敬 珮，管曉燕，王 倩，顧 瑜，胡 歡，肖琳琳，劉建國2，

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 正畸二組， 貴州 遵義 563099，；2.遵義醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院 口腔內(nèi)科學(xué)教研室，貴州 遵義 563099，；3.貴州省普通高等學(xué)?？谇患膊⊙芯刻厣攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨遵義市口腔疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563006)

地方性氟中毒，是一種環(huán)境化學(xué)性地方病，危害全身，主要侵犯人體的牙齒和骨骼，造成氟斑牙和氟骨癥， 分布地區(qū)廣，患病人數(shù)多且集中，是我國當(dāng)前危害最嚴(yán)重的地方病。氟中毒(fluorosis)大部分是由于生活中飲用水質(zhì)氟含量超標(biāo)導(dǎo)致體內(nèi)氟積蓄過多侵害人體骨骼和牙齒，引起以氟斑牙、氟骨癥為主要特征的一種慢性全身性疾病，少部分人還可通過食物和空氣途徑引起該病。氟斑牙又稱氟牙癥(dental fluorosis)或斑釉牙(mottled enamel)，是人體牙在發(fā)育礦化時(shí)期攝入過量的氟，損害了處于釉質(zhì)礦化期的成釉細(xì)胞所引起的釉質(zhì)礦化不全，是氟中毒最早出現(xiàn)的、最直觀的特異性表現(xiàn)。造成氟斑牙的具體機(jī)制尚不明確， 有推測(cè)認(rèn)為是由成釉細(xì)胞出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)導(dǎo)致的細(xì)胞蛋白表達(dá)錯(cuò)誤及細(xì)胞凋亡引起的[1]。研究表明在氟作用于成釉細(xì)胞的過程中，自噬水平也相應(yīng)上身，自噬是細(xì)胞在遭受外界刺激下自身啟動(dòng)的保護(hù)機(jī)制，現(xiàn)就氟誘導(dǎo)成釉細(xì)胞自噬上調(diào)的機(jī)制綜述如下。

1 氟斑牙

氟斑牙在世界各地均有發(fā)生，而我國氟斑牙患病者最為普及，寧夏回族自治區(qū)、內(nèi)蒙古自治區(qū)、陜西、山西、甘肅、河北、山東、貴州和福建等地都有慢性氟中毒區(qū)，貴州更是氟斑牙大省。

牙齒的釉質(zhì)發(fā)育礦化過程復(fù)雜且每一步都緊密相聯(lián)。成釉細(xì)胞在早期合成和分泌牙釉質(zhì)基質(zhì)，而在后期則會(huì)對(duì)這些基質(zhì)重吸收和降解以完成牙齒的礦化，是牙釉質(zhì)形成最重要的細(xì)胞。釉質(zhì)基質(zhì)在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被合成，在高爾基復(fù)合體中修飾加工，再通過Tome突內(nèi)的管網(wǎng)結(jié)構(gòu)分泌出去，分泌的釉質(zhì)基質(zhì)的量很大程度上影響將來發(fā)育完成的釉質(zhì)層的厚度。氟斑牙在形成初期蛋白分泌減少，釉質(zhì)基質(zhì)不足，后期蛋白水解酶分泌量不足，釉基質(zhì)蛋白含量過多，釉柱晶體的生長(zhǎng)受到干擾，無法形成正常釉質(zhì)結(jié)構(gòu)及厚度，也不能正常礦化，最終形成了氟斑牙。

