趙 越，林亞秋，朱江江，林 森，池永東，劉魯蜀，王 永

(1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

隨著我國人民生活水平不斷提高，營養(yǎng)更加豐富的羊肉漸漸代替豬肉走進(jìn)了尋常百姓家，擺上了老百姓的餐桌[1]，這使人們對于羊肉的品質(zhì)提出了更高的要求。肌內(nèi)脂肪(Intramuscular fat，IMF)是脂肪沉積的形式之一，與肉嫩度、口感、剪切力等肉品質(zhì)特性有著極強(qiáng)的正相關(guān)[2-4]，是顯著影響肉品質(zhì)與食用口感的重要因素之一。因此，從影響IMF沉積的候選基因入手來闡明山羊肉質(zhì)性狀形成的分子機(jī)制具有重要的理論和實(shí)際意義。

Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子家族(KLFs)是一類具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，對機(jī)體的生長發(fā)育、代謝平衡都有重要的作用[5-6]。哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)18種KLF樣轉(zhuǎn)錄因子(KLF1～18)，該家族一般具有3個鋅指結(jié)構(gòu)，與DNA的CACCC元件和富含GC區(qū)連接，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活或抑制[7-8]。近些年的研究顯示，KLF 家族的多個成員(包括KLF9)參與脂肪細(xì)胞分化過程的調(diào)控[9-15]。但是，這些研究大部分是以3T3-L1前脂肪細(xì)胞系為研究對象獲得的，且有研究表明KLF成員在小鼠和豬脂肪細(xì)胞分化中的調(diào)控作用具有物種特異性[16]。KLF9是KLF家族成員中重要的成員之一，最初從大鼠肝臟cDNA文庫中分離[17]，其特點(diǎn)是在高等哺乳動物與人類組織中廣泛表達(dá)且高度保守。目前對KLF9的研究多見于腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[18-23]，免疫反應(yīng)和細(xì)胞增殖生長等方面[24-26]。有研究顯示KLF9可促進(jìn)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化[13]，但基于其他學(xué)者發(fā)現(xiàn)的KLF家族成員在脂肪細(xì)胞分化中的調(diào)控作用存在物種特異性，所以在細(xì)胞系中的研究成果不一定適合山羊這個物種。

因此，為了闡明KLF9基因在山羊脂肪沉積中的作用，本試驗(yàn)采用我國第2個國家級肉用山羊新品種—簡州大耳羊?yàn)閷ο?，并以青藏高原特有的藏山羊作為對比，用RT-PCR技術(shù)克隆得到山羊KLF9基因序列，分析其差異，用實(shí)時熒光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR，qPCR)檢測其在簡州大耳羊和藏山羊各個組織中的表達(dá)特性及差異，同時檢測了KLF9基因在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化不同階段的表達(dá)模式。

本試驗(yàn)的研究結(jié)果對于闡明山羊KLF9基因在山羊肌內(nèi)脂肪沉積和脂代謝過程中的作用及相關(guān)機(jī)制起到了重要的作用，提供了新的數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

主要材料與試劑：DNA凝膠回收試劑盒(AxyPrep DNA Gel Extraction Kit)購自北京Axygen公司(中國)，Ⅱ型膠原酶、油酸購自Sigma公司(美國)，血清購自Gemini公司(美國)，胰蛋白酶和DEME/F12培養(yǎng)基購自Hyclone公司(美國)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit)購自Thermo公司(美國)，總RNA提取試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、2×GC-rich PCR Master Mix購自北京天根生化科技有限公司(中國)。TRIzol、SYBR?Premix ExTaqTM(2×)、pMD-19T Vector購自北京TaKaRa公司(中國)。

1.2 樣品采集和總RNA提取

選取健康的簡州大耳羊(四川省簡陽市)和藏山羊(四川省若爾蓋縣)各4只。清晨空腹屠宰后，當(dāng)即剪取各個組織樣品(背最長肌、股二頭肌、臂三頭肌、皮下脂肪、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟)，每個2 g，用DEPC水清洗后將各個組織樣品分裝凍存管內(nèi)并標(biāo)好編號放液氮中。

用TRIzol法提取上述各個組織的總RNA。用NanoDrop ND-1000 (Agilent) 分光光度計測定RNA樣品的濃度以及OD260/280值，用瓊脂糖凝膠變性電泳檢測RNA完整性，保留OD260/280值在1.9～2.1且電泳條帶清晰的樣品。用gDNAse去除DNA后，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書制備cDNA。

