何秋菊 王麗琴

摘 要 豆?jié){水是中國(guó)傳統(tǒng)書(shū)畫(huà)修復(fù)中的施膠材料，加熱可導(dǎo)致大豆蛋白產(chǎn)生熱變性，使紙張產(chǎn)生不同程度的疏水性，從而影響到書(shū)畫(huà)修復(fù)的效果。本研究利用8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS）熒光探針?lè)ǚ治龃蠖沟鞍自诩訜徇^(guò)程中疏水性的變化； 利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析加熱前后的蛋白質(zhì)差異條帶，并以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）進(jìn)行蛋白鑒別； 衰減全反射傅里葉變換紅外光譜法（ATR-FTIR）去卷積、二階導(dǎo)數(shù)曲線擬合分析不同加熱溫度豆?jié){水大豆蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。ANS熒光探針實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，80℃的豆?jié){水的疏水性最大。SDS-PAGE與LC-MS/MS分析表明，加熱消失的兩個(gè)條帶的蛋白分別為球蛋白Glycinin G3亞基及糖蛋白凝集素Lectin亞基； ATR-FTIR分析表明，隨著溫度從25℃上升到80℃，大豆蛋白β-片層結(jié)構(gòu)含量由41.14%增加到48.87%，α-螺旋、 β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)向β-片層結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，而β-片層結(jié)構(gòu)含量與表面疏水性呈正相關(guān)，加熱溫度為80℃的豆?jié){水最適于書(shū)畫(huà)修復(fù)。

關(guān)鍵詞 豆?jié){水； 加熱溫度； 宣紙； 大豆蛋白； 疏水性

1 引 言

古書(shū)畫(huà)修復(fù)是一種搶救、保護(hù)古舊殘損書(shū)畫(huà)作品的傳統(tǒng)技藝。豆?jié){水作為天然植物蛋白膠結(jié)物用作書(shū)畫(huà)修復(fù)用紙絹的施膠材料，以提高紙絹遇水的穩(wěn)定性，避免書(shū)畫(huà)在全色、接筆修復(fù)中顏色被暈開(kāi)[1]。豆?jié){水中的大豆蛋白大部分是球形蛋白，帶負(fù)電的谷氨酸和羥脯氨酸較多，具有一定的疏水性[2]，可使紙張產(chǎn)生抗水性。加熱會(huì)破壞蛋白分子的天然結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其熱變性以及其它理化性質(zhì)的變化[3]，如蛋白質(zhì)溶解度下降[4]，蛋白結(jié)構(gòu)從聚合到展開(kāi)狀態(tài)，疏水區(qū)域暴露[5]。不同熟度的豆?jié){水會(huì)導(dǎo)致紙張產(chǎn)生不同程度的疏水效果，從而影響到修復(fù)效果。目前，在文物保護(hù)修復(fù)領(lǐng)域尚未見(jiàn)對(duì)不同加熱溫度豆?jié){水的疏水性研究報(bào)道。

ANS熒光探針是一種陰離子型探測(cè)劑，與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域結(jié)合后，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，通過(guò)測(cè)定其熒光強(qiáng)度變化可表征蛋白質(zhì)疏水性的強(qiáng)弱[6，7]。Alizadeh-Pasdar等[8]采用ANS熒光探針測(cè)定乳清蛋白分離物、β-乳球蛋白和牛血清白蛋白在80℃加熱前后不同pH值時(shí)的表面疏水性，研究結(jié)果表明，體系pH值大小會(huì)影響蛋白質(zhì)表面疏水性強(qiáng)弱。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法是依據(jù)蛋白質(zhì)分子量的差異進(jìn)行分離，借助凝膠成像分析系統(tǒng)記錄特征條帶的光密度，實(shí)現(xiàn)了蛋白組份及其亞基的定性定量測(cè)定[9]。黃惠華等[10]采用SDS-PAGE法在大豆脫脂豆粕、“堿提酸沉”和“超濾法”分離蛋白中分離出17種蛋白組分，發(fā)現(xiàn)大豆水浸提液經(jīng)高溫處理后，對(duì)熱敏感的譜帶解聚消失。衰減全反射傅里葉變換紅外光譜法（ATR-FTIR）結(jié)合傅里葉去卷積和二階導(dǎo)分峰、光譜擬合可定量測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)[11]。Muragama等[12]利用FTIR研究了牛血清白蛋白熱變性過(guò)程中二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，研究結(jié)果表明，隨著溫度升高，α-螺旋含量逐漸降低，β-轉(zhuǎn)角和分子間β-片層等含量逐漸增加。