2 自噬

自噬是細(xì)胞在遭受饑餓、氧化應(yīng)激、毒性物質(zhì)等情況下，與溶酶體結(jié)合后降解自身受損的細(xì)胞器或表達(dá)錯(cuò)誤的大分子蛋白物質(zhì)，再提供給細(xì)胞新蛋白質(zhì)及能量的過程，有循環(huán)再利用進(jìn)行細(xì)胞的物質(zhì)更新、維護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和物質(zhì)回收再利用幫助細(xì)胞生存等功能。自噬被首次發(fā)現(xiàn)是1962年Ashford和Porten在肝細(xì)胞中觀察到，隨后在酵母中發(fā)現(xiàn)了自噬的分子機(jī)制，近年來，哺乳動(dòng)物的自噬的相關(guān)基因及具體發(fā)生機(jī)制已經(jīng)日益清楚[2]，也了解到自噬在神經(jīng)退行性變、代謝性疾病、衰老及腫瘤等疾病發(fā)生發(fā)展中的重要作用[3]。自噬分為巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)及分子伴侶介導(dǎo)性自噬(chaperon-mediated autophagy,CMA)。①巨自噬：是在細(xì)胞收到外界刺激后如饑餓、缺氧、素等，出現(xiàn)來源不明的單層膜凹陷形成杯狀雙層膜結(jié)構(gòu)，被稱為自噬泡，其膜不斷延伸包裹受損細(xì)胞器、錯(cuò)誤蛋白質(zhì)或一些其他多余大分子物質(zhì)，最后逐漸封閉形成自噬小體，再通過微管運(yùn)輸?shù)饺苊阁w，自噬體外層膜與溶酶體膜融合，形成自噬溶酶體，之后內(nèi)膜被溶酶體溶解，其內(nèi)容物在溶酶體內(nèi)被降解。巨自噬相較于其他兩種自噬最為普遍，通常所說的自噬也就是巨自噬，對(duì)促進(jìn)細(xì)胞存活、維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和更新物質(zhì)提供能量等起著非常重要的作用。②微自噬：又稱小自噬，當(dāng)細(xì)胞遇到饑餓時(shí)，溶酶體局部凹陷包裹微體、衰老蛋白質(zhì)等，然后與溶酶體膜分離，單獨(dú)形成自噬小體，被運(yùn)送到溶酶體腔內(nèi)被溶解。微自噬在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生很少，主要功能就是在細(xì)胞遭受饑餓時(shí)通過自噬清除多余的大分子、降解衰老蛋白，為細(xì)胞提供新的物質(zhì)和能量，維持細(xì)胞生命狀態(tài)。③分子伴侶介導(dǎo)性自噬：1998年，由Cuervo和Dice首次提出分子伴侶介導(dǎo)性自噬的概念[4]。不同于巨自噬與微自噬，分子伴侶介導(dǎo)性自噬是錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)與分子伴侶結(jié)合，通過特異性識(shí)別溶酶體膜上的受體，使蛋白質(zhì)進(jìn)入溶酶體內(nèi)進(jìn)行降解。蛋白質(zhì)上的特定氨基酸序列與分子伴侶Hsc70特異性結(jié)合后，所形成的復(fù)合體與溶酶體上的受體Lamp2α(Lysosome-associated membrane protein 2α)結(jié)合，再由溶酶體內(nèi)的另外一種分子伴侶介導(dǎo)進(jìn)入溶酶體腔內(nèi)完成物質(zhì)的降解。

3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬

細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成、修飾、運(yùn)輸?shù)闹匾獔?chǎng)所,同時(shí)還是鈣的儲(chǔ)存庫，在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)平衡及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面具有重要作用。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，蛋白質(zhì)被折疊并修飾成最終具有功能活性的蛋白質(zhì)，該類蛋白質(zhì)會(huì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體，而沒有活性的蛋白質(zhì)則繼續(xù)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中完成折疊與修飾，或者進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解途徑(ER-associated degradation,ERAD)，通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解[5]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)平衡被破壞時(shí),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能將發(fā)生紊亂,產(chǎn)生大量未折疊蛋白或錯(cuò)誤蛋白并不能被有效降解，廢用物質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)大量的堆聚，并且產(chǎn)生鈣離子濃度異常，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

成釉細(xì)胞在過量氟化物刺激下產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[6]，蛋白分泌減少、釉質(zhì)基質(zhì)不足和釉質(zhì)結(jié)構(gòu)異常。并且成熟期成釉細(xì)胞分泌多種蛋白水解酶，如果此時(shí)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，可導(dǎo)致酶蛋白合成錯(cuò)誤，相關(guān)酶分泌量減少，釉基質(zhì)蛋白無法被水解而堆積，基質(zhì)含水量增多，釉柱晶體的生長(zhǎng)受到干擾，無法形成正常釉質(zhì)結(jié)構(gòu)及厚度，不能正常礦化[1]。而自噬作為一個(gè)高度保守的保護(hù)性機(jī)制，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激造成錯(cuò)誤蛋白潴留，細(xì)胞凋亡的時(shí)候，細(xì)胞上調(diào)自噬表達(dá)水平，啟動(dòng)保護(hù)機(jī)制。從酵母細(xì)胞到哺乳動(dòng)物，細(xì)胞中都存在自噬與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間的高度保守的相互調(diào)控[7]。Jacinto-Alema等[8]證明，過量的氟化鈉誘導(dǎo)成釉細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)。Sierant 等[9]研究表明，氟在誘導(dǎo)成釉細(xì)胞凋亡時(shí)都同時(shí)發(fā)現(xiàn)了氧化應(yīng)激反應(yīng)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的參與。雷雙等[10]研究顯示，當(dāng)對(duì)成釉細(xì)胞給予過量氟干預(yù)會(huì)造成細(xì)胞自噬水平上升。

