葛康康 姚翰文 潘佳亮 郝昕 馬玲

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150001)

山核桃(Caryacathayensis)是胡桃科(Juglandaceae)山核桃屬(Carya)的一種干果樹種，落葉喬木[1],具有很高的經(jīng)濟價值和廣闊的發(fā)展前景[2]。山核桃干腐病是近幾年才出現(xiàn)的重要病害，不但影響山核桃的果實產(chǎn)量，而且會削弱樹勢，嚴重時甚至會導(dǎo)致樹木過早死亡，并造成重大經(jīng)濟損失，該病在浙江臨安、淳安、桐廬一帶發(fā)生比較普遍，植株發(fā)病率達80%～100%，最嚴重的造成全株或枝干干枯死亡[3]。2011年首次報道山核桃干腐病病原菌為Botryosphaeriadothidea，屬于子囊菌門葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)的葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)[4]。目前對山核桃干腐病的防治主要停留在物理防治和化學防治階段。章順來的研究表明，山核桃干腐病病部病斑少時，一般采取刮除病部后涂藥；病斑多時，病部劃傷后噴80% 402抗菌劑200倍液的方法進行防治[5]。張傳清等報道V(戊唑醇)∶和V(腐霉利)=1∶5復(fù)配后對山核桃干腐病具有協(xié)同增效作用[6]?；瘜W藥劑的使用不僅會破壞生態(tài)環(huán)境,而且影響果實品質(zhì),甚至可能造成食品安全問題。為了能夠解決以上問題,尋找能夠高效防治山核桃干腐病的低毒或無毒生防制劑勢在必行。

生物防治具有無毒、無殘留和無污染等特點，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一種嗜熱的好氧革蘭氏陽性菌[7-8]，能夠抑制多種根部病害、枝干病害、葉花部病害的病原菌[9],是一種理想的生防微生物。范青等用從北京蘋果園土壤中分離的枯草芽孢桿菌B-912防治柑桔青霉病、綠霉病均取得較好的抑制效果[10]，何紅等[11]發(fā)現(xiàn)來自辣椒體內(nèi)的枯草芽孢桿菌菌株對香蕉炭疽病菌菌絲生長、分生孢子形成及萌發(fā)等有較強的抑制作用，林東等發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對水稻白葉枯病菌具有強烈的抑菌作用[12]。本研究在山核桃干腐病病原菌的培養(yǎng)過程中分離到1株具有抑菌活性的生防菌，并對其進行了分離純化、抑菌活性測定和鑒定等方面的研究,以期為山核桃干腐病的生物防治提供參考。

1 材料

1.1 供試菌株

山核桃干腐病病原菌來自浙江林業(yè)科技大學病理組病理實驗室，枯草芽孢桿菌菌株BS111分離自環(huán)境中，二者均保存在東北林業(yè)大學林學院。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(LB)：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH=7.4～7.6,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

LB液體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，水1 000 mL，pH=7.4～7.6,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

2 研究方法

2.1 拮抗菌BS111的分離純化

在培養(yǎng)核桃干腐病菌的過程中，分離到1株對核桃干腐病菌有明顯抑制作用的拮抗細菌，采用劃線法用接種環(huán)挑取單菌落將其在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上進行劃線培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)24 h后，對菌落大小、色澤、表面光滑度及邊緣形狀等進行觀察,并挑取單菌落進行純化[13]，命名為BS111，將純化后的菌種在冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 拮抗菌BS111的鑒定

采用CTAB法提取DNA，PCR擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后將未純化產(chǎn)物送往北京生物工程科技有限公司進行測序。測序引物為27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。根據(jù)16 S rDNA的測序結(jié)果，在NCBI上應(yīng)用BLAST進行序列比對，結(jié)合GenBank中芽孢桿菌屬中的15個種的16 S rDNA，利用MEGA5.1軟件和ClustalW軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[15]《微生物學實驗手冊》[15]進行鑒定，分別進行接觸酶、V-P測定、厭氧生長、糖發(fā)酵產(chǎn)酸、醇發(fā)酵產(chǎn)酸、水解淀粉、檸檬酸鹽利用、苯丙氨酸脫氫酶、硝酸鹽還原、吲哚實驗、酪素水解、7% NaCl耐受度、pH=5.7耐受度、高溫65 ℃耐受度等生理生化鑒定。將生防菌在LB固體培養(yǎng)基上進行劃線培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，并進行芽孢染色和鞭毛染色。

