張錦 ，劉新龍 ，李純佳 ，劉洪博 ，朱建榮 ，李旭娟 *

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，云南開遠661699；2.紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南蒙自661199）

高等植物的生長發(fā)育是不同基因在時間和空間上有序表達和協(xié)同作用的過程[1]。基因的表達調(diào)控是一個多層次的復(fù)雜過程，DNA序列是遺傳信息的儲存者，它通過自主復(fù)制得到永久存在，其生物功能是以蛋白質(zhì)的形式表達出來，其中轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。啟動子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確地結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性[2]，并與反式作用因子或環(huán)境中的物理、化學(xué)、生物或非生物等因素互作來控制特定基因的定時、定位、定量表達，是基因轉(zhuǎn)錄水平上一個重要的調(diào)控元件。另外，在基因工程研究中，啟動子的選擇和使用對外源基因的表達水平影響極大，是決定外源基因轉(zhuǎn)錄效率并決定基因表達模式與表達強度的關(guān)鍵因素。

甘蔗（Saccharum spp.）屬于單子葉禾本科C4光合作物，是世界上最重要的糖料作物。目前，我國食糖總產(chǎn)僅次于巴西和印度，其中蔗糖是我國食糖的主要來源，占食糖總量的92%以上[3]。同時，甘蔗也可作為生產(chǎn)綠色能源乙醇[4]、天然藥用化合物[5]和一些生物聚合物[6]的原料，因而對于緩解能源問題具有重要的實際意義。但甘蔗為異源多倍體植物，遺傳背景和基因變異復(fù)雜，其性狀是多基因共同作用的結(jié)果，前人研究表明甘蔗基因啟動子序列富含豐富的變異，對基因的表達調(diào)控和功能作為起關(guān)鍵作用?；诖耍仡櫢收崽欠?、抗性和分蘗相關(guān)基因啟動子序列的克隆和活性研究，對于了解甘蔗啟動子的結(jié)構(gòu)和調(diào)控特點具有重要的指導(dǎo)意義，同時也為運用啟動子序列操縱甘蔗相關(guān)基因的表達和功能行使，進而為改良品種性狀提供重要參考。

1 糖分相關(guān)基因啟動子的克隆、活性和功能分析

長期以來，甘蔗中最基本的生產(chǎn)功能由糖分代謝與糖轉(zhuǎn)運相關(guān)基因組成，一直是研究者重點挖掘和功能研究的對象[7]。甘蔗糖代謝是一個復(fù)雜的過程，涉及多種酶的控制，如蔗糖磷酸合成酶（SPS）、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）、蔗糖合成酶（SS）、轉(zhuǎn)化酶（INV）、果糖激酶（FRK）和磷酸果糖激酶（PFK）等，其中UGPase處于糖代謝中交叉點的位置，它不但可作為葡萄糖基供體，參與生物體內(nèi)多種寡糖及多糖的合成，如海藻糖、蔗糖、淀粉、維生素的生物合成，而且還是合成其他核苷二磷酸單糖，如尿苷二磷酸半乳糖、尿苷二磷酸葡萄糖、尿苷二磷酸木糖等的前體，所以在糖代謝中起著舉足輕重的作用，其基因的表達調(diào)控機制較為復(fù)雜[8]。邱思等[9]從甘蔗品種福農(nóng)95-1702中克隆了UGPase基因的5’側(cè)翼啟動子序列，并預(yù)測含有TATA-box、CAAT-box、大量光響應(yīng)元件和組織發(fā)育有關(guān)元件；葉冰瑩等[10]將該基因不同長度的啟動子序列與GUS報告基因連接構(gòu)建表達載體，分析結(jié)果表明所克隆的UGPase基因啟動子序列不具有活性，啟動子無活性可能是由于轉(zhuǎn)化的假陽性，也可能是此基因的表達存在組織特異性或存在假基因的現(xiàn)象。

