李 納,李姣嬌,范 蕾,陳章寶*

(1.西南大學(xué)藥學(xué)院,重慶 400716；2.四川省南充衛(wèi)生學(xué)校,南充 637000)

金銀花和山銀花均為常用藥材,應(yīng)用廣泛[1-4]?！吨袊幍洹?010年版將金銀花與山銀花區(qū)分開,并將灰氈毛忍冬的花蕾作為山銀花的來源之一[5]。灰氈毛忍冬基部無明顯苞片,主要為非腺毛,而忍冬花含有大型的葉狀苞片,花外表皮具有較多腺毛[6-8]。山銀花具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效,臨床上常用于治療熱毒血病和風(fēng)熱感冒等疾病。山銀花能顯著抑制發(fā)熱模型大鼠的發(fā)熱現(xiàn)象,與金銀花二者之間的解熱強(qiáng)度相差無幾[9-11]。雙黃連口服液是由黃芩、金銀花和連翹 3 味中藥精制而成的合劑,具有疏風(fēng)解表、清熱解毒的功效,對外感風(fēng)熱引起的感冒具有良好的療效[12-13]。《中國藥典》2015年版將該藥品中的綠原酸、連翹苷和黃芩苷含量作為產(chǎn)品的指標(biāo)成分[14]。

自《中國藥典》頒布以來,有關(guān)金銀花基源的規(guī)定幾經(jīng)更迭,但在實(shí)際應(yīng)用中,仍存在金銀花與山銀花藥材混用的現(xiàn)象。本研究將山銀花用于制備雙黃連口服液,比較山銀花和金銀花制備雙黃連口服液的質(zhì)量差異,探究山銀花用于制備雙黃連口服液的可行性,為山銀花用于雙黃連口服液的制備提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 UV3100紫外分光光度計(jì)(天美科技有限公司)；LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津公司)。

1.2試藥 連翹(批號160330)、黃芩(批號160501),購自重慶康迪藥業(yè)有限公司；“三精”雙黃連口服液(哈藥集團(tuán)三精制藥有限公司,批號 Z10920053,原材料為金銀花)；綠原酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%,批號R05F6F1),黃芩苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%,批號P09M7F10367),連翹苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%,批號P20J7F9279),均購自上海源葉生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

山銀花(購自重慶市秀山縣,經(jīng)西南大學(xué)藥學(xué)院齊紅藝教授鑒定為忍冬科忍冬屬植物灰氈毛忍冬LoniceraeFlos的干燥花蕾)；金銀花(重慶康迪藥業(yè)有限公司,產(chǎn)地：山東,批號160701,經(jīng)西南大學(xué)藥學(xué)院齊紅藝教授鑒定為忍冬科忍冬屬植物忍冬LoniceraeJaponicaeFlos的干燥花蕾)。

2 方法與結(jié)果

2.1雙黃連口服液的制備

2.1.1金銀花制備的雙黃連口服液 按照《中國藥典》2015年版中的方法進(jìn)行制備[14]。

黃芩提取物的制備：稱取黃芩 375 g,加水煎煮3次,每次1 h,合并煎液,濾過,濾液濃縮并加入2 mol·L-1的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至1.0～2.0,保溫1 h后靜置過夜,濾過,沉淀加7倍量水,用質(zhì)量濃度為400 g·L-1的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0,再加等量無水乙醇,攪拌使溶解,濾過,濾液用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至2.0,60 ℃保溫30 min,靜置過夜,濾過,沉淀用無水乙醇洗至pH值為7.0,揮盡乙醇備用。

金銀花提取物的制備：稱取金銀花375 g、連翹750 g,溫水浸泡30 min,煎煮2次,每次1.5 h,合并煎液,濾過,將濾液濃縮至相對密度為1.25,放冷至40 ℃時(shí)緩緩加入無水乙醇,使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)75%,充分?jǐn)嚢?靜置過夜,濾取上清液,殘?jiān)偌芋w積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇提取,合并乙醇液,回收乙醇至無醇味。

