孫新艷，魏 瑩，韓曉玉，王振躍，陳琳琳，燕照玲，施 艷1，

(1.河南省果樹瓜類生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，河南 鄭州 450002；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 鄭州 450002)

S期激酶相關(guān)蛋白1 (S-phase kinase-associated protein 1，Skpl ) 是真核生物中普遍存在的一類蛋白，是SCF型E3泛素連接酶途徑的核心蛋白，具有特異性地連接Cullin1(Cul1) 和F-box蛋白的作用[1-3]，通過與Cullin1、Rbx1和F-box蛋白形成SCF復(fù)合物來發(fā)揮功能，在SCF復(fù)合物中，Cullin1與Rbx1結(jié)合，F(xiàn)-box蛋白識(shí)別靶標(biāo)蛋白，Skp1分別結(jié)合F-box蛋白和Cullin1，Skp1-Cul1-F-box (SCF) E3復(fù)合體在多個(gè)細(xì)胞過程中起重要作用[4]。研究表明，Skp1在真核生物的細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)等很多細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Skp1相關(guān)基因被證實(shí)在植物生長素、赤霉素、乙烯、茉莉酸和光反應(yīng)途徑中有十分重要的作用[5-11]。研究發(fā)現(xiàn)，Skp1基因在小麥從可育轉(zhuǎn)變?yōu)椴挥^程中表達(dá)受到抑制，說明Skp1與小麥育性轉(zhuǎn)變密切相關(guān)[12]。本試驗(yàn)構(gòu)建了黃瓜Skp1基因的原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中高效表達(dá)出該基因的融合蛋白，通過免疫新西蘭大耳白兔制備了特異性抗血清，為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料、菌株、質(zhì)粒和試劑

供試黃瓜品種為新優(yōu)36，種植于溫室中。

大腸桿菌菌株DH5α、BL21、原核表達(dá)載體pET-28a由河南省果樹瓜類生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶購自美國NEB公司。PrimeSTAR Max DNA Polymerase購自TaKaRa。IPTG、Kana、Tris、SDS、丙烯酰胺、甘氨酸為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG為Sigma 產(chǎn)品。SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒為生工生物工程上海股份有限公司產(chǎn)品。其他試劑為進(jìn)口和國產(chǎn)分析純。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù) NCBI 已經(jīng)發(fā)表的黃瓜Skp1基因序列，利用軟件DNAMAN設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長閱讀框的引物。正向引物為5′-GACGGATCCATGTCCTCCTCCAACAAA

AT-3′，反向引物為5′-GATCTCGAGTCATTCACAAGCC

CACTGAT-3′。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。為了便于克隆，分別在5′ 和3′ 端添加酶切位點(diǎn)BamH Ⅰ和XhoⅠ。

1.3 Skp1基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以黃瓜葉片cDNA為模板擴(kuò)增Skp1基因，PCR 50 μL擴(kuò)增體系：1 μL cDNA，正向引物和反向引物各0.5 μL，PrimeSTAR Max DNA聚合酶25 μL，ddH2O 23 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物通過試劑盒回收純化。將純化后的Skp1片段和pET-28a載體分別用BamHⅠ 和XhoⅠ雙酶切，用T4DNA 連接酶連接過夜后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定并測(cè)序，提取質(zhì)粒。

1.4 Skp1基因的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE 分析

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株，挑取單菌落于37 ℃過夜培養(yǎng)，用含Kana 50 μg/mL 的LB培養(yǎng)基按1∶100的比例擴(kuò)大培養(yǎng)，振蕩培養(yǎng)至OD600為0.8。加入IPTG 至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)3，6，9 h，分別離心收集菌體，每50 mL菌液加入5 mL ddH2O和1 mL 樣品緩沖液(40 mmol/L Tris-HCI(pH值6.8)、10% 甘油、5% SDS、5% 巰基乙醇、0.1%溴酚藍(lán))，煮沸10 min，離心后取上清，用12% 的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.5 抗血清制備及其效價(jià)測(cè)定

參照Hager 和Burgess的方法回收表達(dá)產(chǎn)物，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)12%的SDS-PAGE 電泳后，將凝膠用預(yù)冷的0.25 mmol/L KCl，1 mmol/L DTT 溶液浸泡5 min，重蒸水沖洗，切下含目的條帶的凝膠，按1∶1比例(m/V)加入PBS 緩沖液(0.14 mol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、1.5 mmol/L KH2PO4、8.1 mmol/L Na2HPO4)，于冰浴中研磨[13]。用PBS緩沖液適當(dāng)稀釋后，加入等體積的福氏不完全佐劑(1.5 g羊毛脂+8 mL石蠟油)進(jìn)行乳化。采用肌肉注射的方法免疫新西蘭大耳白兔，共免疫5次。

以純化的蛋白(2.5 μg/mL) 作為抗原包被ELISA板，將抗血清進(jìn)行一系列倍比稀釋后作為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，用ACP-ELISA測(cè)定抗血清的效價(jià)。

1.6 蛋白免疫印跡(Western Blot)分析

利用植物總蛋白抽提緩沖液 (220 mmol/L Tris-HCl，pH值 7.4，250 mmol/L蔗糖，1 mmol/L MgCl2，50 mmol/L KCl，10 mmol/L β-巰基乙醇，100 μmol/L PMSF)提取黃瓜葉片總蛋白，取10 μL 上樣于5% 的濃縮膠和12% 的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加稀釋500倍和稀釋1 000倍的兔抗血清雜交，隨后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋)，在增強(qiáng)型HRP-DAB 底物顯色試劑盒中顯色至條帶清晰。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜Skp1基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以黃瓜葉片cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到1條特異性片段(圖1)，與預(yù)期大小一致。擴(kuò)增出的特異性條帶在T4DNA連接酶的作用下連接到pET-28a載體上，菌落PCR驗(yàn)證陽性克隆并測(cè)序，獲得重組質(zhì)粒pETSkp1。Skp1基因全長閱讀框由468個(gè)核苷酸組成，共編碼155個(gè)氨基酸。

M.DNA 分子標(biāo)準(zhǔn)DL5000；1.PCR 產(chǎn)物。M.DNA Marker DL5000；1.PCR Product.

