酸、二十碳烯酸和二十二碳烯酸基本未檢出,而高含量的肉豆蔻酸和硬脂酸可作為特征組成的依據;說明植脂奶油在制備過程中,增加了飽和脂肪酸的含量,該結果與加工工藝吻合[9]。麥淇淋則是以植物油為主要原料的人造奶油,其脂肪酸組成與植物油類似,一般為10～22碳脂肪酸[28],且不飽和脂肪酸含量較高。與其他奶油相比,麥淇淋中的亞油酸和花生酸的相對含量較高,十四碳以下脂肪酸的含量最少,該結果與文獻描述相近[29]。

3 結論

本文建立了GC×GC- MS分析奶油中脂肪酸組成的方法,實現了食品復雜基質中脂肪酸的有效分離和準確認定。相較于傳統的GC- FID法,本方法定性更準確,有助于根據脂肪酸種類及含量的不同進一步區(qū)分天然奶油和人造奶油。將本方法應用到市售奶油樣品的檢測中,其中常規(guī)脂肪酸的檢測結果與傳統方法一致,而且檢出成分更豐富,為今后奶油品質評價、摻假鑒別等食品安全保障工作提供了有力的技術支撐。

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