3.1 未折疊蛋白反應(yīng)與自噬 細(xì)胞在出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí),為緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài),在其發(fā)生的早期可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與細(xì)胞核之間的信息傳遞通路,調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白的表達(dá),減少錯(cuò)誤折疊蛋白和未折疊蛋白積聚,以恢復(fù)其功能和穩(wěn)態(tài),這一過程稱為未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)[1]。在UPR的三條未折疊蛋白反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)通路均被證實(shí)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)與細(xì)胞自噬存在相關(guān)性。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulaing protein 78,GRP78)又稱為免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白能夠及時(shí)反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯(cuò)誤蛋白質(zhì)的堆積以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中分子的變化。在無內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)、肌醇需求酶1(inositol repuiring enzyme 1,IRE1)、轉(zhuǎn)錄激活因子6(activating transcription factor 6,ATF6)均分別與GRP78結(jié)合，無活性，當(dāng)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，GRP78與PERK、ATF6、IRE1發(fā)生解離而與更具有親和力的未折疊蛋白質(zhì)結(jié)合，釋放UPR傳感器,激活UPR，允許UPR信號(hào)跨過ER 膜激活和轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核[11]，從而啟動(dòng)對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。GRP78對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)行使正常功能和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)自噬發(fā)生非常重要，抑制GRP78后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)失去正常功能，雖然UPR、LC3仍然會(huì)被激活，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)誘導(dǎo)的自噬體無法形成[12]。張凱強(qiáng)等[13]發(fā)現(xiàn)對(duì)大鼠成釉細(xì)胞給以不同濃度的氟化物時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子 GPR-78、XBP-1、caspase-12 等的表達(dá)量隨著氟化物濃度的升高而增高。

IRE1活化后，其激酶活性域通過促細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ASK1)和分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)招募腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2 ,TRAF-2)，在TRAF-2的作用下激活c_Jun氨基末端激酶(JNK)途徑[14]，JNK迅速磷酸化Bcl2，使其與Beclin_1分離[15]，從而激活PI3K激酶途徑，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放與III型磷酸肌醇3激酶/泡膜蛋白34 ( PI3K/Vps34) 、Vps15 及 Atg14 組成 Beclin1 復(fù)合體促進(jìn)自噬柄成核、延伸形成自噬體[16]，進(jìn)而調(diào)節(jié)自噬下游。還有研究表明，IRE1可以通過增加X盒結(jié)合蛋白1基因(Xbp-1)的轉(zhuǎn)錄來誘導(dǎo)自噬，在扇貝毒素引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，IRE1-XBP1路徑提高BNIP3基因的轉(zhuǎn)錄，而BNIP3抑制RHEB的表達(dá)從而抑制雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路，產(chǎn)生自噬上調(diào)[17]。Kaori Kubota等[18]用高劑量氟刺激小鼠成釉細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、生長(zhǎng)停滯和DNA損傷、誘導(dǎo)蛋白(GADD153/CHOP,GADD45α)、結(jié)合蛋白(BiP)、GRP78、非分泌形式的碳酸酐酶VI(CA-VI)及Xbp-1在暴露于38ppm氟化物之后都被顯著誘導(dǎo)，且還發(fā)現(xiàn)成釉細(xì)胞對(duì)大劑量氟化物的毒性作用是由敏感并且活化的IRE1引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)所致。

其次，PERK活化會(huì)通過eIF2α_ATF4_CHOP信號(hào)通路來調(diào)節(jié)自噬。首先活化的PERK酸化eIF2α，促進(jìn)ATF4的表達(dá)升高，ATF4的升高使得CHOP增加了mTORC1抑制物TRB3的表達(dá)量，mTORC1被抑制從而上調(diào)自噬。PERK_eIF2α_ATF4通路還能上調(diào)ATG12，促進(jìn)LC3I向LC3II轉(zhuǎn)化，誘發(fā)細(xì)胞自噬。同時(shí)活化的PERK會(huì)阻斷NF_IkB的翻譯從而激活NF_IkB，進(jìn)而調(diào)節(jié)自噬[19]。有研究表明，在丙肝病毒感染產(chǎn)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，ATF6通過連接DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄物3鏈和LC3II基因點(diǎn)253-99基礎(chǔ)啟動(dòng)子區(qū)，使LC3II蛋白表達(dá)量增加，以上調(diào)自噬[20]。

