徐艷華 金 剛 巴圖德力根 蘇日古嘎 孫德志

1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院 (內(nèi)蒙古 通遼，028007)2.內(nèi)蒙古呼倫貝爾市新巴爾虎右旗結(jié)核病防治所

肝纖維化是慢性肝炎發(fā)展至肝硬化的早期可逆階段。目前，組織病理檢查是診斷肝纖維化的金指標(biāo)[1]。肝纖維化相關(guān)病理切片染色方法多樣，根據(jù)各種染色的著色部位不同，其觀察重點(diǎn)各異。本研究通過建立肝纖維化模型，肝組織取材，對HE染色、彈力膠原纖維染色、網(wǎng)狀纖維染色、Masson(馬松)三色染色、天狼星紅染色等染色方法進(jìn)行比對研究，探討各種染色在肝纖維化組織病理診斷中的特殊意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級Wistar雄性大鼠16只，吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重180～220g。動(dòng)物質(zhì)量合格證號SCXK(吉)-2013-0002。顆粒飼料購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。純凈水購自通遼市康樂純凈水公司。

1.1.2 試劑 蘇木精、伊紅、氨水、麗春紅、維多利亞藍(lán)B、苦味酸、硫酸鐵銨、高錳酸鉀、草酸、硫代硫酸鈉、硝酸銀、氫氧化鈉、氯化金、天狼星紅、天青石藍(lán)B、酸性品紅、甘油、中性樹膠、無水乙醇等，均為國產(chǎn)試劑(分析純)。

1.1.3 儀器 EG1150H包埋機(jī)、RM2235切片機(jī)(德國Leica公司)；DM2500光學(xué)顯微鏡(含偏光鏡)(Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠肝纖維化模型建立[2]Wistar雄性大鼠16只，分為正常對照組8只和模型組8只。模型組大鼠腹腔注射30%CCl4橄欖油溶液1次/4天，注射劑量2.0ml/kg (注射劑量/大鼠體重)，連續(xù)7次，建立肝纖維化模型。于第7次造模后48h處死大鼠取肝組織固定于10%中性福爾馬林中4h取出，常規(guī)乙醇逐級脫水、二甲苯透明、浸石蠟缸Ⅰ和Ⅱ、石蠟包埋；連續(xù)切片(厚度4um)、攤片、烤片、烘片，常規(guī)二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇至水洗。

1.2.2 肝組織切片進(jìn)行HE染色 二甲苯Ⅰ脫蠟15min-二甲苯Ⅱ脫蠟15min-100%乙醇吸取二甲苯10min-95%乙醇2min-90%乙醇2min-85%乙醇2min-蒸餾水洗2min-蘇木精染色5min-自來水沖洗1min-1%鹽酸酒精分化(提插數(shù)下)-自來水沖洗1min-伊紅染色3min-自來水洗30s-95%乙醇Ⅰ 1min-95%乙醇Ⅱ 1min-100%乙醇Ⅰ 1min-100%乙醇Ⅱ 1min-二甲苯Ⅰ 15min-二甲苯Ⅱ 15min-中性樹脂封固。觀察肝細(xì)胞變性、壞死、炎細(xì)胞浸潤等，評分并分級。

1.2.3 肝組織切片進(jìn)行彈力膠原纖維染色 二甲苯Ⅰ脫蠟15min-二甲苯Ⅱ脫蠟15min-100%乙醇吸取二甲苯10min-95%乙醇2min-90%乙醇2min-85%乙醇5min-70%乙醇7min-維多利亞藍(lán)B 8min-95%乙醇1min-蒸餾水洗3min-麗春紅滴染5min-100%乙醇5min-二甲苯Ⅰ 10min-二甲苯Ⅱ 5min-中性樹脂封固。觀察肝臟匯管區(qū)膠原纖維沉積量及程度，進(jìn)行評分纖維化分期。

