郭 偉,滕 亮,萬(wàn)琪臻,馬桂芝*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,烏魯木齊 830054；3.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院昌吉分院,昌吉 831100)

意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz.)維吾爾文名為高孜萬(wàn)或高孜班,是紫草科(Boraginaceae)多年生草本植物。作為一種重要的藥用植物,意大利牛舌草在民間使用具有悠久的歷史，其性濕熱,主要功能為清熱解毒、健胃舒肝,也可用于治療咳嗽痰喘、食欲不振、頭暈頭痛和高血壓[1]。維吾爾醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為,意大利牛舌草具有生濕生熱、調(diào)劑異常黑膽質(zhì)、生濕補(bǔ)腦、祛寒補(bǔ)心、爽心悅智、潤(rùn)燥消炎和止咳平喘等功效[2-3],為維吾爾醫(yī)學(xué)治療冠心病組方的高頻藥[4-5]。意大利牛舌草中可能含有甾體、三萜類、揮發(fā)油、酚類、鞣質(zhì)、黃酮類、香豆素、內(nèi)酯類、生物堿、糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)及皂苷類化合物等化學(xué)成分[6-10]。其中咖啡酸、蘆丁和紫云英苷均有一定的藥理活性[11-13]。

目前意大利牛舌草的質(zhì)量控制手段主要采用顯微、理化鑒別和單一成分液相測(cè)定的方法評(píng)價(jià)其質(zhì)量的優(yōu)劣,有一定的片面性[14-17]。為了更好地控制藥材質(zhì)量,本文建立了同時(shí)測(cè)定意大利牛舌草中咖啡酸、蘆丁和紫云英苷3種成分含量的HPLC法,該方法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高,為意大利牛舌草的質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 1220 Infinity 高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；New Classic MF電子天平(梅特勒-托利多公司)；Milli-Q艾柯超純水儀(美國(guó)密理博公司)；SK2510HP超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 對(duì)照品：咖啡酸(批號(hào)110885-200102),購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；蘆丁(批號(hào)MUST-16031813,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%),購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；紫云英苷(批號(hào)Y27J7H9634,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%),購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。乙腈、甲醇(色譜純,美國(guó)Fisher公司)；水為超純水；其他試劑均為分析純。意大利牛舌草藥材(批號(hào)20160705,產(chǎn)地：巴基斯坦),購(gòu)自新疆買提牙孜生物科技有限公司,由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院帕麗達(dá)·阿布力孜教授鑒定為紫草科(Boraginaceae)多年生草本植物意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz.)的地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 π NAP COSMOSIL C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。以乙腈(A)-2 mL·L-1磷酸(B)為流動(dòng)相,梯度洗脫[0～10 min,85%B；10～15 min,85%B→80%B；15～25 min,80%B→70%B；25～33 min,70%B→45%B；33～40 min,45%B→85%B]。流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；紫云英苷、咖啡酸和蘆丁的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為266,341和341 nm；進(jìn)樣量為10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1HPLC圖

A.混合對(duì)照品溶液(266 nm)；B.混合對(duì)照品溶液(341 nm)；C.供試品溶液(266 nm)；D.供試品溶液(341 nm)；1.咖啡酸；2.蘆??；3.紫云英苷。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.mixed standards (266 nm)；B.mixed standards (341 nm)； C.sample (266 nm)；D.sample (341 nm)；1.caffeic acid；2.rutin；3.astragaline.

2.2對(duì)照品溶液的制備 取對(duì)照品咖啡酸、蘆丁和紫云英苷適量,精密稱定,加入甲醇使其完全溶解,分別制得對(duì)照品溶液。分別精密量取各對(duì)照品溶液適量,加甲醇稀釋至咖啡酸、蘆丁和紫云英苷的質(zhì)量濃度分別為22.4,115.8和 78.4 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3供試品溶液的制備 取意大利牛舌草藥材粉末2.5 g,精密稱定,置于100 mL具塞錐形瓶中,加入體積分?jǐn)?shù)為90%的甲醇50 mL,稱定質(zhì)量,50 ℃、300 W超聲提取30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用體積分?jǐn)?shù)為90%的甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,上清液以0.22 μm微孔濾膜濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

2.4線性關(guān)系的考察 精密量取混合對(duì)照品溶液,依次倍量稀釋,得到系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積y對(duì)質(zhì)量濃度x(μg·mL-1)進(jìn)行線性回歸,咖啡酸、蘆丁和紫云英苷3種化合物的回歸方程分別為：y=683 058.284 1x-41 551.603 5,r=0.999 9；y=272 380.388 2x-51 335.028 7,r=0.999 9和y=463 478.798 7x-18 188.954 0,r=0.999 8；線性范圍分別為：0.348 8～23.32,1.813～116.0和0.241 3～15.44 μg·mL-1。結(jié)果表明,3種成分在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)峰面積與質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好。

2.5精密度實(shí)驗(yàn)

2.5.1日內(nèi)精密度 吸取高、中和低3個(gè)質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液(其中咖啡酸的質(zhì)量濃度分別為0.348 8,1.395和23.32 μg·mL-1；蘆丁的質(zhì)量濃度分別為1.813,7.251和116.0 μg·mL-1；紫云英苷的質(zhì)量濃度分別為0.241 3,0.965和15.44 μg·mL-1)。按照2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次?？Х人岣?、中和低質(zhì)量濃度峰面積的RSD值分別為0.07%,0.85%和1.59%；蘆丁高、中和低質(zhì)量濃度峰面積的RSD值分別為0.08%,0.27%和1.13%；紫云英苷高、中和低質(zhì)量濃度峰面積的RSD值分別為0.66%,0.49%和1.86%,結(jié)果表明,該方法日內(nèi)精密度良好。

