哮喘是一個嚴重的全球性健康問題。這一疾病近10年的患病率、致殘率、相關疾病的死亡率逐漸上升,至2016年全球受這一疾病影響的人群已達到3億［1］。哮喘被認為是多種遺傳因素與環(huán)境因素相互作用而引起的一種復雜的疾病。已積累的大量證據(jù)表明,兒童早期的呼吸道病毒感染是哮喘急性發(fā)作的主要環(huán)境危險因素,某些病毒感染引起的喘息發(fā)作是隨后哮喘性疾病的獨立危險因素［2］。2017版的《全球哮喘管理及預防策略》中指出哮喘的形成及其急性發(fā)作往往與上呼吸道的病毒感染有關(尤其是人鼻病毒)。人鼻病毒(human rhinovirus,HRV)約占病毒引起的哮喘急性發(fā)作的65%,其次是呼吸道合胞病毒(RSV),其他還有人偏肺病毒、流感病毒、副流感病毒、冠狀病毒、腺病毒等［3］。近年的一項大規(guī)模的出生隊列研究表明,在生命的第一年里,至少在高危人群中,HRV感染對哮喘形成是一個比RSV感染更強的危險因素［4］。目前為止,HRV感染與哮喘之間的聯(lián)系機制仍未明確。本研究對HRV感染與兒童哮喘形成與哮喘急性發(fā)作相關的臨床和實驗數(shù)據(jù)以及已提出的潛在機制進行了綜述。對于HRV感染與哮喘之間關系的進一步了解將有助于兒童哮喘新防治策略的形成。

1 HRV概述

HRV是小RNA病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬(Enterovirus genus)的單股正鏈RNA病毒,病毒顆粒為直徑27～30 nm的20面立體對稱結構。HRV基因組全長約7 200 bp,基因組結構包括5′端非編碼區(qū)(5′untranslated region,UTR)、一個長的開放閱讀框(ORFs)和 3′端非編碼區(qū)(3′untranslated region,UTR)。ORFs(長約6 500 bp)轉錄后的產物被HRV驅動蛋白酶剪切成11個蛋白,其中4種結構蛋白VP1、VP2、VP3和VP4,構成殼粒,形成殼體包裹RNA。殼粒由12個五聚體構成,VP1、VP2和VP3的部分序列展示在殼粒表面,而VP4不暴露在殼粒表面［5］。

2 HRV分組

自1956年分離培養(yǎng)出第1株HRV以來,至今已發(fā)現(xiàn)160多種血清型,是感染人類的病毒中血清型最多的一類病毒。早期根據(jù)基因序列分析將HRV分為兩組:HRV-A、HRV-B。典型的HRV-A及HRV-B分離株屬于小RNA病毒科腸道病毒屬內的不同分支,同一分支內多聚蛋白的非結構蛋白區(qū)P1、2C、3CD有超過70%的氨基酸同源性(近2 150個氨基酸)。進一步根據(jù)主要衣殼蛋白 VP1或VP4/VP2編碼區(qū)的核苷酸同源性(＞85%核苷酸同源)細分成基因型(與血清型相匹配),目前HRV-A有78個基因型,HRV-B有30個基因型［6］。

自2006年以來,新1組HRV,HRV-C,逐漸被人們所認識,分子溯源表明HRV-C流傳至少已有250年,目前已有60多個基因型被發(fā)現(xiàn)［7］。HRV-C與HRV-A、HRV-B具有相似的核酸堿基構成比例。HRV-C組內氨基酸同源性達68% ～95%,與HRVA同源性達64% ～99%,與 HRV-B型同源性達75% ～97%［6］。HRV-C的物理結構預測結果表明其病毒顆粒表面至少有超過1/3的衣殼結構,這一特點與 HRV-A、HRV-B 明顯不同［8］。

Huang 等［9］發(fā)現(xiàn),在對 HRV 5′UTR 進行分析時發(fā)現(xiàn),部分 HRV-C 5′UTR含有長度不一的屬于HRV-A的5′UTR的基因片段,將其命名為HRV Cc亞組,以區(qū)別于之前的HRV C(HRV-Ca),這說明HRV-C與HRV-A在5′UTR(非編碼區(qū))存在明確重組。Palmenberg等提出HRV-A可能發(fā)生種內重組,產生了1個新的HRV進化支:HRV-D。系統(tǒng)發(fā)生學證據(jù)和測序分析都表明,HRV-D很可能是新的1組 HRV［8］。

