郭華榮， 王 玉， 左建偉， 陳月如

(1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院海洋生物遺傳與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003；2.中國海洋大學(xué)海洋生物進(jìn)化與多樣性研究所，山東 青島 266003)

miRNA(microRNA)是一類廣泛存在的長度約為18～25 nt的單鏈非編碼小RNA，是由具有長約70～90 bp的發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體加工而來，具有5’端磷酸基和3’端羥基。miRNA的編碼基因常以單拷貝、多拷貝或基因簇的形式存在于基因組中。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平通過降解靶基因的mRNA或者抑制靶基因mRNA的翻譯來調(diào)控靶基因的表達(dá)，在生物的生長、發(fā)育、代謝和免疫等多種生命活動中發(fā)揮重要作用[1-2]。自第一個miRNA：lin-4從線蟲(Caenorhabditiselegans)中被發(fā)現(xiàn)以來[3]，已有大量miRNA從各種模式生物和非模式生物中陸續(xù)被報道出來，并且miRNA的生物學(xué)發(fā)生、特征、保守性、作用機制以及生物學(xué)功能等也逐漸被人們所闡明。對蝦是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟品種，其miRNA的研究起步較晚，始于2011年，但近6年來取得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展。本文綜述了對蝦miRNA的發(fā)現(xiàn)與鑒定、作用機制及其生物學(xué)功能方面的研究概況，旨在為對蝦miRNA的研究提供參考。

1 對蝦miRNA的發(fā)現(xiàn)與鑒定

對蝦miRNA的發(fā)現(xiàn)主要是通過分子克隆和高通量測序2種方法，而miRNA的鑒定主要有miRNA芯片、熒光實時定量PCR和Northernblot等方法。Ruan等[4]首次從日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)成體血細(xì)胞的總RNA中，分離構(gòu)建了長度為18～28 nt小RNA文庫，并通過熒光實時定量PCR技術(shù)和Northernblot技術(shù)鑒定得到了35個miRNA，并且發(fā)現(xiàn)其中22個miRNA與對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)的感染相關(guān)。此后，蝦類miRNA的發(fā)現(xiàn)則主要采用高通量測序和生物信息學(xué)分析的方法。汪元梅[5]運用了高通量測序技術(shù)從凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)中發(fā)現(xiàn)了355個已知miRNA和32個新miRNA，并結(jié)合miRNA芯片、實時熒光定量PCR和Northernblot，分析了這些miRNA在凡納濱對蝦不同組織中的表達(dá)譜，以及飼料中添加復(fù)合多糖對miRNA表達(dá)量的影響。Xi等[6]對凡納濱對蝦肌肉、鰓和肝胰腺的混合樣本進(jìn)行了小RNA的高通量測序，共獲得了239個已知miRNA和20個新miRNA。Zhou等[7]又從深海熱液噴口蝦(Rimicarisexoculata)的肌肉組織中發(fā)現(xiàn)了159個已知 miRNA和34個新miRNA。此外，Sun等[8]報道了日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)miRNA在低氧條件下的表達(dá)譜變化，共發(fā)現(xiàn)了203個已知miRNA和64個新miRNA，并分析了低氧條件下特異表達(dá)的miRNA。

目前，高通量測序結(jié)合熒光實時定量PCR和Northern blot驗證是發(fā)現(xiàn)與鑒定蝦類miRNA的主要方法，越來越多的研究通過此法獲得對蝦miRNA信息，對蝦的miRNA數(shù)據(jù)庫在不斷地被充實，這將為對蝦miRNA的生物學(xué)功能和作用機制等方面的研究奠定基礎(chǔ)。

