陶澤宇 李龍 楊小淮

腎細(xì)胞癌(RCC)是臨床上最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一。腎細(xì)胞癌的發(fā)病率僅次于膀胱癌，并逐年增加[1]。30%～50%的腎細(xì)胞癌缺乏早期臨床表現(xiàn)，20%～30%的腎細(xì)胞癌早期出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，即便未出現(xiàn)早期轉(zhuǎn)移的患者經(jīng)手術(shù)干預(yù)后也會復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，所以早期診斷和及時治療非常重要[2]。目前臨床上腎細(xì)胞癌的診斷以影像學(xué)檢查、穿刺活檢等為主，缺乏精準(zhǔn)無創(chuàng)的方法。CAⅨ作為一種新型碳酸酐酶異構(gòu)體，在研究中發(fā)現(xiàn)與腎癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，該結(jié)構(gòu)在VHL（Von hippellindau）基因的下游，由缺氧誘導(dǎo)因子-1 (HIF-1)通路激活[3]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，CAⅨ可作為RCC診斷和治療的新靶點。腎癌的主要病理類型為透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌(ccRCC)，占60%～85%[4]。本研究利用免疫組化SP法檢測腎透明細(xì)胞癌中CAⅨ的表達(dá)情況并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取我院2015～2017年腎癌根治術(shù)后病理標(biāo)本中腎透明細(xì)胞癌標(biāo)本60例，其中男37例，女23例；年齡27～75歲，平均53歲；采用2010年AJCC的TNM分期和AJCC分期組合：其中Ⅰ期18例，Ⅱ期29例，Ⅲ期10例，Ⅳ期3例；以20例其他少見類型腎癌標(biāo)本和30例正常腎組織標(biāo)本作為對照。其中，8例腎乳頭狀癌，7例腎嫌色細(xì)胞癌，3例Bellini集合管癌，2例囊性腎細(xì)胞癌，正常腎組織標(biāo)本均取自單純性腎切除術(shù)后。標(biāo)本均在35%甲醛溶液固定后包埋于蠟塊中。實驗材料包括：CAⅨ單抗、二甲苯、PBS緩沖劑、DAB顯色劑、枸櫞酸緩沖液等。

1.2 方法 ①烤片:于70℃烤片機中烤20min。②二甲苯脫蠟后梯度乙醇脫水:組織切片浸泡于二甲苯中20min→更換50%二甲苯浸泡5min→100%酒精5min→80%酒精5min→70%酒精5min。蒸餾水:洗脫5min，2次。③阻滅內(nèi)源性過氧化物酶:3%過氧化氫37℃孵育10min，PBS清洗15min。④抗原修復(fù):0.01 M檸檬酸緩沖液(pH 6.0)，煮沸(95℃，15～20min)，冷卻 25min，冷水冷卻至室溫后清洗，再用PBS洗滌10min。⑤染色觀察:置于4℃恒溫箱加入CAⅨ單克隆抗體孵育過夜，DAB染色劑染色。成功染色后，用蒸餾水沖洗，并在顯微鏡下觀察蓋玻片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

60例ccRCC標(biāo)本中CAⅨ的陽性表達(dá)率為85.0%(51/60),正常腎組織中CAⅨ陽性表達(dá)率為0。CAⅨ在腎乳頭狀癌中陽性表達(dá)率為25.0%(2/8)，在嫌色細(xì)胞癌中陽性表達(dá)率為14.3%(1/7)，在Bellini集合管癌和囊性腎細(xì)胞癌中無陽性表達(dá)。CAⅨ在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)水平明顯高于正常腎組織和其他少見類型腎癌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=99.2，P＜0.05）。

3 討論

腎細(xì)胞癌約占成人惡性腫瘤的2%～3%，是第二常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于膀胱癌，呈逐年上升趨勢[4]。因缺乏特征性臨床表現(xiàn)，早期僅6%～10%患者會出現(xiàn)典型的血尿、腰痛、腹部腫塊等，大部分為無癥狀腎癌，約占63%[5]，所以腎癌的早期診斷和治療非常重要。目前，早期腎癌的診斷主要依靠影像學(xué)方法和臨床醫(yī)師的經(jīng)驗，具有偶然性和不確定性，尚無特異性腫瘤篩查方法。此外，對于晚期腎癌仍無有效的治療方法。

CAⅨ在正常組織中表達(dá)水平極低，僅在成人輸精管上皮、膽管、脈絡(luò)膜血管叢、小腸和腮腺等組織中散在表達(dá)，而在胎兒成熟的肺和肌肉組織中具有較高的表達(dá)[6]。但在腎癌中CAⅨ的表達(dá)與其他組織表達(dá)機制不同，可能與缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)和其它轉(zhuǎn)錄因子被充分羥基化有關(guān)。CAⅨ是VHL-HIF信號通路的下游基因，VHL是一種腫瘤抑制基因，VHL蛋白具有降解HIF的作用，能夠維持正常細(xì)胞的有氧微環(huán)境。當(dāng)VHL突變或丟失，HIF在細(xì)胞內(nèi)累積，在腫瘤細(xì)胞周圍形成缺氧的微環(huán)境并激活其下游靶基因CAⅨ[7]。CAⅨ是一種由酸性氨基酸組成的跨膜糖蛋白，它可以將細(xì)胞內(nèi)的H+通過H+-Na+離子泵輸送到細(xì)胞外[8]。兩者共同造成適合腫瘤生長的酸性缺氧微環(huán)境。