3 HRV感染與哮喘的關系

目前已證實HRV感染不僅能夠引起上呼吸道感染,與慢性肺炎的加重、哮喘的急性發(fā)作、嬰幼兒和兒童嚴重的毛細支氣管炎以及免疫功能缺陷的成人和老年人患致死性肺炎都有密切的關系［10］。

HRV,尤其是HRV-C感染,在兒童急性喘息性疾病及哮喘發(fā)作中發(fā)揮重要作用。COAST(the Childhood Origin of Asthma)的1項隊列研究數(shù)據(jù)表明,嬰兒期出現(xiàn)的至少1次的HRV感染相關的喘息性疾病是3歲時的持續(xù)性喘息最重要的危險因素。此外,對于6歲發(fā)生的哮喘而言,3歲前發(fā)生的HRV感染相關的喘息性疾病是比RSV感染相關的喘息性疾病或過敏原致敏都要強的危險因素［11］。另一項來自澳大利亞的高危出生隊列研究報告了類似的結果:出生后第1年的HRV感染相關的喘息性疾病與5歲時增加的患哮喘的風險存在相關性［12］。Bizzintino等［13］研究發(fā)現(xiàn),HRV-C感染是造成哮喘急性發(fā)作的主要HRV,與HRV-A、HRV-B感染相比較,其引起哮喘急性發(fā)作的程度更為嚴重。已有證據(jù)表明,早年患有HRV-C相關性氣喘疾病將2到3倍增加因呼吸道疾病原因而住院的風險,3歲之前因感染HRV-C種病毒而引起喘息性疾病是導致6歲兒童患有哮喘的高危因素。患有HRV的兒童發(fā)生哮喘的可能性是普通兒童的4倍［14］。本研究室以無哮喘的兒童為對照人群,同時對診斷為急性呼吸道感染以及診斷為哮喘的兒童進行HRV檢測及分型,研究發(fā)現(xiàn)HRV-A、HRV-C在哮喘患兒中的陽性檢出率較HRV-B更高,而HRV-C是HRV與哮喘相關的決定性因素［15］。

HRV-C與HRV-A、HRV-B不同的是,它不能在傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中進行分離,其在呼吸道中增長更快,也對外界有更大的耐受性,但是還沒有哪一項技術能夠生產足夠的病毒供大規(guī)模的生物研究。因此,HRV-C的信息主要來源于對有限的臨床標本進行大規(guī)模的基因測序分析［8］。與HRV-B相比,HRV-A和HRV-C似乎是引起兒童下呼吸道疾病、喘息發(fā)作和急性哮喘的更常見的HRV。HRV-A/B在每個月份均有檢出,但各季節(jié)陽性檢出率比較均無統(tǒng)計學意義。HRV-C在每個月份中也均有檢出,其中秋季陽性檢出率顯著高于春、夏、冬3季(p＜0.05),且HRV-C比HRV-A/B所致疾病更嚴重。HRV-C季節(jié)分布與 HRV-A/B不同,提示 HRV-C可能與其他 HRV致病機制不同［16］。

4 HRV感染致哮喘的可能機制

HRV進入人體后,首先與呼吸道上皮細胞的特異性受體結合。呼吸道上皮細胞是HRV感染的靶細胞。研究表明,相對于流感病毒和其他呼吸道病毒,HRV感染的呼吸道上皮細胞數(shù)量相對較少,導致的細胞毒性也很低。此外,病毒脫落的數(shù)量和上皮損傷的程度與癥狀的嚴重程度無關。綜合考慮,這些研究表明,HRV引起癥狀是通過特定的病毒致細胞病變效應,而不是通過直接的細胞毒性作用［17］,或者說HRV感染后的臨床癥狀更可能是由于宿主的免疫反應所致［18］。

目前為止已發(fā)現(xiàn)3類HRV受體,其中少數(shù)HRV(the minor group),包括12個HRV-A血清型,以低密度脂蛋白(LDL)受體家族為受體；多數(shù)HRV(the major group),包括了其他的HRV-A及所有的HRV-B,共90余種HRV血清型,與細胞間黏附因子(ICAM-1)結合［4］；最近有研究報道,HRV-C可能是以鈣粘素相關家族成員3(cadherin-related family member 3,CDHR3)為受體［19］。 CDHR3 有兩個等位基因,在單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點RS6967330的編碼基因為TGT和TAT,其中G-編碼的Cys529為天然的高豐度存在(69%),但無臨床相關性；而極少的A-編碼的Tyr529(3%)被標記為“高效的”基因組,是兒童哮喘嚴重程度加重的易感基因位點”［20］。