轉(zhuǎn)化酶與蔗糖積累密切相關(guān)，在蔗糖的轉(zhuǎn)運、貯藏和分配中起重要作用，是調(diào)節(jié)蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一，分為 3 種類型 ：（1）可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶（soluble acid invertase，SAI）；（2）可溶性中性或堿性轉(zhuǎn)化酶（neutral or alkaline invertase）；（3）細胞壁結(jié)合的酸性轉(zhuǎn)化酶（cell wall-bound invertase，CWI）[11]。 ?？∑娴葟母收崞贩N桂糖（GT28）中分別克隆到甘蔗可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶（SoSAI1）基因5’側(cè)翼部分啟動子序列[12]和中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因（SoNIN1）5’側(cè)翼啟動子序列[13]；軟件分析：SoSAI1基因啟動子含有多個CAAT-box、TATA-box等基本作用元件、胚乳特異表達順式作用元件（Skn-1 motif）和參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點，現(xiàn)只獲得該基因啟動子的部分序列，要進行啟動子活性和功能分析，還需進一步實驗以獲得更長的5’側(cè)翼序列。SoNIN1基因啟動子序列長1174bp，除了含有多個CAAT-box和TATA-box等基本作用元件，還含有干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點，脫落酸響應(yīng)元件（motif IIb）、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（CGTCA-motif）和赤霉素響應(yīng)元件（P-box）以及光應(yīng)答等順式作用元件，進一步研究表明該基因受PEG脅迫和NaCl誘導(dǎo)下能在甘蔗根和葉中表達。

蔗糖合成酶（SS）是調(diào)控蔗糖代謝的關(guān)鍵酶，它催化蔗糖進入各種代謝途徑，雷美華等[14]從甘蔗品種福農(nóng)95-1702中克隆到該基因1.9kb的上游啟動子序列，軟件分析表明該序列具有真核生物啟動子的一般特征，還具有糖誘導(dǎo)SURE元件，后期研究希望能找到轉(zhuǎn)錄該基因的重要調(diào)控區(qū)域及關(guān)鍵元件，并進行功能研究及活性驗證，為甘蔗蔗糖合成酶基因的啟動子及內(nèi)含子研究提供新的資料，并從轉(zhuǎn)錄水平上闡明甘蔗蔗糖合成酶的表達調(diào)控機制提供理論依據(jù)。

蔗糖磷酸合成酶（SPS）是蔗糖合成途徑的關(guān)鍵限速酶，其活性能影響蔗糖合成能力和光合中間產(chǎn)物向蔗糖和淀粉途徑的分配，并調(diào)控蔗糖的積累、參與纖維細胞壁合成與脅迫應(yīng)答等。周平等[15]克隆了甘蔗SPSIII的基因組DNA片段及其5’側(cè)翼序列，分析表明該啟動子含有TATA啟動盒和一些與光響應(yīng)相關(guān)的ACE、ATCT-motif、AE-box元件，芽組織特異性元件as-2-box和分生組織特異性元件GCN4-motif、CAT-box等，通過啟動子缺失實驗遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗愈傷組織觀測瞬時表達，證實了甘蔗SPSIII基因的5’側(cè)翼序列具有啟動子活性，可以驅(qū)動報告基因在愈傷分生組織中的表達。高玉娜等[16]將其課題組構(gòu)建的含有SPSIII基因5’側(cè)翼序列的缺失表達載體遺傳轉(zhuǎn)化煙草獲得轉(zhuǎn)基因植物研究表明，在葉片、莖、根頸、花托、粵片、花瓣、花藥、花柱以及幼苗葉片中表達，表明SPSIII基因啟動子序列具有啟動子活性，且不同片段具有不同組織特異性。張積森等[17]通過酵母單雜交的方法，篩選潛在SPSIII基因啟動子光響應(yīng)元件ATCT-motif和分生組織特異性元件CAT-box調(diào)控元件互作的轉(zhuǎn)錄因子，最終篩選得到14個與SPSIII 5’側(cè)翼的光響應(yīng)元件和分生組織特異性元件互作的非重復(fù)序列，為分離調(diào)控SPSIII基因表達的轉(zhuǎn)錄因子提供了候選基因。

蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白（sucrose transporter，SUT）負責(zé)蔗糖的跨膜運輸，在韌皮部介導(dǎo)的源-庫蔗糖運輸，以及庫組織的蔗糖供給中起關(guān)鍵作用[18]。吳自明等[19]從甘蔗品種福農(nóng)28中克隆出甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因SUT4的啟動子序列，結(jié)構(gòu)分析表明其具有真核生物啟動子的一般特征，如TATA-box和CART-box等特征元件，此外，還推測出該啟動子區(qū)域含有一些與MYB結(jié)合位點、脫落酸響應(yīng)元件ABRE、光照、低溫響應(yīng)元件LTR響應(yīng)等有關(guān)的順式作用元件，它們在某種程度上影響甘蔗SUT4基因的轉(zhuǎn)錄，其活性還有待驗證。郭婷等[20]從甘蔗品種新臺糖22號（ROC22）中克隆出甘蔗單糖轉(zhuǎn)運蛋白基因（ShPST2a），細胞亞定位預(yù)測為一種膜蛋白；蔡文偉等[21]克隆了該基因5’上游1968bp的啟動子序列，生物信息學(xué)分析預(yù)測PST2a基因啟動子序列具有多個啟動子的基本轉(zhuǎn)錄元件TATA-box、CAAT-box、脫落酸和干旱應(yīng)答元件ABRE、厭氧應(yīng)答元件ARE、植物胚乳形成相關(guān)元件Skn1-motif、維管特異表達元件ACIII-element等元件，并構(gòu)建了表達載體在甘蔗莖部和葉片上進行瞬時表達，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)該啟動子是一個驅(qū)動能力較35 S啟動子更強的莖稈特異性啟動子；馬滋然等[22]也克隆了該基因的啟動子pPST2a，并構(gòu)建了一系列的缺失表達載體遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗愈傷組織后獲得一批轉(zhuǎn)化植株，進行根、莖、葉、葉芽、葉鞘、5個部位的GUS基因表達的檢測，通過GUS組織化學(xué)染色定位法證明該啟動子具有甘蔗根特異表達的特性。