1.3 山羊KLF9基因的克隆

選取簡州大耳羊與藏山羊各1只，以脾臟組織的cDNA為模板，根據(jù)GenBank中登錄的牛(NM_001193214.1)的KLF9基因序列，利用Primer premier 5.0 設(shè)計克隆引物，上游引物：5′-TAGTCCGAGGCCAGGGCA-3′，下游引物：5′-TGTCTGTCTGTTCGCTGGGA-3′，預(yù)測長度為891 bp，克隆擴(kuò)增體系共25 μL：ddH2O 9.5 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，2×GC-rich PCR Master Mix 12.5 μL(PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃ 變性30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1.5 min，39個循環(huán)；72 ℃延伸10 min)。

制備1%瓊脂糖凝膠，并對所有樣品進(jìn)行電泳條帶檢驗(yàn)。將條帶清晰明亮的樣品切膠回收DNA片段并連接pMD-19T載體，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。用PCR檢驗(yàn)陽性菌落的目的條帶，最后將帶有純凈明亮的目的條帶的菌液樣品送公司測序(成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司)。

1.4 序列的生物信息學(xué)分析

山羊KLF9基因的開放閱讀框使用ORF Finder網(wǎng)站進(jìn)行分析；山羊KLF9基因測序結(jié)果使用在線軟件Blast對其進(jìn)行同源性分析；山羊、牛、人、小鼠、豬的氨基酸序列用DNAMAN軟件進(jìn)行相似性比對；對KLF9蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)用在線工具PRABI進(jìn)行預(yù)測；山羊KLF9基因三級結(jié)構(gòu)用PHYRE2在線工具預(yù)測比對；KLF9蛋白質(zhì)量(MW)和等電點(diǎn) (PI) 使用EXpASy在線工具進(jìn)行分析；用STRING工具在線預(yù)測山羊KLF9蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)(http：//www.string-db.org/)；KLF9蛋白質(zhì)的親水性結(jié)構(gòu)用ProtScale在線工具進(jìn)行分析；KLF9蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)用TMPRED在線工具進(jìn)行分析；KLF9的基因進(jìn)化樹利用MEGA 7軟件進(jìn)行構(gòu)建。

1.5 實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)

山羊KLF9基因的特異性引物(由Primer premier 5.0軟件設(shè)計)為：上游：5′-GGATACCTGGAA GGATTACTGC-3′，下游：5′-GGAAGGACTCGACCCAG

ATT-3′。qPCR程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，39個循環(huán)。簡州大耳羊和藏山羊的樣品每一種各設(shè)計4個生物學(xué)重復(fù)，每個待測樣本設(shè)3個技術(shù)重復(fù)，陰性對照為3個無cDNA模板的樣本，內(nèi)參基因?yàn)?-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(GenBank登錄號：XM_005680968)。內(nèi)參引物為：F：5′-GCAAGTTCCACGGCACAG-3′，R：5′-TCAGCACCAGCATCACCC-3′。

1.6 山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的分離及原代培養(yǎng)

選用羔羊背最長肌為材料(來自2只簡州大耳羊7日齡羔羊)，用膠原酶消化法獲得羔羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞。剪碎脂肪組織并將其轉(zhuǎn)入離心管(離心管中提前加入2倍體積Ⅱ型膠原酶)，將離心管至于37 ℃水浴鍋中1 h進(jìn)行消化，然后每隔5 min將其搖晃 1次直至其消化完全，而后加入等體積的DME/F12培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)終止消化，并用細(xì)胞篩過濾(76，37 μm)。將濾液經(jīng)2 000 r/min，5 min離心，之后棄上清液，并加入適量紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，并將沉淀吹散。靜置5 min，放入離心機(jī)經(jīng)2 000 r/min離心5 min。之后棄上清，加DME/F12培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)制成細(xì)胞懸液，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，4 h后換液，此后每2 d換一次液。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法對qPCR數(shù)據(jù)均一化處理，利用Pasw statistics 18的LSD與Duncan法對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用GraphPad Prism 5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊KLF9基因生物信息學(xué)分析