2 對蝦miRNA的生物合成與加工成熟及其作用機制

動物miRNA的生物合成與加工成熟依次經(jīng)歷了以下幾步：首先，編碼 miRNA 的基因由 RNA 聚合酶 II 轉(zhuǎn)錄生成具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的pri-miRNA；隨后，RNA酶III-Drosha酶從pri-miRNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖部，通過不對稱剪切，形成60～70 nt的pre-miRNA，形成的pre-miRNA在其5’端有磷酸基團，在 3’端有兩個核苷酸的突出。pre-miRNA 前體能形成典型的莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)含有不完美配對的 dsRNA 區(qū)(莖部)，該區(qū)域通過剪切，最終形成一個或多個miRNA成熟體。接著，運輸?shù)鞍?Exportin-5在Ran-GTP的幫助下將pre-miRNA從細(xì)胞核中轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)中。pre-miRNA 的典型的莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)、磷酸基團和兩個核苷酸的突出，對于Exportin-5與pre-miRNA的相互作用以及pre-miRNA的順利轉(zhuǎn)運都很重要。之后，細(xì)胞質(zhì)中的pre-miRNA又被另一種RNA酶III-Dicer酶進(jìn)一步地加工成熟。Dicer酶的PAZ結(jié)構(gòu)域能識別pre-miRNA莖環(huán)的莖部3’端突出的兩個核苷酸，并剪切去掉單鏈的凸環(huán)，加工釋放一個長度為22 nt的成熟雙鏈RNA，此RNA具有5’端磷酸基團和3’端兩個突出的核苷酸。隨后，其中的一條鏈參與構(gòu)成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)，這條鏈就是成熟的miRNA，而另一條鏈就是miRNA*[1, 9-10]。

在miRNA的加工成熟過程中Drosha酶是一個必不可少的組份，對蝦Drosha酶在基因克隆、序列結(jié)構(gòu)和功能方面的研究已有報道。徐丹丹[11]從對蝦中克隆得到了Drosha基因，并發(fā)現(xiàn)對蝦Drosha蛋白與果蠅(D.Melanogaster)的Drosha蛋白有很高的同源性，具有保守的RNaseIII與dsRBD結(jié)構(gòu)域，在對蝦各組織中均有表達(dá)。Huang等[12]也克隆得到了日本囊對蝦中的Drosha基因，分析了其結(jié)構(gòu)和功能，并且發(fā)現(xiàn)了它的作用之一是直接影響對蝦miRNA的加工成熟過程。RNA聚合酶III Dicer酶也是RNAi通路中的一個關(guān)鍵組份，蝦中的Dicer酶基因也已被成功克隆出來，其表達(dá)和生物學(xué)功能也有了研究報道。Su等[13]從斑節(jié)對蝦中克隆出了Dicer-1基因。Yao等[14]也從凡納濱對蝦中成功克隆了Dicer-1基因的cDNA全長，并且發(fā)現(xiàn)Dicer-1基因與其他物種中的Dicer-1基因具有保守性，與斑節(jié)對蝦中的Dicer-1基因相似性最高，達(dá)97.7%，并且Dicer-1基因在對蝦的各個組織中也均有表達(dá)。后來又有一些研究，分別從凡納濱對蝦[15]、日本囊對蝦和斑節(jié)對蝦[16]中克隆出了Dicer-2基因，并發(fā)現(xiàn)它們之間也具有較高的序列相似性。對蝦中的Dicer-1酶與miRNA的加工有關(guān)，而Dicer-2酶則與長的雙鏈RNA加工成siRNA有關(guān)；此外，Dicer-1和Dicer-2也都與對蝦響應(yīng)病毒感染有關(guān)。miRNA要發(fā)揮其生物學(xué)功能，必須參與構(gòu)成誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)，而Argonaute-2蛋白是該復(fù)合物的重要組份。凡納濱對蝦[15]、日本囊對蝦和斑節(jié)對蝦[17]中的Argonaute-2基因也已被成功克隆，并且研究發(fā)現(xiàn)，它們之間也具有較高的序列相似性。此外，有研究結(jié)果顯示，Argonaute-2蛋白在對蝦中也參與RNAi過程[17]。由于miRNA的加工成熟過程所需要的核心組份具有物種間的高度保守性，因而可以預(yù)見的是，對蝦miRNA的生物合成和加工成熟機制也具有一定的保守性。

