陳興銀，彭昌琴，陸贈玉，楊 鵬，關 萍

(貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

刺梨(RoseroxburghiiTratt)，又名送春歸、文先果，薔薇科薔薇屬多年生落葉灌木[1]。原產于云貴高原。主要分布貴州、四川、重慶等地[2]。前人研究報道，刺梨的抗氧化、防癌、抗輻射、消炎等藥理作用具有極高的醫(yī)療價值。刺梨中含有豐富Vc、多種人體必需氨基酸、黃酮、多糖等物質，具有進一步加工成品的價值，尤其因果實富含Vc而備受國內外關注，同時還具有觀賞價值[3-5]。ISSR是Zietkiewicz在1994年所建立的一種分子標記技術[6]。ISSR同時具備RAPD、SSR技術的優(yōu)點，且具有操作簡單、多態(tài)性和重復性好等優(yōu)點。目前ISSR已被廣泛應用于植物遺傳多樣性及植物系統(tǒng)演化、分類等研究[7]。鄢秀芹等對刺梨轉錄組SSR信息分析[8]。文曉鵬等利用RAPD、AFLP分子標記技術對不同自然分布區(qū)刺梨的遺傳多樣性進行研究，結果表明來自貴州的刺梨遺傳多樣性最為豐富[9，10]?；谫F州地區(qū)刺梨遺傳多樣性豐富進一步利用ISSR分子標記技術對貴州不同地區(qū)野生刺梨及近緣種無籽刺梨親緣關系近分析。為進一步對刺梨親緣關系的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

用于ISSR分子標記的14份樣品，13份都來自于貴州不同地區(qū)，及一份來自于重慶的(表1)。各樣品均采集新鮮葉片作為材料，采集后立即用硅膠干燥、保存?zhèn)溆?。其?中樣品所對應的序號也是個樣品的代號。

表1 研究所用材料名稱、來源Tab.1 List of materials used in the study

1.2 試驗方法

1.2.1基因組總DNA的提取 取新鮮葉片放于冰盒中，帶回-20℃保存?zhèn)溆?，植物DNA采用天根公司植物DNA提取試劑盒提取。DNA提取后，1%瓊脂糖凝膠和紫外分光光度計檢測DNA的質量和濃度，DNA濃度稀釋至20 ng/μL，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物的合成與篩選 ISSR引物的合成根據(jù)加拿大哥倫比亞大學(University of BritisHColumbia，UBC)公布的引物序列(http： / /www.biotech.ubc.ca /services / naps / primers.html)，由昆明碩擎有限公司合成，共50條，從中篩選出擴增產物條帶清晰、多態(tài)性較好的13條引物用于刺梨與無籽刺梨資源遺傳多樣性擴增分析。

1.2.3ISSR反應體系及程序 ISSR反應體系為：25 μL反應體系，1 μLDNA模板，1 μL引物，12.5 μLMix，Mix和分子量標準為DL2000的Maker購于昆明碩擎有限公司，其余用ddH2O補齊。擴增程序參照楊帆等(2011)[11]：94℃預變性4 min，94℃變性15 s，58℃退火35 s，72℃延伸90 s，94℃變性15 s，57℃退火35 s，72℃延伸90 s，94℃變性15 s，56℃退火35 s，72℃延伸90 s，94℃變性15 s，55℃退火35 s，72℃延伸90 s，94℃變性15 s，54℃退火35 s，72℃延伸90 s，然后進入下列循環(huán)：94℃變性15 s，53℃退火35 s，72℃延伸90 s，共計35個循環(huán)，結束后72℃延伸10 min。PCR產物4℃保存。取5 μL在2.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳1 h左右，電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照保存。

1.2.4數(shù)據(jù)處理 ISSR-PCR擴增產物按條帶的有無分別統(tǒng)計條帶。有條帶記為1，無條帶記為0，把得到的0，1分布矩陣從Excel 2003中導入軟件NTsys 2.10e中，用SM法計算遺傳相似系數(shù)，用UPGMA法進行聚類分析，構建樹狀聚類圖。

2 結果與分析

2.1 ISSR擴增結果

本實驗用50條引物對14份材料基因組DNA進行預擴增篩選引物，ISSR擴增結果見表2。13條引物對14份樣品進行擴增，共擴增出162條DNA條帶，其中150條為多態(tài)性條帶。擴增出來引物的條帶數(shù)在4～22之間，平均為12.5條，多態(tài)百分率為92.54%，有10條引物擴增的多態(tài)性百分率為100%。其中UBC881擴增出來的條帶最多(22條)，圖1是引物UBC881 ISSR擴增出來的結果。