3.2 Ca2+與自噬 馬林等[21]報(bào)道,隨著干預(yù)成釉細(xì)胞氟含量濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度也隨之增加。有研究證明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子濃度升高，會(huì)抑制mTOR通路，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，釋放腔內(nèi)的Ca2+到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外，以激活細(xì)胞內(nèi)自噬途徑中的一些激酶和蛋白酶信號(hào)[21-22]。通過使用RNA阻斷劑和抑制劑證實(shí)，Ca2+依賴的自噬發(fā)生時(shí)，可以通過激活鈣及鈣調(diào)蛋白依賴激酶-β(calmoldulin dependent kinase-β,CAMKK-β)介導(dǎo)的5’_磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMP_activated protein kinase,AMPK)活化，進(jìn)一步抑制mTOR，上調(diào)細(xì)胞自噬，有研究表明肝細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過AMPK_mTORC1通路誘發(fā)細(xì)胞自噬[23]。

死亡相關(guān)蛋白激酶和calpain蛋白酶這兩個(gè)鈣依賴酶在細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度的增加會(huì)被激活，參與自噬反應(yīng)的調(diào)節(jié)[24]。calpain-4基因敲除的小鼠MEFs，即使用各種自噬相關(guān)因子刺激也無法形成自噬小體，細(xì)胞內(nèi)堆積蛋白質(zhì)也沒有被明顯的降解。人類的骨肉瘤細(xì)胞缺失calpain-4后，在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到大量表達(dá)的LC3-I和LC3-II，但它們只是蓄積在核內(nèi)體小泡中，并不能被附著到細(xì)胞膜上或者已經(jīng)黏附的LC3不能夠成熟，以致不能激活自噬的發(fā)生。

4 展望

Min Wei等[25]證明了氟化物誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡以及自噬，加入RAPA自噬誘導(dǎo)劑后，細(xì)胞凋亡率隨之下降，表明誘導(dǎo)的自噬可保護(hù)MC3T3-E1細(xì)胞抵抗氟誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。細(xì)胞為適應(yīng)各種刺激壓力激活自噬為其主要保護(hù)途徑，大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，通過恢復(fù)自噬通量和抑制凋亡，許多毒物所致的腎損傷可以通過藥理學(xué)試劑如海藻糖、二甲雙胍和雷帕霉素及大黃素顯著緩解[26-29]。研究表明，鉛(II)促進(jìn)在RPT細(xì)胞自噬體的形成，并且增強(qiáng)自噬體的形成可以抑制細(xì)胞凋亡，從而減輕鉛對(duì)RPT細(xì)胞的毒性傷害[30-32]；自噬能減弱缺血/再灌注損傷后的神經(jīng)元細(xì)胞損傷[33]和鎘誘導(dǎo)的近端小管損傷[29]，營(yíng)養(yǎng)缺乏或生長(zhǎng)因子不足誘導(dǎo)細(xì)胞中的自噬能通過抑制細(xì)胞凋亡幫助細(xì)胞存活等。自噬也保護(hù)細(xì)胞免受各種其他凋亡刺激[33]。

過量氟對(duì)成釉細(xì)胞的具體損害機(jī)制雖然還未十分明確，但目前認(rèn)為主要跟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及Ca2+通道有關(guān)，產(chǎn)生一系列反應(yīng)導(dǎo)致釉質(zhì)礦化不全，誘導(dǎo)自噬水平上調(diào)，自噬有可能對(duì)成釉細(xì)胞產(chǎn)生一定的保護(hù)作用，但自噬的保護(hù)反應(yīng)的具體機(jī)制不明確，最終為何會(huì)產(chǎn)生氟斑牙，是否因?yàn)樽允杀磉_(dá)水平無法代償長(zhǎng)期的過量氟攝入產(chǎn)生的損害？尚需更多研究探究與證實(shí)，相信在不久的將來一定可以明確具體機(jī)制并找到防治氟中毒的有效方法。