2 逆境相關(guān)基因啟動子活性及功能分析進展

甘蔗是典型的亞熱帶作物，由于近年全球氣候的多變性以及甘蔗種植向旱坡和山區(qū)發(fā)展，干旱、鹽堿、低溫等非生物脅迫因子的影響已成為制約甘蔗產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵因素，其中干旱對甘蔗傷害最大。研究表明：土壤干旱脅迫導(dǎo)致甘蔗自由水和葉綠素含量急劇下降、光合作用效率降低[23]，從而影響甘蔗生長發(fā)育和糖分的運輸累積，造成甘蔗產(chǎn)量大量減少[24]。

逆境相關(guān)蛋白家族（Stress-associated proteins，SAPs）中的A20/AN1型鋅指蛋白與非生物脅迫應(yīng)答相關(guān)，是提高植物的抗逆能力和保證作物產(chǎn)量最有潛力的基因[25]。李曉君等[26]從甘蔗品種 （拔地拉）中克隆了ShSAP1基因1243 bp的啟動子序列，生物信息學(xué)分析表明該序列具有啟動子的核心元件，干旱等脅迫相關(guān)的應(yīng)答元件、MYB/MYC轉(zhuǎn)錄因子識別與結(jié)合元件、組織特異性相關(guān)元件，說明ShSAP1的啟動子可能具有逆境應(yīng)答及組織特異表特性，活性和功能還需要進一步驗證。Prabu G等[27]從甘蔗中分離出與脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子MYB基因（ScMYBAS1）的5’側(cè)翼啟動子序列，并進行了缺失分析，確定了啟動子的核心區(qū)域在轉(zhuǎn)錄起點至-303bp，還證明了該啟動子受干旱、鹽、低溫、傷害、水楊酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）誘導(dǎo)。

逆境（脅迫）是影響植物正常生長發(fā)育并造成生物大量減產(chǎn)的原因，植物應(yīng)答逆境脅迫過程是一個涉及多基因、多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和多基因表達產(chǎn)物的復(fù)雜過程。滲透調(diào)節(jié)機制和ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在植物的抗逆生長過程中發(fā)揮著重要作用。盡管現(xiàn)在已經(jīng)從甘蔗中克隆了許多能在干旱、低溫、高鹽和氧化脅迫下誘導(dǎo)表達的關(guān)鍵調(diào)控酶基因，如：甘蔗獨腳金內(nèi)酯生物合成基因（ScCCD8）[28]、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因（SsCIPK23）[29]、蔗糖-1-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因（1-SST）[30]、甘蔗 ABA 生物合成關(guān)鍵酶基因（SoNCED）[31]、蔗糖非酵解型蛋白激酶基因（SoSnRK2.1）[32]和很多非生物脅迫轉(zhuǎn)錄因子如：NAC[33]、MYB[34]、鋅指蛋白 Sc-zf[35]等基因，但關(guān)于這些基因的啟動子研究的較少，鑒于啟動子在轉(zhuǎn)基因育種中具有重要地位，應(yīng)多挖掘關(guān)于逆境脅迫誘導(dǎo)和組織特異型啟動子，提高抗逆基因的表達效率。