miRNA可以通過與靶基因的mRNA的3’UTR(非翻譯區(qū))序列互補配對，介導(dǎo)靶基因mRNA的降解(完全的互補配對)或者翻譯抑制(不完全的互補配對)來調(diào)控靶基因的表達(dá)[1]。這是較早發(fā)現(xiàn)的比較經(jīng)典的miRNA調(diào)控靶基因的模型。后來的研究又發(fā)現(xiàn)，miRNA可以和編碼區(qū)以及5’UTR區(qū)結(jié)合；可調(diào)控某些非編碼基因的表達(dá)；miRNA甚至能夠上調(diào)靶基因的表達(dá)；miRNA還可以通過解除對靶基因的抑制來促進(jìn)其翻譯等[18]。

3 對蝦miRNA的生物學(xué)功能

目前關(guān)于對蝦miRNA的生物學(xué)功能方面的研究主要集中在對蝦與病毒感染和先天性免疫相關(guān)miRNA的研究兩個方面。其中，有3篇報道致力于挖掘?qū)ξr中與病毒感染相關(guān)的miRNA。Zeng等[19]、Huang等[20]和Kaewkascholkul等[21]分別從凡納濱對蝦、日本囊對蝦和斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)中發(fā)現(xiàn)了一系列響應(yīng)WSSV感染的對蝦miRNA。有5篇報道則深入研究了對蝦特定miRNA在響應(yīng)病毒感染過程中所發(fā)揮的作用及其作用機制。Huang等[22]發(fā)現(xiàn)日本囊對蝦miR-7通過靶向作用于WSSV早期基因，從而在宿主-病毒相互作用中發(fā)揮重要功能。Xu等[23]發(fā)現(xiàn)了凡納濱對蝦中的Dorsal/miR-1959/Cactus反饋調(diào)節(jié)環(huán)路能促進(jìn)WSSV的感染，其中，Dorsal蛋白是NF-kB家族成員，Cactus是Dorsal的一個胞質(zhì)抑制劑。Zuo等[24]也報道了凡納濱對蝦中的miR-1959 所介導(dǎo)的NF-kB通路的反饋調(diào)節(jié)環(huán)路，并認(rèn)為此環(huán)路與病原生物感染和免疫刺激相關(guān)。 Huang等[25]發(fā)現(xiàn)羅氏沼蝦(M.rosenbergii)的miR-9041和miR-9850通過調(diào)控STAT(Signal transducer and activator of transcription，STAT)基因，從而促進(jìn)WSSV在宿主中的復(fù)制。Shu等[26]發(fā)現(xiàn)對蝦miR-965通過靶向作用于病毒的wsv240基因，來抑制病毒對對蝦的感染。此外，他發(fā)現(xiàn)對蝦miR-965還能夠靶向作用于對蝦的ATG5基因，從而促進(jìn)對蝦對病毒的吞噬作用。另外，還有6篇報道關(guān)注于對蝦的先天性免疫相關(guān)miRNA。Liu等[27]報道了日本囊對蝦miR-1所介導(dǎo)的對吞噬過程的調(diào)節(jié)作用。Yang等[28]發(fā)現(xiàn)并驗證了日本囊對蝦中與吞噬、凋亡或體液免疫系統(tǒng)相關(guān)的24個miRNA。Yang等[29]指出對蝦miR-100通過調(diào)控胰蛋白酶基因來調(diào)控細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)對蝦的抗病毒能力。Xu等[30]闡釋了對蝦對病毒感染的細(xì)胞免疫反應(yīng)。Gong等[31]報道了miR-1000-p53通路在調(diào)控對蝦細(xì)胞凋亡以響應(yīng)病毒感染中的作用。He等[32]指出對蝦中的兩個miRNA(miR-71和miR-13b)與病毒感染以及宿主的自噬作用有重要的關(guān)系。