利用RT-PCR方法克隆得到山羊KLF9基因序列(模板為簡州大耳羊和藏山羊脾臟組織cDNA)。結(jié)果得到山羊KLF9基因序列為891 bp，其中包含CDS區(qū)735 bp，5′UTR序列86 bp，3′UTR序列70 bp。其終止密碼子為TGA，編碼244個氨基酸。提交GenBank獲得簡州大耳羊KLF9基因序列登錄號為KX247670，藏山羊登錄號為KY849591。簡州大耳羊KLF9基因CDS區(qū)序列與藏山羊相比具有2個突變，其中第57個堿基由G突變?yōu)镃，但此處并沒有引起氨基酸的改變，屬無義突變；第653個堿基由C突變?yōu)門，此處引起第218個氨基酸的改變，山羊?yàn)楦彼?P)，藏山羊?yàn)榱涟彼?L)。簡州大耳羊與藏山羊KLF9氨基酸序列相似性為99.73%。山羊KLF9氨基酸序列與牛、豬、鼠、人的相似性極高，為99.18%～97.54%(圖1)。

山羊KLF9蛋白質(zhì)量(MW)為27.176 58 kDa，等電點(diǎn)PI為8.80，包含31個負(fù)電荷氨基酸堿基(Asp+Glu)和37個正電荷氨基酸堿基(Arg+Lys)，其絲氨酸Ser (S)所占的比例最高，為11.5%。不穩(wěn)定指數(shù)為57.89，屬于不穩(wěn)定蛋白，在哺乳動物細(xì)胞中的半衰期為30 h。脂溶系數(shù)為52.83，總平均親水性為-0.857。山羊KLF9蛋白具有1次跨膜結(jié)構(gòu)，位于3-24。KLF9蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，α螺旋：26.63%，延伸鏈：13.11%，無規(guī)卷曲：60.66%，山羊KLF9的3個鋅指結(jié)構(gòu)位置依次為143-167,173-197,203-225。其三級結(jié)構(gòu)在山羊、牛、人、小鼠、豬等物種間具有較高的相似度且具有鋅指家族的典型特征(圖2)。蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)顯示，山羊KLF9可能與KLF6、SMARCA2、SMARCA4、HDAC2、PCAF等蛋白存在互相作用(圖3)。

2.2 構(gòu)建山羊KLF9氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹

為了研究山羊KLF9氨基酸的進(jìn)化過程，分別選擇哺乳動物、禽類和魚類的氨基酸序列與之進(jìn)行生物進(jìn)化樹分析。結(jié)果如圖4，其中簡州大耳羊與藏山羊關(guān)系最近，山羊的KLF9基因與牛、豬、貓的KLF9基因具有最近的親緣關(guān)系，猩猩、人、狗、小鼠、大鼠的KLF9基因親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)，與雞和斑馬魚的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖4)。

圖1 不同山羊品種(A)和物種間(B)KLF9氨基酸相似性的比對Fig.1 Comparison of KLF9 amino acid similarity between different goat breeds (A) and among various species (B)

圖2 不同物種間KLF9蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的比對Fig.2 Comparison of the tertiary structure of KLF9 protein among different species

圖3 山羊KLF9蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)Fig.3 The interaction network of goat KLF9 protein

2.3 KLF9基因在山羊各組織中的表達(dá)

qPCR結(jié)果顯示，KLF9基因的表達(dá)在2種山羊間各具特點(diǎn)。KLF9 mRNA在簡州大耳羊的各個組織中均有表達(dá)，且在皮下脂肪和肝臟組織的KLF9 mRNA的表達(dá)量最高，極顯著高于其他各組織(P<0.01)；KLF9 mRNA在藏山羊的肺臟組織中的表達(dá)量極顯著高于其余各個組織(P<0.01)(圖5)。

2.4 山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中KLF9基因的表達(dá)

基于KLF9基因在簡州大耳羊皮下脂肪組織中的高水平表達(dá)，推測其可能在脂肪細(xì)胞分化和脂肪沉積中發(fā)揮重要調(diào)控作用，肌肉組織也是脂肪沉積的部位之一，本試驗(yàn)檢測了KLF9基因在誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞分化不同階段(0，2，4，6 d)的表達(dá)水平，為闡明其調(diào)控山羊肌內(nèi)脂肪沉積的作用及分子機(jī)理提供非常重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，0～2 dKLF9的相對表達(dá)量升高，于2 d達(dá)峰值，之后持續(xù)下降，且極顯著高于誘導(dǎo)分化前(圖6)。

圖4 KLF9氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed based on KLF9 amino acid with Neighbor-joining method

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖6同。

圖6 山羊KLF9基因在前體脂肪細(xì)胞分化過程中的相對表達(dá)量Fig.6 Relative expression of goat KLF9 gene during differentiation in preadipocytes adipocytes