3 甘蔗分蘗性狀啟動子研究進展

分蘗（分枝）是禾谷類作物和其他許多單子葉植物生長發(fā)育過程中最重要的農(nóng)藝性狀之一，是影響農(nóng)作物穗數(shù)或莖數(shù)以及形態(tài)建成進而影響其產(chǎn)量的重要性狀因子[36]。在甘蔗生產(chǎn)中，有效分蘗莖的多少和大小直接決定了甘蔗產(chǎn)量的高低。MOC1是我國科學(xué)家李家洋等克隆到的一個控制水稻分蘗的關(guān)鍵基因，該基因可編碼一個屬于GRAS家族的轉(zhuǎn)錄因子，功能是促進分蘗和腋芽生長[37]。李旭娟等[38]從ROC22中克隆了MOC1的同源基因，并命名為ScMOC1，利用實時熒光定量PCR分析，結(jié)果顯示ScMOC1在分蘗期的ROC22中的表達具有組織特異性，在莖尖生長點處表達量最高；在腋芽形成發(fā)育過程中該基因表達總體呈現(xiàn)出 “升-降-升-降”的趨勢，說明ScMOC1基因可能在甘蔗腋芽形成發(fā)育階段中發(fā)揮作用。目前，李旭娟等已經(jīng)克隆出該基因5’端上游2.8kb的調(diào)控序列（待發(fā)表），下一步將進行啟動子活性驗證和功能分析。

李旭娟等從ROC22中克隆了ScKN1[39]、ScTB1[40]和ScTAD1[41]等多個與分蘗性狀相關(guān)的基因；呂愛麗等[42]也在甘蔗中克隆了能編碼有效控制分蘗的水解酯酶（ScHTD2）基因。這些基因?qū)刂聘收岱痔Y性狀的發(fā)生起著重要作用，挖掘和利用這些基因啟動子序列對于研究其調(diào)控機理和育種具有重要意義。目前，相對于水稻、擬南芥等植物，甘蔗分蘗性狀的研究較滯后[43]。但由于分蘗基因是影響甘蔗產(chǎn)量的重要因素，且分子育種技術(shù)在育種方面有較多優(yōu)勢，因此對甘蔗分蘗性狀相關(guān)基因啟動子的研究是目前乃至今后重要的發(fā)展方向。

4 其他啟動子研究進展

乙烯（Ethylene）是調(diào)控植物生長發(fā)育、成熟衰老的重要激素[44]，通過誘導(dǎo)相關(guān)基因表達從而調(diào)控植物的生長發(fā)育和生物及非生物脅迫的應(yīng)答[45]。目前，已經(jīng)從擬南芥中克隆了多個乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的基因，發(fā)現(xiàn)了多個乙烯受體蛋白，但對受體基因調(diào)控機理尚未清楚[46]。黃靜麗等[47]從ROC22基因組DNA中克隆甘蔗乙烯受體Sc-ERS基因啟動子序列，生物信息學(xué)預(yù)測該序列具有多個基本元件TATA-box、CAAT-box、光響應(yīng)元件、干旱誘導(dǎo)MYB結(jié)合位點（MBS）、SA、MeJA、Skn1-motif等響應(yīng)元件，推測Sc-ERS基因的表達可能受生理周期、激素、干旱、光照等因素調(diào)控。甘蔗乙烯受體Sc-ERS基因啟動子序列的獲得，為進一步從轉(zhuǎn)錄水平上研究甘蔗乙烯受體基因調(diào)控表達機理以及運用該啟動子調(diào)控甘蔗生長和蔗糖積累奠定基礎(chǔ)。

甘蔗莖部是儲存合成產(chǎn)物的主要器官，莖部特異性啟動子的挖掘和利用對于甘蔗作為生物反應(yīng)器的研究具有重要意義。國內(nèi)已經(jīng)克隆到甘蔗己糖轉(zhuǎn)運蛋白基因PST2a的啟動子，并通過瞬時表達證明該啟動子具有莖稈特異性[20]；在國外，Abraha T G[48]從甘蔗基因組中分離了具有莖部特異性基因c22-a的啟動子序列，并命名為DPB，實驗證明該啟動子只在甘蔗莖稈薄壁細胞中表達。

5 展望

甘蔗作為世界上重要的糖料作物和經(jīng)濟作物，通過基因工程技術(shù)來提高甘蔗糖分、產(chǎn)量、抗逆性是甘蔗糖業(yè)的主要發(fā)展方向。在目前甘蔗啟動子的育種和運用中，組成型啟動子如CaMV（花椰菜花葉病毒）35S啟動子、玉米泛素（Ubiquitin）啟動子、水稻（Actin）啟動子和人造（Emu）啟動子得到了廣泛運用。但在育種方面最重要的限制因素之一是缺乏能穩(wěn)定表達的組織特異型啟動子，所以挖掘甘蔗優(yōu)異性狀編碼基因的同時還應(yīng)加強誘導(dǎo)型和組織特異型啟動子的開發(fā)利用，從而更好地為甘蔗育種奠定基礎(chǔ)。

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