將上述2種提取物合并,加水適量,用質(zhì)量濃度為400 g·L-1的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0,攪勻,4 ℃冷藏3 d,濾過,濾液加入蔗糖300 g,攪拌使溶解,再加入香精適量,調(diào)節(jié)pH值至7.0,加水定容至1 000 mL,攪勻,靜置1 d,濾過,灌裝,滅菌,即得。

2.1.2山銀花制備雙黃連口服液 按照《中國藥典》2015年版方法進(jìn)行制備[14]。

處方：山銀花375 g,黃芩375 g,連翹750 g。制法：按照2.1.1項(xiàng)下金銀花制備雙黃連口服液的方法進(jìn)行制備。

2.2雙黃連口服液的含量測定

2.2.1綠原酸

2.2.1.1綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 參考相關(guān)文獻(xiàn)[15-18],以質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的綠原酸作為儲備液,分別取一定量用流動(dòng)相稀釋至質(zhì)量濃度為0.5,1,2,3,4,5,6和7 μg·mL-1。色譜柱：GeminiI-NX-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-2 mL·L-1磷酸(20∶80)；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL；檢測波長：327 nm；以綠原酸質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y),計(jì)算得回歸方程：y=63 867x-1 232.1,r=0.999 6。結(jié)果表明，在0.5～7.0μg·mL-1的范圍內(nèi),綠原酸的峰面積與質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系。

2.2.1.2綠原酸的含量測定 參考《中國藥典》2015年版規(guī)定[14],精密量取雙黃連口服液2 mL,置于50 mL棕色量瓶中,加水定容至刻度,搖勻,待測。分別精密吸取供試品溶液20 μL,液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣,測定。本品每l mL金銀花含量以綠原酸計(jì),平行操作3次,不得少于0.60 mg。

結(jié)果表明,山銀花制備得到的雙黃連口服液中綠原酸質(zhì)量濃度最高,為2.052 4 mg·mL-1；金銀花雙黃連口服液和“三精”雙黃連口服液中綠原酸的質(zhì)量濃度分別為0.916 8和0.767 9 mg·mL-1,均符合《中國藥典》規(guī)定。

2.2.2連翹苷 參考《中國藥典》2015年版規(guī)定[14],色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,以乙腈-水(25∶75)為流動(dòng)相,檢測波長為278 nm。理論塔板數(shù)按照連翹苷峰計(jì)算應(yīng)不低于6 000。取連翹苷對照品適量,用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇制成質(zhì)量濃度為60 μg·mL-1的溶液,即得對照品溶液。取各雙黃連口服液1 mL,加入中性氧化鋁柱(100～120目,6 g,內(nèi)徑為1 cm),用40 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇洗脫,收集洗脫液,濃縮至干,加體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇適量,溫?zé)崛芙?移至5 mL量瓶中,定容至刻度,即得供試品溶液。液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣各10 μL,測定。本品每1 mL連翹含量以連翹苷計(jì),平行操作3次,不得少于0.30 mg。

實(shí)驗(yàn)表明,山銀花雙黃連口服液的連翹苷含量最高,質(zhì)量濃度為2.940 5 mg·mL-1；金銀花雙黃連口服液連翹苷的質(zhì)量濃度為2.336 1 mg·mL-1；“三精”雙黃連口服液的連翹苷含量最少,質(zhì)量濃度為0.529 1 mg·mL-1。均符合《中國藥典》規(guī)定。

2.2.3黃芩苷 參考《中國藥典》2015年版規(guī)定[14],色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水-10 mL·L-1冰醋酸(50∶50∶1)為流動(dòng)相；檢測波長為274 nm；理論塔板數(shù)按照黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低1 500。取黃芩苷對照品適量,用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇制成質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的溶液,即得對照品溶液。取各雙黃連口服液1 mL,置于50 mL量瓶中,加體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得供試品溶液。液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣5 μL,測定。本品每1 mL黃芩含量以黃芩苷計(jì),不得少于10 mg。