1.2.4 肝組織切片進(jìn)行Masson(馬松)三色染色[3]二甲苯Ⅰ脫蠟15min-二甲苯Ⅱ脫蠟15min-100%乙醇吸取二甲苯10min-95%乙醇2min-90%乙醇2min-85%乙醇2min-蒸餾水洗2min-Bouin液56℃ 1h-流水沖洗至無色-天青石藍(lán)染液5min-蘇木精染色5min-自來水沖洗1min-1%鹽酸酒精分化(提插數(shù)下)-自來水沖洗2min-麗春紅酸性品紅染液10min-蒸餾水洗2min-1%磷鉬酸5min-亮綠5min-1%冰醋酸5min-95%乙醇Ⅰ 1min-95%乙醇Ⅱ 1min-100%乙醇Ⅰ 1min-100%乙醇Ⅱ 1min-二甲苯Ⅰ 15min-二甲苯Ⅱ 15min-中性樹脂封固。觀察肝臟匯管區(qū)膠原纖維沉積量及程度，進(jìn)行評分纖維化分期。

1.2.5 肝組織切片進(jìn)行網(wǎng)狀纖維染色 二甲苯Ⅰ脫蠟15min-二甲苯Ⅱ脫蠟15min-100%乙醇吸取二甲苯10min-95%乙醇2min-90%乙醇2min-85%乙醇2min-蒸餾水洗2min-0.25%高錳酸鉀2min-蒸餾水洗2min 2%草酸2min-蒸餾水洗2min-2%硫酸鐵銨10min-蒸餾水洗2min-氨銀液滴染5min-蒸餾水洗2min2%硫代硫酸鈉2min-蒸餾水洗2min-100%乙醇5min-二甲苯Ⅰ 15min-二甲苯Ⅱ 15min-中性樹脂封固。觀察肝臟匯管區(qū)網(wǎng)狀纖維融合、塌陷程度，進(jìn)行評分纖維化分期。

1.2.6 肝組織切片進(jìn)行天狼星紅染色[4]二甲苯Ⅰ脫蠟15min-二甲苯Ⅱ脫蠟15min-100%乙醇吸取二甲苯10min-95%乙醇2min-90%乙醇2min-85%乙醇2min-蒸餾水洗2min-天青石藍(lán)5min-蒸餾水洗2min-苦味酸天狼星紅30min-100%乙醇5min-二甲苯Ⅰ 15min-二甲苯Ⅱ 15min-中性樹脂封固。Leica DM2500偏光鏡下觀察肝臟匯管區(qū)膠原纖維沉積量及程度，進(jìn)行評分纖維化分期，同時(shí)對膠原纖維進(jìn)行分型，區(qū)分Ⅰ、Ⅲ型膠原含量。

2 結(jié)果

2.1 HE染色 細(xì)胞核呈藍(lán)色，胞漿和其他組織成分呈現(xiàn)出深淺不一的紅色，肌纖維呈現(xiàn)紅色、紅細(xì)胞呈朱紅色、嗜酸性顆粒橙紅色。正常組肝臟切片組織結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為，肝小葉為類圓形，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，呈不規(guī)則形，匯管區(qū)周圍肝細(xì)胞多邊形，核圓形藍(lán)色位于細(xì)胞中央，胞質(zhì)紅色，肝細(xì)胞成條索狀排列形成肝板，肝板之間的空隙為肝血竇。為正常肝組織結(jié)構(gòu)，見插頁圖A。模型組肝臟切片組織結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為，中央靜脈缺如、肝小葉及匯管區(qū)結(jié)構(gòu)不明顯，有大量的膠原纖維生成，相互連接，包繞著肝細(xì)胞群，形成環(huán)形形態(tài)、形狀不一的假小葉結(jié)構(gòu)；假小葉結(jié)構(gòu)中的肝細(xì)胞散在，索狀排列不明顯，間隙大，肝臟切片呈現(xiàn)大面積假小葉組織結(jié)構(gòu)，屬壞死后肝硬變，肝細(xì)胞內(nèi)可見明顯的圓形空泡，為脂肪變性所致，假小葉周邊的肝細(xì)胞可見明顯的嗜酸性變和氣球樣變，假小葉周邊的纖維組織內(nèi)可伴有明顯的出血改變，見插頁圖B。

2.2 彈力膠原纖維染色 膠原呈紅色，肌肉、神經(jīng)膠質(zhì)呈黃色，細(xì)胞核呈藍(lán)綠色。正常組膠原纖維少見，只局限于血管壁周圍，屬正常范圍，見插頁圖C。模型組肝組織內(nèi)大量膠原纖維沉積，匯管區(qū)周圍膠原纖維沉積，纖維條索較粗且染色著色較深，表明膠原纖維較多，包裹，已形成假小葉，見插頁圖D。