此外，Huang等[12]還報道了miRNA加工成熟過程中的一個重要組分—Drosha酶在對蝦抗病毒感染中的重要作用，Labreuche等[33]解析了RNAi機器(RNAi machinery)在對蝦抗病毒中的功能。Su等[13]和Yao等[14]指出對蝦的Dicer-1酶也與對蝦的免疫反應(yīng)有關(guān)。Chen等[15]、Li等[16]和Yang等[17]則分別揭示了對蝦Dicer2酶和Argonaute2蛋白在對蝦免疫反應(yīng)中的作用。這些報道對人們深入了解對蝦病毒感染機制起到了極大的促進(jìn)作用。

了解對蝦病毒自身的miRNA在其對抗宿主免疫反應(yīng)中的作用，可以更清楚地闡明對蝦病毒感染機制。He等[34]研究發(fā)現(xiàn)，在宿主體內(nèi)，病毒的miRNA能通過靶向作用于自身的基因來提高其對對蝦的感染能力。Huang等[35]則發(fā)現(xiàn)了病毒miRNA可參與調(diào)控對蝦血淋巴細(xì)胞的凋亡過程。Ren等[36]報道了在WSSV感染日本囊對蝦時，WSSV中的2個miRNA(WSSV-miR-N13和WSSV-miR-N23)通過靶向作用于Toll通路中的核心基因Dorsal，來抑制對蝦中的Spz-Toll-Dorsal-ALF信號通路，從而促進(jìn)病毒的感染。

當(dāng)然，也有少量報道是關(guān)于對蝦miRNA的其它生物學(xué)功能的，例如：季鵬飛[37]報道了克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)中響應(yīng)鹽脅迫條件的miRNA；Ikeda等[38]則揭示了有“活化石”之稱的蝌蚪蝦(Triopscancriformis)中miRNA的進(jìn)化，同時闡述了其RNAi機器的各組分。隨著研究的不斷深入，相信越來越多的對蝦miRNA的生物學(xué)功能將會被人們所發(fā)現(xiàn)和關(guān)注。

4 展望

對蝦miRNA的研究起步較晚，始于2011年，雖然已在發(fā)現(xiàn)對蝦中與病毒感染和自身免疫相關(guān)的miRNA方面取得了重要的研究進(jìn)展，但尚有許多研究工作有待于進(jìn)一步開展，主要包括：(1)新的對蝦miRNA及其靶基因的挖掘。目前報道的對蝦miRNA的數(shù)量仍比較少，況且miRNA的表達(dá)具有組織特異性和發(fā)育階段的特異性。因此，發(fā)現(xiàn)新的miRNA有利于我們深入理解對蝦的多種生物學(xué)過程。但是，由于目前對蝦的全基因組序列尚未公布，序列信息已知的基因其數(shù)量非常有限，大大限制了對對蝦miRNA的靶基因的挖掘。一旦對蝦的全基因組序列的測序和注釋工作完成，將有效推動對蝦miRNA的生物學(xué)功能及其作用機制的研究進(jìn)展。(2)對蝦miRNA的其它生物學(xué)功能尚有待進(jìn)一步地探索。目前，對蝦miRNA生物學(xué)功能方面的研究的主要關(guān)注點是病毒感染對蝦和對蝦的先天性免疫反應(yīng)過程。然而，這些研究目前大多停留在相關(guān)miRNA的發(fā)現(xiàn)，以及初步揭示這些miRNA與相應(yīng)生命活動之間的相關(guān)性這一層面上。因此，病毒感染對蝦的機理以及對蝦響應(yīng)病毒感染所引發(fā)的先天性免疫反應(yīng)的分子機制仍有待于進(jìn)一步闡明。此外，對蝦miRNA所具有的其他生物學(xué)功能目前報道的仍非常少，因此，發(fā)現(xiàn)對蝦miRNA的其它生物學(xué)功能，尤其是在調(diào)控發(fā)育方面的功能及其作用機制可能成為今后研究的新方向。

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