本研究將ANS熒光探針?lè)癝DS-PAGE凝膠電泳法等方法應(yīng)用于文物修復(fù)研究中，研究了不同熟度豆?jié){水大豆蛋白表面疏水性、加熱前后大豆蛋白亞基及二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，確定了書(shū)畫(huà)修復(fù)用豆?jié){水的適宜加熱溫度，為豆?jié){水在紙質(zhì)文物保護(hù)修復(fù)中的科學(xué)使用和機(jī)理研究提供依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

POLARstar Omega 多功能酶標(biāo)儀（德國(guó)BMG Labtech公司）； DJ12B-A10豆?jié){機(jī)（九陽(yáng)公司）； GE Hoefer Mini VE垂直電泳系統(tǒng)（美國(guó)GE公司）； Dionex Ultimate 3000 液相色譜系統(tǒng)、LTQ-Orbitrap Velos pro質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo公司）； Alpha便攜式傅里葉變換紅外光譜儀（德國(guó)Bruker公司）。

大豆（市售黃豆）； Na2HPO4、NaH2PO4、十二烷基硫酸鈉 （SDS ）、異丙醇（分析純，西隴化工公司）； ANS（分析純，美國(guó)Sigma公司）； Tris-HCl緩沖溶液、考馬斯亮藍(lán)R-250（上海生工公司）； 甘氨酸（美國(guó)Amersco公司，BR）； 蛋白Marker（10～180 kDa，美國(guó)Thermo Scientific公司）； 二硫蘇糖醇、甘油、溴酚藍(lán)、乙醇、冰醋酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 乙腈、甲醇、甲酸（質(zhì)譜級(jí)，德國(guó)Merck公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 不同熟度豆?jié){水的制備 稱(chēng)取適量黃豆于25℃浸泡12h ，采用豆?jié){機(jī)果汁功能打散攪拌20 min后，用過(guò)濾網(wǎng)濾掉殘?jiān)?，制得大豆含量分別為3%和10%（w/V）的生豆?jié){水。將生豆?jié){水在水浴鍋中分別加熱至50℃、80℃、95℃，并保溫20 min，然后過(guò)濾去渣，得到不同熟度的豆?jié){水，冷卻至室溫，備用。

2.2.2 ANS熒光探針?lè)治?分別量取10 mL上述制備好的3% （w/V）不同熟度的豆?jié){水加入于50 mL 0.01 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（PB，pH 7.0）中，室溫?cái)嚢?0 min，用高速均質(zhì)機(jī)均質(zhì)2 min， 10000 r/min離心30 min。采用Bradford法[13，14]測(cè)定不同熟度豆?jié){水溶液中大豆蛋白濃度，然后用0.01 mol/L PB將上述離心后的上清液分別稀釋至蛋白濃度為0.03～1.50 mg/mL。取稀釋后的樣品溶液2 mL，分別加入50 mmol/L ANS溶液16 μL，振蕩后靜置3 min，利用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度（FI）。使用ANS作為外源熒光探針測(cè)定溶解于PB溶液中蛋白質(zhì)的表面疏水性[15]，激發(fā)波長(zhǎng)（λex）為355 nm，發(fā)射波長(zhǎng)（λem）為520 nm，狹縫寬度為5 nm。以FI對(duì)蛋白質(zhì)濃度作圖，初始段的斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)S0。