實(shí)驗(yàn)表明,“三精”雙黃連口服液中黃芩苷含量最高,為17.022 6 mg·mL-1；山銀花、金銀花雙黃連口服液的黃芩苷質(zhì)量濃度分別為12.448 4和16.640 5 mg·mL-1,均大于10 mg·mL-1。3種雙黃連口服液均符合《中國藥典》規(guī)定。

2.3山銀花、金銀花制備的雙黃連口服液與“三精”雙黃連口服液比較

2.3.1紫外全波長掃描 取山銀花、金銀花雙黃連口服液以及“三精”雙黃連口服液,稀釋到一定質(zhì)量濃度,用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(190～600 nm)掃描。

結(jié)果表明,綠原酸在327 nm波長處有最大吸收,黃芩苷、連翹苷分別在274和278 nm波長處有最大吸收,山銀花、金銀花雙黃連口服液與“三精”雙黃連口服液的紫外吸收差別不大。

2.3.2高效液相指紋圖譜對比

2.3.2.1黃芩苷 參考《中國藥典》2015年版規(guī)定[14]。色譜柱：GeminiI-NX-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水-冰醋酸(50∶50∶1)；流速：1.0 mg·min-1；進(jìn)樣量：5 μL；檢測波長：274 nm。

山銀花、金銀花雙黃連口服液以及“三精”雙黃連口服液黃芩苷均在10.323 min出峰,指紋圖譜顯示,3種雙黃連口服液均在274 nm波長處檢測黃芩苷,差異較小。結(jié)果見圖1。

圖1黃芩苷HPLC指紋圖譜

S1.金銀花雙黃連口服液；S2.山銀花雙黃連口服液；S3：“三精”雙黃連口服液；S4.黃芩苷對照品。

Fig.1 HPLC fingerprint of baicalin

S1.Shuanghuanglian Oral Liquid prepared byLoniceraeJaponicaeFlos；S2.Shuanghuanglian Oral Liquid prepared byLoniceraeFlos；S3."Sanjing" Shuanghuanglian Oral Liquid；S4.baicalin standard.

2.3.2.2連翹苷 參考《中國藥典》2015年版規(guī)定[14]。色譜柱：GeminiI-NX-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(25∶75)；流速：1.0 mg·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：278 nm。

山銀花、金銀花雙黃連口服液以及“三精”雙黃連口服液連翹苷均在12.605 min出峰,指紋圖譜顯示,3種雙黃連口服液均在278 nm波長處檢測連翹苷,差異較小。結(jié)果見圖2。

2.3.2.3綠原酸 參考《中國藥典》2015年版規(guī)定[14]。色譜柱：GeminiI-NX-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-2 mL· L-1磷酸(20∶80)；流速：1.0 mg·min-1；進(jìn)樣量：20 μL；檢測波長：327 nm。

圖2連翹苷HPLC指紋圖譜

S1.金銀花雙黃連口服液；S2.山銀花雙黃連口服液；S3.“三精”雙黃連口服液；S4.連翹苷對照品。

Fig.2 HPLC fingerprint of forsythin

S1.Shuanghuanglian Oral Liquid ofLoniceraeJaponicaeFlos；S2.Shuanghuanglian Oral Liquid ofLoniceraeFlos；S3."Sanjing" Shuanghuanglian Oral Liquid；S4.forsythin standard.

山銀花、金銀花雙黃連口服液以及“三精”雙黃連口服液綠原酸均在4.174 min出峰,指紋圖譜顯示,3種雙黃連口服液均在327 nm波長處檢測綠原酸,差異較小。結(jié)果見圖3。

圖3綠原酸HPLC指紋圖譜

S1.金銀花雙黃連口服液；S2.山銀花雙黃連口服液；S3.“三精”雙黃連口服液；S4.綠原酸對照品。

Fig.3 HPLC fingerprint of chlorogenic acid

S1.Shuanghuanglian Oral Liquid prepared byLoniceraeJaponicaeFlos；S2.Shuanghuanglian Oral Liquid prepared byLoniceraeFlos；S3."Sanjing" Shuanghuanglian Oral Liquid；S4.chlorogenic acid standard.