不同組的HRV通過各自的受體所介導的內吞作用進入宿主細胞,但這一入胞過程是網格蛋白依賴的還是網格蛋白非依賴的取決于受體類型。一旦HRV進入宿主細胞,氣道中的模式識別受體(pattern recognition receptor,PRRs),包括Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)、維甲酸誘導蛋白 I(retinoic acid inducible protein I,RIG-I)、黑色素瘤分化相關基因5(melanoma differentiation associated gene 5,MDA5)等識別HRV,引發(fā)促炎癥及抗病毒反應［17］。

HRV感染后,首先在其感染與復制的初始部位氣道上皮細胞內誘發(fā)促炎癥反應。利用培養(yǎng)的人氣道上皮細胞發(fā)現(xiàn)HRV感染可誘導多種細胞因子(IL-1β、IL-6、IL-11)、生長因子(G-CSF、GM-CSF)、趨化因子(CXCL8、CXCL5、CXCL10、RANTES)的表達,這些因子有助于炎癥細胞的活化并在氣道聚集［21］。體內實驗中HRV感染后這些細胞因子在氣道分泌物中也增加［22］。預期上述各種因子可同時增強氣道炎癥及原有的過敏性炎癥。在促炎性細胞因子作用下,HRV可誘導中性粒細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞等炎癥細胞在呼吸道黏膜及黏膜下層積聚,使呼吸道上皮細胞屏障功能障礙,并激活呼吸道上皮細胞和其他細胞在肺部產生炎性介質,引起呼吸道癥狀［23］。

除促炎性細胞因子外,HRV感染還可觸發(fā)氣道上皮細胞釋放Th2促分化因子,如IL-25、IL-33以及胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP),這些因子被認為是2型T細胞分化的關鍵因素。體內及體外研究均表明HRV感染的哮喘患兒支氣管上皮細胞(Bronchial epithelial cells,BECs)中有很高的IL-25內在表達能力,且在HRV感染的過敏性哮喘患兒鼻液中IL-25水平升高；在HRV誘導的哮喘惡化的小鼠模型中也觀察到了類似的結果。此外,阻斷IL-25受體后2型細胞因子的表達、黏膜分泌物及炎性細胞募集均降低［24］。另外的人感染HRV模型研究發(fā)現(xiàn)在哮喘患者支氣管黏膜分泌物中IL-33與2型細胞因子水平升高,而這些細胞因子的水平與哮喘急性發(fā)作的嚴重程度密切相關。同1個體外周血T細胞與2型先天淋巴樣細胞產生的細胞因子是HRV感染BEC時誘導產生,而這種誘導作用是完全依賴于IL-33的［25］。TSLP也被認為是HRV感染與哮喘發(fā)作中特征性的Th2反應之間的一個潛在的分子鏈接。哮喘BEC體外模型研究顯示dsRNA或病毒感染的替代物刺激下可誘導產生大量的TSLP,伴隨IFN-β的降低［26］。此外,在過敏性哮喘的小鼠模型肺組織中的TSLP表達是HRV感染或暴露dsRNA所誘導的［27］。這些研究均提示上皮細胞分泌的介質在HRV誘導的哮喘急性發(fā)作中有潛在作用。

在抗病毒免疫應答中,干擾素屬于針對病毒感染的非特異性防御機制,并且在其中起重要作用。實驗和臨床數(shù)據(jù)表明因HRV感染導致上皮細胞產生干擾素減少［28］。但有研究提示哮喘患者受損的上皮細胞產生的IFNβ和IFN-λ可能有助于病毒性哮喘發(fā)作。體外實驗中IFN-λ和IFN-β的誘導與癥狀嚴重程度、支氣管肺泡灌洗中的病毒載量及氣道炎癥呈負相關,而體內HRV感染實驗中與肺功能降低呈正相關。在一項對學齡期哮喘兒童的前瞻性研究中HRV感染喘息兒童與HRV感染無喘息兒童相比IFN-γ1明顯升高,提示IFN反應失調,而非簡單的IFN產物缺乏介導了HRV誘導哮喘發(fā)作［29］。

HRV感染也可能通過增加呼吸道粘液分泌導致哮喘發(fā)作。體外研究顯示HRV感染后人呼吸道上皮細胞黏膜蛋白-2(Muc2)、Muc3、Muc5亞型A和C(MUC5AC)、Muc5 亞型 B(MUC5B)、MUC6 mRNA表達增加,在表面細胞的裂解液及上清中黏蛋白MUC5AC及黏膜蛋白總濃度也增加［30］。