2.2.3 SDS-PAGE分析 將上樣緩沖液（200 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L 二硫蘇糖醇，8% （w/V）SDS，0.2%溴酚藍(lán)，20%甘油）分別與10% （w/V）不同熟度的豆?jié){水以體積比1∶3混合。樣品和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)樣電泳的上樣量分別為10 μL和3 μL。電泳緩沖液為250 mmol/L Tris-HCl、2.5 mol/L甘氨酸、1% SDS。濃縮膠上施加電壓140 V，電泳時(shí)間30 min。當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后，將電壓提高至160 V， 約90 min后，待溴酚藍(lán)電泳出膠槽即停止電泳。取出凝膠，用考馬斯亮藍(lán)染色液（0.1%（w/V）考馬斯亮藍(lán)R-250，25%（V/V）異丙醇，10%（V/V）冰醋酸）染色，脫色液（150 mL乙醇，50 mL冰醋酸，300 mL超純水）脫色至電泳帶清晰，以凝膠成像系統(tǒng)成像并采集數(shù)據(jù)。

2.2.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析 從SDS-PAGE電泳凝膠中切取分辨較好、加熱后有差異的蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行LC-MS/MS檢測(cè)。方法如下：將差異條帶切碎并置于1.5 mL 離心管中，對(duì)染色的蛋白質(zhì)條帶按照質(zhì)譜制樣的要求，進(jìn)行脫色、還原、烷基化、酶解、萃取和脫鹽等處理[16]。經(jīng)離心濃縮干燥后，用0.1%（V/V）甲酸溶液復(fù)溶，高速離心后，取10 μL上清液進(jìn)行LC-MS/MS分析。HPLC分析使用C18毛細(xì)管柱（200 mm×75 μm，5 μm），流動(dòng)相A為0.1%（V/V）甲酸，流動(dòng)相B為80%（V/V）乙腈-0.1%（V/V）甲酸，梯度洗脫程序： 0～5 min，98% A； 5～43 min，95% A； 43～52 min，80% A； 52～54 min， 65% A； 54～60 min，100% B。流速0.30 μL/min。質(zhì)譜分析采用ESI源，正離子掃描方式，一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍m/z 400～1500，在35%歸一化碰撞能（CID）下，選擇一級(jí)圖譜中峰強(qiáng)度最高的20個(gè)峰在離子阱中進(jìn)行相關(guān)MS/MS掃描。搜庫(kù)軟件Thermo proteome discover 2.1，在uniprot-soybean.fasta（http：//www.uniprot.org/）大豆庫(kù)中搜索MS/MS譜對(duì)應(yīng)蛋白。固定修飾：烷基化（C）； 可變修飾：氧化（M）； 反庫(kù)搜索； 酶：胰酶； 最大漏切位點(diǎn)數(shù)：2； 一級(jí)質(zhì)量偏差：10 ppm； 二級(jí)質(zhì)量偏差：0.02 Da。

2.2.5 ATR-FTIR分析 在載玻片上制備不同加熱溫度的豆?jié){水膜，待干后揭下，用于ATR-FTIR分析。檢測(cè)范圍540～4000 cm1，分辨率4 cm1，波數(shù)精度0.01 cm1，掃描次數(shù)64次，溫度25℃。利用OMNIC8.2軟件對(duì)紅外光譜圖進(jìn)行歸一化處理，以消除樣品用量對(duì)紅外光譜強(qiáng)度的影響。對(duì)酰胺Ⅰ帶（1700～1600 cm1）進(jìn)行去卷積處理，半峰寬為10 cm1，增強(qiáng)因子為2.0。用Peak fitv4.12對(duì)去卷積光譜進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)分峰擬合。多次擬合使殘差最?。╮2≥0.96），確定各子峰與二級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系后，根據(jù)其積分面積計(jì)算各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)百分含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 ANS熒光探針?lè)治?/p>

圖1為采用ANS 熒光探針?lè)治霾煌於榷節(jié){水中大豆蛋白樣品表面疏水性指數(shù)S0的結(jié)果。隨著加熱溫度的升高，大豆蛋白的S0值呈上升趨勢(shì)； 80℃時(shí)S0值最大，疏水性最強(qiáng)； 但當(dāng)溫度高于80℃時(shí)，S0值略有降低，表面疏水性呈下降趨勢(shì)。據(jù)報(bào)道，蛋白質(zhì)表面疏水性與空間構(gòu)象、氨基酸及亞基組成密切相關(guān)[17]，因此，以下實(shí)驗(yàn)分別從大豆亞基組成和二級(jí)結(jié)構(gòu)兩方面研究其對(duì)表面疏水性的影響。