2.3.3TLC鑒別

2.3.3.1綠原酸、黃芩苷 參考《中國藥典》2015年版規(guī)定[14],取本品1 mL,加體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇5 mL,作為供試品溶液。另取黃芩苷、綠原酸對照品,用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇制成質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的對照品溶液。按照TLC法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),用毛細(xì)管吸取上述各溶液適量,分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上,以醋酸為展開劑展開,取出,晾干,置于365 nm紫外光燈下檢視。

山銀花、金銀花以及“三精”雙黃連口服液,在與黃芩苷對照品色譜相應(yīng)位置上,顯相同顏色斑點(diǎn)；在與綠原酸對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色熒光斑點(diǎn),且三者差異較小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4A。

2.3.3.2連翹苷 按照連翹苷TLC鑒別方法[14,19]：取本品1 mL,加甲醇5 mL使溶解,靜置,取上清液,作為供試品溶液。另取連翹對照藥材0.5 g,加甲醇10 mL,加熱回流20 min,濾過,濾液作為對照藥材溶液。按照TLC法(通則0502)實(shí)驗(yàn),吸取上述2種溶液適量,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄板上,以三氯甲烷-甲醇(5∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以100 mL·L-1的硫酸乙醇溶液,在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

山銀花、金銀花以及“三精”雙黃連口服液,在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色斑點(diǎn),且三者差異較小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4B。

圖4TLC圖

A:1.黃芩苷對照品；2.綠原酸對照品；3.山銀花雙黃連口服液；4.金銀花雙黃連口服液；5.“三精”雙黃連口服液。B:1.連翹苷對照品；2.連翹苷對照藥材；3.山銀花雙黃連口服液；4.金銀花雙黃連口服液；5.“三精”雙黃連口服液。

Fig.4 TLC chromatograms

A:1.baicalin standard；2.chlorogenic acid standard；3.Shuanghuanglian Oral Liquid prepared byLoniceraeFlos；4.Shuanghuanglian Oral Liquid prepared byLoniceraeJaponicaeFlos；5."Sanjing" Shuanghuanglian Oral Liquid.B:1.forsythin standard；2.chlorogenic acid standard；3.Shuanghuanglian Oral Liquid prepared byLoniceraeFlos；4.Shuanghuanglian Oral Liquid prepared byLoniceraeJaponicaeFlos；5."Sanjing" Shuanghuanglian Oral Liquid.

3 討論

本研究按照《中國藥典》方法分別制備山銀花和金銀花雙黃連口服液,采用HPLC法,測得山銀花、金銀花以及“三精”雙黃連口服液綠原酸的質(zhì)量濃度分別為2.052 4,0.916 8和0.767 9 mg·mL-1,均符合《中國藥典》規(guī)定,且山銀花雙黃連口服液中的綠原酸含量遠(yuǎn)高于金銀花以及“三精”雙黃連口服液；研究表明,山銀花、金銀花以及“三精”雙黃連口服液中連翹苷質(zhì)量濃度分別為2.940 5，2.336 1和0.529 1 mg·mL-1,均符合《中國藥典》2015年版規(guī)定；“三精”雙黃連口服液黃芩苷質(zhì)量濃度為17.022 6 mg·mL-1,山銀花、金銀花制備雙黃連口服液黃芩苷質(zhì)量濃度略低,分別為12.448 4和16.640 5 mg·mL-1,均符合《中國藥典》2015年版規(guī)定。比較“三精”雙黃連口服液連翹苷、黃芩苷和綠原酸指紋圖譜及其含量差異,三者指紋圖譜差異較小。利用紫外分光光度計(jì)和TLC法對3種不同雙黃連口服液進(jìn)行比較,研究結(jié)果顯示,三者制備的雙黃連口服液質(zhì)量差異較小,按照《中國藥典》現(xiàn)行質(zhì)量檢測規(guī)定山銀花可用于制備雙黃連口服液。

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