2.3 拮抗菌BS111的抑菌活性測定

采用平板對峙法進行拮抗菌的抑菌活性測定[16]。用打孔器(Φ=4 mm)在培養(yǎng)3 d的山核桃干腐病病原菌菌落邊緣打取菌餅，接于PDA平板中央，在其四周距培養(yǎng)皿邊緣25 mm處接種拮抗菌，以不接拮抗菌為對照，于恒溫箱中25 ℃培養(yǎng),每個處理3個重復(fù)。測量抑菌圈直徑。

2.4 不同發(fā)酵時間拮抗菌BS111發(fā)酵液抑菌活性的測定

挑取拮抗菌BS111單菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基中，150 r/min，25 ℃搖床振蕩培養(yǎng)；每隔2 h取一次樣，測生長曲線(OD600)。取發(fā)酵液4 ℃、8 000 r/min、離心30 min，取上清液過0.22 μm濾膜，制成無菌濾液，每隔12 h取一次樣，測無菌濾液對山核桃干腐病病原菌抑菌活性；比較生長曲線和抑菌活性隨時間變化的關(guān)系，以及抑菌活性物質(zhì)積累的最佳培養(yǎng)時間，以未接菌的培養(yǎng)液為對照。

抑菌率=(對照組菌絲直徑-試驗組菌絲直徑)/(對照組菌絲直徑-0.4)×100%。

2.5 不同體積分數(shù)拮抗菌BS111發(fā)酵液抑菌活性的測定

取搖床培養(yǎng)72 h的無菌濾液溶于50 ℃ PDA，制成體積分數(shù)為15.00%、10.00%、7.50%、5.00%、2.50%、1.25%的帶藥平板，用打孔器(Φ=4 mm)在培養(yǎng)3 d的山核桃干腐病病原菌菌落邊緣打取菌餅,接于帶藥平板中央,3 d后測菌絲直徑，并計算抑菌率，每組3次重復(fù)。

2.6 拮抗菌BS111發(fā)酵液抑菌活性穩(wěn)定性的測定

熱處理對發(fā)酵液抑菌活性的影響：取相同體積的6份發(fā)酵上清液通過0、10、20、30、40、50 ℃水浴鍋處理30 min，以未處理的無菌濾液為對照，過0.22 μm濾膜，測抑菌活性。

酸堿處理對發(fā)酵液抑菌活性的影響：取相同體積的7份發(fā)酵上清液，分別用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵上清液，pH值為3.0、4.5、5.5、6.5、7.5、8.0、9.0，靜置2 h后，再用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)到pH為7.0，以未處理的無菌濾液為對照，過0.22 μm濾膜，測抑菌活性。

紫外線處理對發(fā)酵液抑菌活性的影響：取相同體積的4份發(fā)酵上清液分別放在紫外光下照射15、30、60、120 min，以未處理的無菌濾液為對照，過0.22 μm濾膜，測抑菌活性。

2.7 拮抗菌無菌濾液對山核桃干腐病病原菌菌絲生長的影響

在培養(yǎng)3 d的山核桃干腐病病原菌菌落邊緣打取菌餅,接于帶有無菌濾液的PDA帶藥平板中央,以未接菌的培養(yǎng)液為對照,3 d后挑取菌絲在光學顯微鏡下觀察其形態(tài)變化。

3 結(jié)果與分析

3.1 拮抗菌BS111培養(yǎng)性狀

在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h的菌株(圖1)，菌落為白色橢圓形，邊緣整齊，中間凹陷有褶皺，表面比較粗糙，不透明，在液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d有菌膜產(chǎn)生，革蘭氏染色為陽性。

圖1 拮抗細菌BS111的培養(yǎng)性狀

3.2 拮抗菌BS111 16 S rDNA分子鑒定

菌株BS111的16 S rDNA經(jīng)PCR擴增得到1條約為1.5 kb的特征帶(圖2)，將PCR后的片段送交北京生物工程進行測序，測序結(jié)果表明，該菌株16 S rDNA序列全長為1 129 bp，該序列通過NCBI(http:

www.ncbi.nlin.nili.gov)進行BLAST比對，其中，BS111與JQ308575Bacillussubtilis的同源性最高，達到99%。

M.2 kb Mark；B.BS111菌株。

將得到的菌株BS111序列與Genbank中的枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(B.methylotrophicus)、死谷芽孢桿菌(B.vallismortis)、貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)等菌株的16 S rDNA序列進行比對。從圖3的系統(tǒng)發(fā)育樹可看出,不同的芽孢桿菌種間自然地形成不同的分支,BS111位于枯草芽孢桿菌的分支中，且與登錄號為JQ308575的枯草芽孢桿菌的序列相似性高達100%。