腎癌尚缺乏早期診斷手段，而CAⅨ在腎癌中的特殊高表達(dá)性可作為潛在腫瘤標(biāo)志物的依據(jù)，因CAⅨ主要存在于腎癌腫瘤細(xì)胞，在外周血幾乎檢測不到CAⅨ，所以有學(xué)者提出檢測腎癌患者外周血中的CAⅨ-mRNA來間接判斷原發(fā)腫瘤中CAⅨ的水平。Mckieman等[9]應(yīng)用RT-PCR技術(shù)研究腎細(xì)胞癌患者的外周血CAⅨ-mRNA表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在46%未轉(zhuǎn)移以及56%已轉(zhuǎn)移腎細(xì)胞癌患者的外周血中出現(xiàn)陽性表達(dá)，而腎良性病變患者不表達(dá)。通過統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CAⅨ-mRNA具有97.6%的特異性和48.7%的敏感性。國內(nèi)學(xué)者向萌[10]利用RT-PCR技術(shù)，檢測30例腎細(xì)胞癌患者及30例腎良性病變患者外周血中CAⅨ-mRNA水平，結(jié)果顯示，腎細(xì)胞癌患者外周血中CAⅨ-mRNA陽性表達(dá)率為43%(13/30)，而腎良性病變患者外周血中均呈陰性，且腎透明細(xì)胞癌患者外周血中CAⅨ-mRNA的陽性表達(dá)率54.5%(12/22)明顯高于其他組織類型(P＜0.05)。說明CAⅨ作為腎癌腫瘤標(biāo)志物時具有高度特異性，但敏感性較差，無論有無早期轉(zhuǎn)移，均能在外周血中檢測到CAⅨ-mRNA，且在腎透明細(xì)胞癌中更加敏感。

對于腎癌的非手術(shù)治療，目前主要利用CAⅨ的免疫源性在體外構(gòu)建其單克隆抗體復(fù)合體，目前主流的嵌合型mAb-CAⅨ(WX-CAIX)在腎癌組織中有很高的濃聚性，可用于診斷及治療。Siebels等[11]實驗中將WX-CAⅨ與低劑量干擾素-α（LD-IFNα）聯(lián)合用于治療進(jìn)展期轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌（mRCC），26例根治性腎切除術(shù)后患者被納入試驗，結(jié)果顯示42%（11/26）患者療效顯著。接受延長治療的患者比16周停藥患者的2年生存率更長（79% vs 30%，P=0.0083）。Bleumer等[12]進(jìn)行了相同的實驗，共納入36例mRCC患者，均未出現(xiàn)藥物相關(guān)的Ⅲ或Ⅳ級毒性反應(yīng)，只有3例患者出現(xiàn)了可能與研究藥物相關(guān)的Ⅱ級毒性反應(yīng)。上述兩者實驗結(jié)果證實該治療安全可靠，耐受性良好，且藥物毒性小。

本實驗中腎癌CAⅨ的測定主要取自術(shù)后病理，反映的主要是腫瘤局部CAⅨ的表達(dá)水平，對診斷和治療的指導(dǎo)意義尚存在局限性，但對腎癌患者的預(yù)后判斷具有重要價值。Bui等[13]對腎癌病理組織中CAⅨ進(jìn)行染色率測定，以85%為界限，結(jié)果顯示高染色率患者的總體生存中位數(shù)為24.8個月，而低染色率為5.5個月，結(jié)果表明低表達(dá)CAⅨ是預(yù)后差的標(biāo)志。而本實驗中60例腎透明細(xì)胞癌的CAⅨ在TNM分期Ⅰ、Ⅱ期的陽性表達(dá)率明顯高于Ⅲ、Ⅳ期（97.9%vs 38.5%，P＜0.05），與上述實驗結(jié)論吻合。傳統(tǒng)分期對預(yù)后判斷有局限性，加利福尼亞大學(xué)在其開發(fā)的UISS腎癌風(fēng)險分級系統(tǒng)基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，將CAⅨ加入評價系統(tǒng)，將腎癌患者分為低、中、高3個風(fēng)險組，利用基因芯片技術(shù)對腎癌組織進(jìn)行多分子檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CAⅨ高表達(dá)是預(yù)后良好的標(biāo)志[14]，這種定量測定技術(shù)使腎癌預(yù)后判斷效率和準(zhǔn)確性大大提高。本實驗中腎透明細(xì)胞癌組中CAⅨ的陽性表達(dá)率為85.0%(51/60)，明顯高于其他組，而臨床上最常見的腎癌類型即腎透明細(xì)胞癌，所以該方法對大部分腎癌患者預(yù)后判斷具有重要的指導(dǎo)意義。

綜上所述，CAⅨ在腎細(xì)胞癌尤其是腎透明細(xì)胞癌中高度表達(dá)，在正常的腎組織中無表達(dá)，這種表達(dá)特異性使得CAⅨ在腎癌診斷、治療及預(yù)后評估方面具有很高的研究價值，特別是作為腫瘤標(biāo)志物和靶向治療藥物，尚需要更多的臨床試驗來驗證CAⅨ的臨床價值。