2.3 Masson(馬松)三色染色 膠原呈藍(lán)色，胞質(zhì)、肌纖維、紅細(xì)胞呈紅色，胞核藍(lán)褐色。正常組血管壁周圍可見少量膠原纖維，屬正常范圍，見插頁圖E。模型組肝組織內(nèi)大量膠原纖維沉積，呈藍(lán)色，自匯管區(qū)周圍向外延伸，纖維條索較粗且染色著色較深，表明膠原纖維較多，包裹，已形成假小葉，見插頁圖F。

2.4 網(wǎng)狀纖維染色 網(wǎng)狀纖維呈黑色、膠原纖維呈深黃色。正常組網(wǎng)狀纖維呈絮網(wǎng)狀均勻分布于肝組織中，未見網(wǎng)狀纖維增粗、網(wǎng)狀纖維融合、塌陷。見插頁圖G。模型組肝組織內(nèi)網(wǎng)狀纖維失去正常分布狀態(tài)，自匯管區(qū)周圍網(wǎng)狀纖維塌陷、融合、增粗、包裹并已形成假小葉，見插頁圖H。

2.5 天狼星紅染色 Ⅰ型膠原纖維緊密排列，顯示很強(qiáng)的雙折光性，為黃色或紅色的纖維，Ⅱ型膠原顯示弱的雙折光性，呈多種顏色的疏松網(wǎng)狀分布；Ⅲ型膠原纖維為疏網(wǎng)狀，顯示弱的雙折光性，為綠色的細(xì)纖維；Ⅳ型膠原纖維顯示弱的雙折光性的基膜，呈淡黃色。正常組膠原纖維緊局限于匯管區(qū)血管壁，偏光鏡下觀察可見紅色Ⅰ型膠原纖維、少量疏網(wǎng)狀Ⅱ型膠原纖維、綠色Ⅲ型膠原和少量淡黃色Ⅳ型膠原纖維，屬正常含量范圍，見插頁圖1。模型組各型膠原纖維自匯管區(qū)向外擴(kuò)展，偏光鏡下觀察可見膠原沉積、擴(kuò)展已形成假小葉，其中大量紅色Ⅰ型膠原纖維、綠色Ⅲ型膠原，少量疏網(wǎng)狀Ⅱ型膠原纖維和淡黃色Ⅳ型膠原纖維，見插頁圖J。

3 討論

HE染色著重評價(jià)細(xì)胞變性、壞死等形態(tài)改變。彈力膠原纖維染色針對纖維化肝組織，重點(diǎn)著色為膠原、肌肉、神經(jīng)膠質(zhì)，一般細(xì)胞核不易著色。Masson染色對膠原、胞質(zhì)、肌纖維、紅細(xì)胞進(jìn)行染色。網(wǎng)狀纖維染色對肝組織網(wǎng)狀纖維、膠原纖維進(jìn)行染色，但氨銀顆粒對背景影響較大，根據(jù)查閱文獻(xiàn)及反復(fù)比較實(shí)驗(yàn)，對此進(jìn)行優(yōu)化，氨銀液處理后應(yīng)用蒸餾水沖洗，以免自來水中的雜質(zhì)、氫離子與氨銀液反應(yīng)。氨銀液染色后染液不能倒掉，需直接用大流量自來水快速?zèng)_洗[5,6]，避免多余的銀顆粒沉淀在組織和玻片上，同時(shí)此步驟容易出現(xiàn)脫片現(xiàn)象，為避免脫片盡量使用防脫片載玻片，或?qū)ζ胀ㄝd玻片進(jìn)行3%明膠浸泡處理。天狼星紅是一種很強(qiáng)的酸性染料，每個(gè)分子內(nèi)含有6 個(gè)磺酸基，可以和膠原分子堿性氨基酸反應(yīng)，有較強(qiáng)的雙折光現(xiàn)象，較好的提高Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型膠原的分辨率，在實(shí)驗(yàn)需要時(shí)可以對Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型膠原進(jìn)行定量分析。天狼星紅又是一種長型展開的分子與膠原分子吸附反應(yīng)極穩(wěn)定，故染色后不易褪色，具有較強(qiáng)的特異性，因此它是目前對膠原顯示的最好的染色方法[7]。