圖3 拮抗菌株BS111的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

3.3 拮抗菌BS111生理生化鑒定

對菌株BS111各項生理生化指標的測定結(jié)果表明，接觸酶反應(yīng)為陽性，V-P測定呈陽性，能夠利用葡萄糖和甘露醇，并且產(chǎn)酸，但不產(chǎn)氣，厭氧條件下不能生長，能夠利用檸檬酸鹽，不能形成吲哚，苯丙氨酸脫氫酶反應(yīng)為陰性，能夠水解淀粉，在7% NaCl培養(yǎng)基上能夠生長，在65 ℃高溫條件下不能生長，在pH=5.7的酸性條件下不能生長。通過與枯草芽孢桿菌進行對比，發(fā)現(xiàn)BS111除不能在pH=5.7的酸性條件下生長外，其余都與枯草芽孢桿菌的生理生化指標相同，故可以鑒定BS111為枯草芽孢桿菌。

3.4 拮抗菌株BS111對山核桃干腐病病原菌的抑制作用

通過平板對峙法可以看出，枯草芽孢桿菌BS111菌體能夠抑制山核桃干腐病病原菌的生長(圖4)。抑菌圈平均直徑為18 mm。

圖4 拮抗菌BS111對山核桃干腐病病原菌的抑制作用

3.5 拮抗菌BS111生長曲線及抑菌活性隨時間變化情況

對拮抗菌BS111生長曲線進行測定，以檢測菌體生長狀況。結(jié)果如圖5所示，枯草芽孢桿菌BS111在12～24 h為對數(shù)期，24 h后菌體數(shù)量進入穩(wěn)定期，36 h后菌體進入衰亡期。對不同時間點的無菌濾液進行抑菌能力測定，無菌濾液在前12 h抑菌率幾乎為0，此時無菌濾液對山核桃干腐病病原菌幾乎無抑制效果，在24 h時抑菌率迅速增長至70.65%，在24～60 h，抑菌率變化在70.65%～77.85%，變化差異不明顯，在60～72 h，抑菌效果有明顯提高，最高抑菌率為83.26%。此結(jié)果表明，無菌濾液在不同時間段內(nèi)抑菌差異顯著(P<0.05)。

圖5 拮抗菌株BS111生長曲線與無菌濾液抑菌率

3.6 拮抗株BS111發(fā)酵液抑菌活性及其穩(wěn)定性

對不同體積分數(shù)發(fā)酵液抑菌活性的測定結(jié)果見圖6。隨著發(fā)酵液體積分數(shù)的降低，抑菌率明顯降低，其中15%的抑菌效果最好，抑菌率為86.82%(表1)，該拮抗菌的EC50為4.16%，回歸方程為y=1.942x-1.203，相關(guān)系數(shù)為0.969。

表1 不同體積分數(shù)拮抗菌株BS111發(fā)酵液的抑菌活性

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差，同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

0、10、20、30、40、50 ℃水浴分別處理30 min后的BS111無菌濾液對山核桃干腐病的抑菌活性見表2。從表2可以看出，用不同溫度處理過的無菌濾液抑菌效果有明顯區(qū)別。0 ℃處理后發(fā)酵上清液對山核桃干腐病病原菌的抑菌效果最好，抑菌率為(62.29±0.13)%，遠遠大于對照組抑菌率(42.94±0.11)%，在0～20 ℃，抑菌率雖然有下降趨勢，但是都高于對照組，在30～50 ℃時，抑菌率和對照組差異不顯著。由此可以看出，該無菌濾液在0～20 ℃低溫條件下的抑菌效果比高溫條件下好，在30～50 ℃高溫條件下抑菌效果差異不明顯。

a.15%的發(fā)酵液；b.10%的發(fā)酵液；c.7.5%的發(fā)酵液；d.5%的發(fā)酵液；e.2.5%的發(fā)酵液；f.1.25%的發(fā)酵液；CK.對照組。