2.5.2日間精密度 吸取2.5.1項(xiàng)下高、中和低3個(gè)質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液,連續(xù)測(cè)定3 d。咖啡酸高、中和低質(zhì)量濃度峰面積的RSD值分別為0.73%,0.89%和1.87%；蘆丁高、中和低質(zhì)量濃度峰面積的RSD值分別為0.62%,0.23%和1.68%；紫云英苷高、中和低質(zhì)量濃度峰面積的RSD值分別為1.26%,0.26%和1.38%。結(jié)果表明,該方法日間精密度良好。

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按照2.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,測(cè)得樣品中咖啡酸、蘆丁和紫云英苷3種化學(xué)成分含量的RSD值分別為2.16%,1.88%和3.19%,結(jié)果表明,該方法重復(fù)性較好。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一樣品溶液,分別在0,1,3,5,7,9,12和24 h測(cè)定。按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,測(cè)得咖啡酸、蘆丁和紫云英苷峰面積的RSD值分別為1.30%,1.74%和1.50%。結(jié)果表明,該溶液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.8平均回收率 精密稱取已知含量的意大利牛舌草粉末2.5 g,9份,分別加入咖啡酸、蘆丁和紫云英苷對(duì)照品溶液適量。按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,依次測(cè)得咖啡酸、蘆丁和紫云英苷的平均回收率和RSD值,見(jiàn)表1。結(jié)果表明,該方法準(zhǔn)確度良好。

2.9樣品含量測(cè)定 取不同批號(hào)的意大利牛舌草粉末2.5 g,各3份,按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

表1加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Results of recovery test

成分稱樣量/g樣品含量/μg加入量/μg測(cè)得量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%咖啡酸2.4789210.6196.8405.799.299.61.282.4997212.4196.8403.897.52.5009212.5196.8409.9100.32.5014212.5196.8408.899.72.5018212.6196.8412.1101.32.5017212.6196.8408.199.4蘆丁2.47891641.21451.43111.8101.2101.10.662.49971654.91451.43123.9101.12.50091655.71451.43128.8101.32.50141656.11451.43115.3100.52.50181656.31451.43144.7102.22.50171656.31451.43113.9100.4紫云英苷2.4789152.3135.2285.298.499.83.752.4997153.6135.2297.3105.52.5009153.7135.2282.495.82.5014153.7135.2293.9103.22.5018153.7135.2286.098.02.5017153.7135.2285.397.6

表23種樣品含量測(cè)定結(jié)果

Tab.2 Determination results of 3 compounds

樣品編號(hào)咖啡酸/μg·g-1蘆丁/μg·g-1紫云英苷/μg·g-1DS184.96±1.12662.05±10.0461.45±2.45DS285.82±2.64779.59±21.5970.20±0.51DS385.68±1.75779.60±15.5061.45±1.15

3 討論

3.1流動(dòng)相的選擇 穩(wěn)定的色譜條件是進(jìn)行含量測(cè)定的基礎(chǔ)。本文分別考察了甲醇-2 mL·L-1磷酸、甲醇-2 mL·L-1甲酸、乙腈-2 mL·L-1甲酸、1 mL·L-1甲酸乙腈-1 mL·L-1甲酸、2 mL·L-1甲酸乙腈-2 mL·L-1甲酸以及乙腈-2 mL·L-1磷酸等溶劑系統(tǒng)作為流動(dòng)相,其中以乙腈-2 mL·L-1磷酸為流動(dòng)相,意大利牛舌草中3種化學(xué)成分具有良好的分離效果和較好的峰形,保留時(shí)間適中,最終選擇乙腈-2 mL·L-1磷酸為流動(dòng)相[16]。

3.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 本文分別對(duì)藥材中含有的2種黃酮類成分蘆丁和紫云英苷進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描,兩者均具有黃酮類化合物桂皮酰系統(tǒng)和苯甲酰系統(tǒng)組成的交叉共軛體系形成的2個(gè)紫外吸收帶的特征：蘆丁的最大吸收波長(zhǎng)為266和409 nm；紫云英苷的最大吸收波長(zhǎng)為266和341 nm；咖啡酸的最大吸收波長(zhǎng)在320 nm附近[18]。綜合考慮,在266 nm處檢測(cè)紫云英苷,在341 nm處檢測(cè)咖啡酸和蘆丁,使得各成分均有較大吸收。

3.3供試品制備工藝的選擇

3.3.1提取方法 分別采用回流、冷浸和超聲方法進(jìn)行供試品溶液的制備,結(jié)果表明,超聲提取法可獲得較高的提取率,且方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、省時(shí)、易行。

3.3.2提取溶劑 考察不同質(zhì)量濃度甲醇、乙醇對(duì)制備工藝的影響,當(dāng)提取溶劑中水的比例超過(guò)30%時(shí),提取液黏稠而難以過(guò)濾,且液相測(cè)定時(shí)易堵塞色譜柱。采用不同比例的醇提取后,蒸干,加醇復(fù)溶處理,可使提取液中多糖等黏性物質(zhì)析出,但過(guò)程復(fù)雜,重復(fù)性差。最終確定用體積分?jǐn)?shù)為90%的甲醇提取,咖啡酸、蘆丁和紫云英苷均可獲得較高的提取率。

方法學(xué)研究結(jié)果表明,采用HPLC法同時(shí)測(cè)定意大利牛舌草中咖啡酸、蘆丁和紫云英苷3種化學(xué)成分的含量,具有良好的精密度、準(zhǔn)確度和重復(fù)性,簡(jiǎn)單易行,可為意大利牛舌草的藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

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