3.2 SDS-PAGE電泳法聯(lián)用LC-MS/MS分析

經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳分離和考馬斯亮藍(lán)染色所得的豆?jié){水分析結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，加熱至80℃時(shí)，豆?jié){水中分子量約在55和35 kD處的兩個(gè)蛋白條帶消失（圖2方框所示）。這兩個(gè)條帶經(jīng)胰酶酶解后，利用LC-MS/MS分析，在Uniprot大豆庫(kù)中搜索，結(jié)果如表1所示，每個(gè)差異條帶經(jīng)分析篩選后，共得到3種潛在的蛋白。其中，加熱后消失的55 kD處的條帶1潛在蛋白為大豆球蛋白的一種亞基，分值最高的為球蛋白Glycinin G3亞基。消失的35 kD處的條帶2潛在蛋白分值最高的為糖蛋白凝集素Lectin亞基。結(jié)果表明， 加熱溫度超過(guò)80℃后，大豆蛋白可能發(fā)生熱變性，導(dǎo)致沉淀。

3.3 ATR-FTIR分析

不同加熱溫度下豆?jié){水的紅外光譜見(jiàn)圖3。1600～1700 cm1處的酰胺Ⅰ帶C=O伸縮振動(dòng)是計(jì)算蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要譜帶[18]，其中1610～1640 cm1對(duì)應(yīng)β-片層，1640～1650 cm1為無(wú)規(guī)卷曲，1650～1660 cm1為α-螺旋，1660～1700 cm1為β-轉(zhuǎn)角[19]，通過(guò)對(duì)酰胺Ⅰ帶傅里葉去卷積和二階導(dǎo)分峰擬合可得到蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)變化（圖4）。

由圖4可知，不同加熱溫度的豆?jié){水中的大豆蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，通過(guò)計(jì)算各子峰積分面積得到二級(jí)結(jié)構(gòu)定量信息（表2）。由表2可見(jiàn)，隨著加熱溫度由25℃上升到80℃，β-片層結(jié)構(gòu)相對(duì)含量由41.14%增至48.87%，溫度至90℃后減少為45.43%； 相對(duì)應(yīng)的α-螺旋、 β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量先減小再增加，說(shuō)明隨著加熱溫度從25℃上升到80℃，蛋白質(zhì)中α-螺旋、 β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲向β-片層結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。結(jié)合3.1節(jié)ANS熒光探針?lè)治鼋Y(jié)果，80℃加熱的豆?jié){水的疏水性最大。本研究結(jié)果表明，大豆蛋白中，β-片層結(jié)構(gòu)含量與表面疏水性呈現(xiàn)正相關(guān)，此結(jié)論與文獻(xiàn)[20，21]的研究結(jié)果一致。產(chǎn)生的原因可能是蛋白質(zhì)分子β-片層含量較高時(shí)，分子結(jié)構(gòu)相對(duì)松散，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部“埋藏”的酪氨酸和色氨酸殘基的疏水性位點(diǎn)的暴露程度較大，表現(xiàn)出更強(qiáng)的表面疏水性。

4 結(jié) 論

研究了書(shū)畫(huà)修復(fù)中宣紙施膠用不同加熱溫度豆?jié){水大豆蛋白的疏水性，初步探討了疏水性變化機(jī)理。結(jié)果表明，隨著加熱溫度從25℃上升到80℃，大豆蛋白β-片層結(jié)構(gòu)由41.14%增加到48.87%，α-螺旋、 β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)向β-片層結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變， β-片層結(jié)構(gòu)含量與表面疏水性呈現(xiàn)正相關(guān)，80℃的豆?jié){水的疏水性最大，因此最適用于書(shū)畫(huà)修復(fù)。

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