經(jīng)不同酸堿處理后的無菌濾液的抑菌活性有顯著變化。pH=3.0～5.5處理2 h后，抑菌率為(33.38±0.24)%～(36.59±0.28)%，明顯小于對照組抑菌率(40.49±0.35)%，經(jīng)pH=6.5～8.0處理2 h后抑菌率為40%～43%，與對照組差異不明顯，經(jīng)pH=9.0處理2 h后，抑菌率為(46.62±0.23)%，明顯大于對照組。由此可以看出，無菌濾液的抑菌活性隨著pH的升高，抑菌活性上升，且在pH=9.0時抑菌效果最好，無菌濾液在pH=6.5～8.0時抑菌活性穩(wěn)定。無菌濾液經(jīng)紫外處理后，抑菌率高于或接近對照組，并且隨著紫外處理時間的延長，抑菌效果有明顯提高，120 min時抑菌效果最好，抑菌率為(57.55±0.18)%。

表2 拮抗菌株BS111發(fā)酵液抑菌活性穩(wěn)定性

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差，同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3.7 拮抗處理后山核桃干腐病病原菌菌絲生長的顯微觀察

對照組和處理組菌絲的顯微形態(tài)觀察結(jié)果表明,山核桃干腐病病原菌菌絲經(jīng)拮抗菌BS111無菌濾液處理后菌絲形態(tài)出現(xiàn)異常。對照組菌絲在生長過程中，菌絲細長，處理組菌絲表現(xiàn)出菌絲變粗，彎曲，有褶皺，部分原生質(zhì)體消失,菌絲頂端膨大變粗等特點(圖7)。

a、b.為正常生長的菌絲；c、d.為發(fā)酵液處理過的菌絲。

4 結(jié)論與討論

目前，對山核桃干腐病的防治主要采用化學藥劑，但化學藥劑在防治病害的同時也對當?shù)厣鷳B(tài)產(chǎn)生嚴重的影響，因此高效低毒的生防制劑產(chǎn)品成為山核桃生產(chǎn)發(fā)展的迫切需要[17]。枯草芽孢桿菌是一種非常廣譜的拮抗細菌，侯琿等發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對番茄莖基腐爛病菌和葡萄灰霉病菌具有抑制作用[18]，吳麗媛從土壤中分離出能夠抑制甜瓜細菌性果斑病的拮抗細菌枯草芽孢桿菌[19]，吳輝等從土壤中分離到1株具有高效拮抗辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)的生防菌Bs04[20]，本研究分離到的拮抗菌BS111對山核桃干腐病病原菌具有較好的抑菌效果，經(jīng)鑒定拮抗菌BS111為枯草芽孢桿菌。關(guān)于枯草芽孢桿菌防治山核桃干腐病病的研究在國內(nèi)尚鮮見相關(guān)報道，這為山核桃干腐病生防制劑開發(fā)提供了材料。

本研究通過對拮抗菌無菌濾液的抑制作用測定表明,拮抗菌無菌濾液能夠顯著抑制山核桃干腐病病原菌菌絲生長,且在發(fā)酵72 h時抑菌效果最好，這說明拮抗菌在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生能夠抑制山核桃干腐病病原菌菌絲生長的次生代謝產(chǎn)物,由此表明拮抗菌BS111在大量發(fā)酵后對山核桃干腐病的防治具有很好的應(yīng)用價值。本研究對拮抗菌BS111進行了鑒定，并對其拮抗作用和抑菌活性進行了研究,而對其發(fā)酵條件的優(yōu)化、抗菌活性物質(zhì)的提取鑒定及田間防效還有待于進一步深入研究。

拮抗細菌在植物病害防治中起到非常重要的作用。林業(yè)上施用的生物抗生素或其他拮抗蛋白等和常規(guī)有機合成農(nóng)藥一樣，都要受到環(huán)境的影響[21]。在生物農(nóng)藥的活性成分分離、提純、濃縮等所有的生產(chǎn)加工過程中也都需要獲得其對光、熱等各種條件的穩(wěn)定性。本研究研究了其發(fā)酵產(chǎn)物在經(jīng)過紫外線、熱、酸堿等條件的處理后抗菌活性的變化，表明該拮抗菌具有很好的生防潛力。

吳輝等[20]通過光學顯微鏡觀察Bs04對辣椒疫霉菌絲形態(tài)的影響,發(fā)現(xiàn)菌絲分支增多、頂端畸形、原生質(zhì)濃縮及生長緩慢等現(xiàn)象。本試驗顯微觀察抑菌作用的結(jié)果為菌絲變粗、彎曲、有褶皺、部分原生質(zhì)體消失、菌絲頂端膨大變粗等特點，對于具體抑菌機理有待進一步的研究。

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