表2 ISSR引物序列及擴增多態(tài)性百分比Tab.2 ISSR primer sequences and I percentage of amplified polymorphism

圖1 UBC881引物的電泳結果 M.DL2000 maker

2.2 樣品遺傳相似系數(shù)的ISSR分析

13對引物組合擴增得到162條帶，用NTsys2.10e軟件計算各個樣品間的遺傳相似性系數(shù)，表3。由表3可知，來自貴州不同地區(qū)的14個野生樣品，其相互間的相似系數(shù)為0.50～0.85。相似系數(shù)最大樣品組合有兩個，分別是來自安順關嶺縣與六盤水的刺梨、貴陽息烽與六盤水的刺梨，相似系數(shù)均為0.85。相似系數(shù)最小樣品組合為來自黔西南興仁的刺梨與貴陽植物園無籽刺梨，相似系數(shù)為0.50。相似系數(shù)在0.8及以上的組合有8個，分別為來自貴陽燕樓鄉(xiāng)與安順關嶺縣、畢節(jié)七星關區(qū)與貴陽息烽的刺梨，相似系數(shù)均為0.83。來自畢節(jié)七星關區(qū)分別與安順關嶺縣、六盤水的刺梨組合，相似系數(shù)均為0.82。來自安順關嶺縣分別與貴陽花溪、貴陽息烽的刺梨組合，相似系數(shù)均為0.80。刺梨與無籽刺梨之間相似系數(shù)為0.50～0.67。來自貴陽植物園無籽刺梨分別與六盤水、黔西南興仁的刺梨組合，相似系數(shù)分別為0.67、0.50。無籽刺梨互相間的相似系數(shù)為0.56～0.78。來自貴陽植物園與黔西南興仁的野生無籽刺梨、來自安順光枝無籽刺梨組合相似系數(shù)分別為0.56、0.67。來自安順光枝無籽刺梨與黔西南興仁的野生無籽刺梨相似系數(shù)為0.78。刺梨間相互的相似系數(shù)為0.55～0.85。

2.3 樣品UPGMA聚類結果分析

由圖2可看出，來自銅仁梵凈山、貴陽燕樓鄉(xiāng)、安順關嶺縣、六盤水、畢節(jié)七星關區(qū)、貴陽息烽的刺梨聚為一支，且來自安順關嶺縣刺梨與六盤水刺梨相距最近，親緣關系最近。來自重慶開縣的刺梨單獨聚為一支。來自遵義桐梓、貴陽花溪、遵義道真縣的刺梨聚為一支，來自貴陽花溪刺梨與遵義道真縣的刺梨親緣關系較近。安順，光枝無籽刺梨與黔西南興仁野生無籽刺梨聚為一支，來自黔西南興仁的刺梨與貴陽植物園無籽刺梨單獨聚為一支。

表3 11份野生刺梨和無籽刺梨資源的遺傳相似系數(shù)Tab.3 Genetic similarity coefficients of R. roxburghii and R. sterilis material

圖2 11份刺梨和3份無籽刺梨植物材料的UPGMA聚類樹狀圖Fig.2 UPGMA dendrogram of 11 R. roxburghii and 3 R. sterilis

3 討 論

在親緣關系上，相似系數(shù)越大，親緣關系也越近。ISSR分析結果顯示，同屬遵義市桐梓縣和道真縣的刺梨，遵義道真縣與貴陽花溪親緣關系比與遵義桐梓的近。同屬花溪區(qū)的刺梨，貴陽花溪燕樓鄉(xiāng)與貴陽息烽縣的親緣關系比與貴陽花溪大。貴州關嶺縣和貴州六盤水相似系數(shù)最大(0.85)，親緣關系最近。說明刺梨間的親緣關系與地理分布沒有相關性。此結果與文曉鵬對30份不同地方野生刺梨多樣性分析的相一致。2009年，安明態(tài)等發(fā)現(xiàn)貴州薔薇屬的一個新變種，發(fā)布新種為光枝無籽刺梨[12]。表2中不同地方的野生刺梨的遺傳相無籽刺梨間相似系數(shù)為0.56～0.78，組合為黔西南興仁野生無籽刺梨和安順光枝無籽刺梨的相似系數(shù)最大為0.78，其數(shù)值處于刺梨相互間遺傳系數(shù)0.55～0.85間，且大于刺梨與無籽刺梨相互間的最大相似系數(shù)0.67。據(jù)此可認為來自黔西南野生興仁無籽刺梨和安順光枝無籽刺梨是同一個種。其結果與李旦等利用AFLP分子標記和DNA條形碼對無籽刺梨鑒定中得到興仁無籽刺梨與安順光枝無籽刺梨為同一種的結果相一致[13]。

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