2.2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析和蛋白純化

將誘導(dǎo)后的含有pETSkp1的重組質(zhì)粒的菌株裂解物進(jìn)行SDS-PAGE分析，未誘導(dǎo)的菌株裂解物作為對(duì)照，從圖2可以看出，誘導(dǎo)后的菌株可產(chǎn)生分子質(zhì)量約20 kDa 的特異蛋白質(zhì)條帶，與預(yù)期大小相符。IPTG誘導(dǎo)后3 h，Skp1蛋白即獲得誘導(dǎo)表達(dá)，6，9 h誘導(dǎo)對(duì)表達(dá)量沒有影響，因此，本試驗(yàn)用3 h進(jìn)行誘導(dǎo)，切膠回收蛋白，研磨純化。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET空載體未誘導(dǎo)；2～4.未加IPTG，pETSkp1 誘導(dǎo)3，6，9 h；5.pETSkp1未誘導(dǎo)；6～8.IPTG誘導(dǎo)pETSkp1后3，6，9 h。

M.Protein Marker；1.pET-28a without induction；2-4.Total proteins of pETSkp1 being induced for 3，6，9 h respectiveIy without IPTG；5.pETSkp1 without induction；6-8.Total proteins of pETSkplbeing induced for 3，6，9 h respectively.

圖2SDS-PAGE分析Skp1融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
Fig.2SDS-PAGEanalysisofexpressionproductsofpETSkp1

2.3 抗血清的制備及效價(jià)測(cè)定

用回收的特異性蛋白免疫新西蘭大白兔，5次免疫后取血獲得黃瓜Skp1的抗血清。將純化的蛋白作為抗原，分別通過2種方式進(jìn)行抗原包被，ACP-ELISA 檢測(cè)結(jié)果表明：用膠條電洗脫包被，抗血清稀釋128×103倍后能明顯檢測(cè)出；用包涵體抗原包被，抗血清稀釋512 × 103倍后能明顯檢測(cè)出(表1)。

表1 抗血清效價(jià)測(cè)定Tab.1 Determination of the titer of antiserum

注：+.陽性；-.陰性。

Note：+.Positive；-.Negative.

2.4 Western Blot 檢測(cè)黃瓜樣品結(jié)果

提取黃瓜葉片的總蛋白，將制備的抗血清分別稀釋500，1 000倍作為一抗來檢測(cè)抗血清的特異性。結(jié)果表明，在這2種條件下均能明顯地檢測(cè)出Skp1編碼的蛋白，并與預(yù)期結(jié)果一致(圖3)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.抗血清稀釋500倍；2.抗血清稀釋1 000倍。 M.Protein Marker；1.Antiserum diluted 500 times；2.Antiserum diluted 1 000 times.

3 結(jié)論與討論

本研究確定了Skp1蛋白在大腸桿菌BL21中高效表達(dá)的條件，利用純化的蛋白制備了抗血清，并通過ELISA測(cè)定了其效價(jià)為1∶128 000～512 000，Western Blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)抗血清進(jìn)行1∶500和1∶1 000稀釋都可以很好地檢測(cè)到Skp1蛋白，通過Western Blot進(jìn)一步驗(yàn)證了抗血清在植物中的應(yīng)用，為通過免疫共沉淀篩選與Skp1互作蛋白奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)為進(jìn)一步研究黃瓜Skp1蛋白功能提供依據(jù)。

Skp1蛋白具有廣泛的生物學(xué)功能，最多的研究是對(duì)泛素蛋白酶的研究，泛素蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasome system，UPS)是目前已知的所有真核生物體內(nèi)具有高度選擇性的最為重要的蛋白質(zhì)降解途徑，參與細(xì)胞內(nèi)80%以上蛋白質(zhì)的降解，泛素蛋白酶體途徑廣泛調(diào)控植物生長發(fā)育，如激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、胚胎發(fā)育、光信號(hào)調(diào)節(jié)、開花、干旱、自交不親和性以及植物與病原菌相互作用和免疫反應(yīng)等過程。

在擬南芥的研究中Skp1蛋白參與了多個(gè)SCF復(fù)合體的形成，Skp1作為SCF復(fù)合物中的一個(gè)關(guān)鍵的骨架蛋白同時(shí)結(jié)合F-box蛋白和Cul1，調(diào)控著包括植物雄性減數(shù)分裂、生長素、赤霉素、茉莉酸和乙烯等生理和發(fā)育進(jìn)程[14-17]。在許多研究中，Skp1通過與病毒互作在病毒侵染植物中發(fā)揮重要作用[18-19]。黃瓜作為多種植物病毒寄主，Skp1可能在病毒侵染黃瓜中發(fā)揮重要作用，另外研究發(fā)現(xiàn)，Skp1參與糖基化調(diào)節(jié)[20]。黃瓜中Skp1功能研究鮮有報(bào)道，Skp1作為多種生物學(xué)過程的交叉點(diǎn)可能對(duì)黃瓜的生長發(fā)育及抗病性發(fā)揮重要作用。

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