已證明HRV是氣道重塑過程的主要調節(jié)劑,不僅涉及氣道上皮而且涉及氣道黏膜的其他組分。它們能夠延遲支氣管上皮細胞中的傷口愈合,還可通過誘導TGF-β、MMP-9和MMP-10的產生導致上皮下纖維化,使細胞外基質的降解和異常修復的增強。HRV感染還可影響氣道平滑肌細胞的收縮能力,可能有助于哮喘發(fā)作。有限的體外實驗和動物研究顯示,HRV與氣道平滑肌細胞表面的受體ICAM-1結合后,病毒無復制,也無細胞病變,但可增加氣道平滑肌細胞的收縮,損害β-腎上腺素能受體激動劑的反應。另外的一些體外研究表明HRV可以感染多種其他類型細胞,包括成纖維細胞、單核細胞和巨噬細胞。這些細胞類型對哮喘急性發(fā)作的作用尚不清楚,需要進一步研究來確定［31］。

5 HRV感染致哮喘的宿主因素

雖然幾乎所有的兒童(＞90%)在嬰兒期都感染了HRV,但形成持續(xù)性喘息或哮喘的比率遠低于HRV感染率,因此,宿主因素,如遺傳因素和過敏體質等,有可能與HRV感染后易于形成哮喘有關。

全基因組關聯(lián)研究(genome-wide association studies,GWAS)一直以來都將哮喘易感性位點17q21與非過敏性兒童哮喘發(fā)病的相聯(lián)系［32］。兒童哮喘的2項出生隊列研究 COAST、哥本哈根(Copenhagen)數(shù)據(jù)表明17q21變異體與生命早期的HRV喘息性疾病相關,但與RSV喘息性疾病無關；具有高風險基因變異體的兒童只要患上HRV感染性喘息后就會形成哮喘［4］。雖然已明確這一疾病有關的變異體可影響2個17q21基因 GSDMB、ORMDL3的表達水平,但這些基因表達產物在哮喘發(fā)病機制中的作用還未完全明確。有研究揭示了ORMDL3基因在哮喘發(fā)病中的可能作用,這些作用包括未折疊蛋白反應失調、通過肌漿網/內質網Ca2＋ATP酶引起氣道炎癥和重塑、鞘脂合成負調控導致氣道高反應性等［33］。但一項體外研究得出了與出生隊列研究相反的結果。該研究認為ORMDL3基因可能有抗病毒的作用,而非增加HRV感染的易感性。人呼吸道上皮細胞中ORMDL3基因的過表達使2’-5′寡聚腺苷酸合成酶的表達增加,而2’-5′寡聚腺苷酸合成酶可以通過RNase L活化降解病毒RNA進而抑制病毒復制［34］。因此 HRV感染中ORMDL3的確切作用還需要更多的流行病學及實驗性研究。GWAS近期的一項研究結果發(fā)現(xiàn)CDHR3(encoding cadherin-related family member 3,編碼鈣粘蛋白相關家庭成員3)是兒童早期哮喘的一個新的易感位點,可在呼吸道上皮細胞中大量表達。體外研究表明,該易感位點的基因突變可介導HRV-C進入宿主細胞,成為HRV喘息性疾病的高危因素。

HRV-C已在近期研究中被確定為主要的一類HRV,主要通過加重哮喘氣道的炎癥反應,破壞細胞免疫應答,促進血管生成和氣道重塑、誘導杯狀細胞化生和黏蛋白基因表達而致病。CDHR3相關研究結果表明HRV感染與有哮喘遺傳因素的兒童哮喘易感性有關［25］。另外有不少研究提出過敏體質的致敏可能增加HRV引起喘息的風險。Th2型細胞因子,如白細胞介素(IL)-4、IL-5和IL-13,在HRV感染本身增加ICAM-1的表達的基礎上,可在呼吸道上皮細胞表面進一步上調90%血清型HRV受體ICAM-1的表達,這種反應可使上皮細胞更易受到HRV 感染［24］。

總之,由于分子診斷技術發(fā)展,使HRV-C被發(fā)現(xiàn),人們對HRV在兒童哮喘的發(fā)生及哮喘發(fā)作中的作用有了新的認識。目前的研究傾向于支持哮喘形成的“二次打擊”學說,即宿主的遺傳易感性加上HRV感染促使兒童哮喘發(fā)生。但需要更多的研究明確宿主的易感因素范疇及HRV感染引起哮喘的詳細機制。

利益沖突:無