3 討論與結(jié)論

已有研究表明KLF9參與3T3-L1前體脂肪細(xì)胞生成，比如Pei等[13]指出KLF9調(diào)控脂肪細(xì)胞分化期階段PPARγ的轉(zhuǎn)錄激活，Kimura等[27]指出KLF9通過增強(qiáng)C/EBPβ的表達(dá)來激活3T3-L1早期脂肪生成，但其對山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化和脂肪沉積的影響尚未見報道。NCBI上也僅見山羊KLF9預(yù)測序列，因此，本項(xiàng)目利用RT-PCR技術(shù)克隆山羊KLF9基因序列，并發(fā)現(xiàn)簡州大耳羊與藏山羊氨基酸序列相似性為99.73%，僅在第218位氨基酸存在差異，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)山羊KLF9有3個鋅指結(jié)構(gòu)，位置依次為143-167，173-197，203-225，符合該家族的結(jié)構(gòu)特征[7]。同源比對和進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)KLF9在不同物種之間具有極高的保守性。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測指出山羊KLF9可能與SMARCA2/4[28-29]、HDAC2[30]、PCAF[31]等蛋白存在互相作用，但以上蛋白均與腫瘤的生長與疾病的發(fā)生相關(guān)。

明確基因的組織表達(dá)規(guī)律是闡明基因功能的重要基礎(chǔ)，本研究利用實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)檢測了2種山羊各個組織中的山羊KLF9基因表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KLF9在簡州大耳羊和藏山羊的組織表達(dá)模式不同，在簡州大耳羊的脂肪和肝臟中表達(dá)較高，在藏山羊的肺臟組織中表達(dá)最高，原因可能是2種山羊生長的環(huán)境不同，簡州大耳羊主要在四川盆地，而藏山羊在高原，在肺臟組織中高表達(dá)可能與高原缺氧適應(yīng)性有關(guān)。焦?jié)齕32]指出KLF9在小鼠肝臟中高表達(dá)，王翠喆等[33]發(fā)現(xiàn)KLF9基因在維吾爾族網(wǎng)膜脂肪組織中高表達(dá)。Antin等[34]發(fā)現(xiàn)KLF9在雞的胚胎發(fā)育前期有高表達(dá)，Martin等[35]發(fā)現(xiàn)其在小鼠胚胎生長發(fā)育中也具有高表達(dá)。綜上所述，KLF9基因表達(dá)具有物種和品種特異性。

組織表達(dá)譜指出KLF9基因在簡州大耳羊的脂肪組織中存在高水平表達(dá)，推測其可能參與脂肪沉積。因此，本研究利用實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)檢測了山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化不同階段的KLF9基因的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)山羊KLF9基因在肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢，其中第2天的相對表達(dá)量達(dá)到峰值，且極顯著高于未誘導(dǎo)分化的前體脂肪細(xì)胞，推測該基因可能在山羊前體脂肪細(xì)胞分化前期發(fā)揮正調(diào)控作用。這與Mori等[36]提出的KLF9基因和蛋白在3T3-L1細(xì)胞中誘導(dǎo)分化2 d達(dá)到峰值的研究結(jié)果一致，但是Kimura等[27]的試驗(yàn)結(jié)果與此不同，他們指出KLF9基因和蛋白均在3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化1 h時達(dá)到最高峰值的表達(dá)，1 h之后KLF9的表達(dá)量呈下降趨勢；Pei等[13]則指出KLF9基因和蛋白在3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化0～8 d呈逐漸上升趨勢?；诒狙芯克玫慕Y(jié)果推測山羊KLF9基因可能在肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化早期發(fā)揮調(diào)控作用，下一步本實(shí)驗(yàn)室(青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)將構(gòu)建超表達(dá)和干擾載體體外轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的細(xì)胞來進(jìn)一步證明其調(diào)控的作用機(jī)制。

本研究克隆得到山羊KLF9基因全長序列891 bp，編碼244個氨基酸殘基，是不穩(wěn)定的疏水蛋白，有3個鋅指結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示KLF9基因在簡州大耳羊皮下脂肪與肝臟中表達(dá)最高，在藏山羊肺臟中表達(dá)最高；KLF9在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化2 d表達(dá)水平最高，極顯著高于未誘導(dǎo)分化的前體脂肪細(xì)胞，推測其可能在山羊前體脂肪細(xì)胞分化早期階段發(fā)揮調(diào)控作用。結(jié)果將為進(jìn)一步了解KLF9基因的功能以及其在肌內(nèi)脂肪沉積中所起的作用奠定理論基礎(chǔ)。

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